Le globe oculaire humain

La cornée

La cornée humaine, structure transparente la plus antérieure du globe oculaire, agit comme une barrière frontale en protégeant les structures internes de l’oeil contre l’environnement extérieur (agents infectieux ou autres) ; elle est la porte d’entrée de la lumière et, avec le cristallin, assure la réfraction de la lumière jusqu’aux cellules rétiniennes. La cornée est un tissu avasculaire qui reçoit son apport nutritif (notamment, oxygène et glucose) du film lacrymal, de l’humeur aqueuse et de la vascularisation du limbe (surtout pour la périphérie de la cornée) (Klyce et Beuerman, 1998 ; Ehlers et Hjortdal, 2005 ; Nishida et Saika, 2011). Elle est aussi très riche en terminaisons nerveuses (300 à 600 fois plus que la peau), représentant un des tissus les plus sensibles de l’organisme (Beuermann et Pedroza, 1996 ; Muller et al., 2003 ; Ehlers et Hjortdal, 2005). Son épaisseur central est d’environ 544 ± 34 μm (440-650 μm) et augmente vers la périphérie jusqu’à atteindre 700 μm au niveau du limbe (Hogan et Alvarado, 1971 ; Klyce et Beuermaun, 1998 ; Nishida et Saika, 2011). La cornée procure 75% du pouvoir de réfraction du système oculaire. La transparence est une caractéristique importante de la cornée indispensable à son rôle optique. Plusieurs facteurs contribuent à cette transparence cornéenne: la régularité et l’épaisseur uniforme de l’épithélium en association avec l’intégrité du film lacrymal, l’architecture régulière du collagène (lamelles) et la taille des fibrilles, la faible densité des kératocytes avec leur production de protéines cristallines solubles et la présence des protéoglycanes dans le stroma cornéen, la régulation de l’hydratation de la cornée par l’endothélium et l’absence de vascularisation (Jester et al., 1999a ; Kinoshita et al., 2001 ; Kurpakus-Wheater et al., 2001 ; Meek et al., 2003 ; Fischbarg et al., 2005 ; Edelhauser, 2006 ; Jester, 2008 ; Hassell et Birk, 2010).

Le stroma cornéen et la membrane de Bowman

Le stroma cornéen représente 90% (500 μm) de l’épaisseur cornéenne (Hogan et Alvarado, 1971 ; Dawson et al., 2011). Il est constitué à 15% de fibrilles de collagènes organisées en lamelles (principalement le collagène de type I (58%), mais contient aussi les collagènes de types III, V (15%), VI (24%), XII et XIV) (Newsome et al., 1982 ; Meek et Fullwood, 2001 ; Robert et al., 2001 ; Dawson et al., 2011), entre lesquelles on retrouve également des molécules d’eau (constituant 78% de la masse du stroma), des protéoglycanes de type dermatane/chondroïtine sulfate (décorine) et de type kératane sulfate (lumican, mimecane, et kératocane ; 1% de la masse du stroma) et des kératocytes (1% de la masse du stroma) (Michelacci, 2003 ; Ehlers et Hjortdal, 2005 ; Dawson et al., 2011). La fonction principale du stroma est d’être un support structural transparent permettant une réfraction correcte de la lumière pour assurer une bonne vision. Pour répondre à cette fonction, l’organisation tridimensionnelle des fibrilles de collagènes du stroma est particulière et importante (Klyce et Beuerman, 1998 ; Dawson et al., 2011).

Dans le stroma cornéen, les molécules de collagène (types I et V) s’associent pour former des fibrilles de collagène. Les fibrilles de collagène sont organisées en lamelles superposées et entrelacées, parallèles à la surface cornéenne et d’une épaisseur se situant entre 0.2 à 2.5 μm et une largeur entre 0.5 à 250 μm (Komai et Ushiki, 1991 ; Radner et al., 1998 ; Birk, 2001 ; Dawson et al., 2011). À l’intérieur d’une lamelle du stroma de la cornée centrale, les fibrilles de collagène sont parallèles entre-elles, possèdent un diamètre uniforme (25-35 nm) (Komai et Ushiki, 1991 ; Meek and Leonard, 1993) et sont équidistantes avec un espace interfibrillaire constant (~60 nm) (Meek and Leonard, 1993 ; Klyce et Beuerman, 1998). Le stroma cornéen est composé d’environ 250 à 300 lamelles (Hamada et al., 1972 ; Bergmanson et al., 2005) et chaque lamelle stromale forme des angles divers se situant entre 0 et 90 degrés par rapport à la lamelle adjacente. Toutefois, 58% des lamelles du stroma sont orientées, une par rapport à la suivante, d’un angle se situant entre 31º et 60º (Radner et al., 1998 ; Meek et Fullwood, 2001) (Figure. 1.6). Cette configuration typique et spécifique du stroma cornéen est responsable en grande partie de la transparence de la cornée. Les fibrilles de collagènes types I et V sont entourées de protéoglycanes et d’autres types de collagènes (VI, XII et XIV) contribuant à maintenir un espacement régulier entre les fibrilles de collagène (Scott, 1991 ; Hirsch et al., 2001 ; Dawson et al., 2011). Les kératocytes sont des cellules aplaties du stroma, à très longs prolongements possédant des jonctions communicantes (‘gap junctions’) avec les cellules adjacentes. Les kératocytes sont situées entre les lamelles et s’étendent parallèlement à celles-ci.

Ces cellules sont peu nombreuses dans la cornée native et affichent un cycle cellulaire très lent (Poole et al., 1993 ; Hahnel et al., 2000). Par contre, suite à une lésion au niveau du stroma, les kératocytes se transforment en fibroblastes actifs responsables de la synthèse des composantes de la matrice extracellulaire (MEC). Ils sont aussi responsables de la production des enzymes de dégradation de la MEC, telles les métalloprotéinases matricielles (MMPs) qui participent ainsi au remodelage de la matrice extracellulaire durant la guérison de ce tissu (Fini, 1999 ; Fini et Stramer, 2005 ; West-Mays et Dwivedi, 2006). Les fibroblastes peuvent se différencier également en myofibroblastes qui sont nécessaires pour permettre la contraction de la plaie et la production de plusieurs facteurs de croissance impliqués dans les différents processus de guérison des plaies cornéennes (Fini, 1999 ; Jester et al., 1999b ; Wilson et al., 2001 ; West-Mays et Dwivedi, 2006).

La membrane de Bowman, aussi appelée lame limitante antérieure, est une région de 8 à 12 μm d’épaisseur séparant la membrane basale de l’épithélium du stroma cornéen. La membrane de Bowman n’est pas une membrane basale typique mais plutôt une couche acellulaire dense formée de nombreuses fibrilles de collagène de petits diamètres (20-25 nm) intriquées, sans aucune orientation et soutenant le stroma (Hogan et Alvarado, 1971 ; Komai et Ushiki, 1991 ; Beuerman et Pedroza, 1996). Elle est composée principalement des collagènes de types I (principal composant), III, V, VI, XII, mais compte également du collagène de type IV et VII provenant de la membrane basale (Jacobsen et al., 1984 ; Nakayasu et al., 1986 ; Marshall et al., 1991a ; Marshall et al., 1991b).

L’endothélium cornéen et la membrane de Descemet

L’endothélium cornéen est la couche fragile tapissant la face postérieure de la cornée. Cette couche, d’une épaisseur d’environ 5 μm, est directement en contact avec l’humeur aqueuse. Elle est composée d’une seule couche de cellules hexagonales et aplaties formant une mosaïque relativement régulière et uniforme (Hogan et Alvarado, 1971 ; Beuerman et Pedroza, 1996 ; Dawson et al., 2011). Les cellules formant cette couche endothéliale sont munies de plusieurs invaginations et jonctions communicantes latérales (jonctions ‘gap’) avec les cellules voisines ainsi que de jonctions serrées incomplètes et discontinues (‘leaky tight junctions’ ou ‘macula occludens’) au niveau apical permettant la formation d’une barrière perméable à la diffusion de l’eau contenue dans l’humeur aqueuse vers le stroma (Hirsch et al., 1977 ; Ottersen et Vegge, 1977 ; Fischbarg, 2005 ; Dawson et al., 2011). La fonction principale de l’endothélium est donc de contrôler l’hydratation du stroma grâce au transport actif par une pompe Na+/K+ ATPase expulsant les ions sodium (Na+) et bicarbonates (HCO3-) dans l’humeur aqueuse et provoquant un gradient osmotique qui assure la sortie de l’eau du stroma nécessaire au maintien de la transparence de la cornée (Fischbarg, 2003 ; Bonanno, 2003 ; Fischbarg, 2005 ; Bonanno, 2012).

Ces cellules endothéliales ne possèdent pas la capacité de se régénérer (Joyce, 2003 ; Joyce, 2005) ce qui fait que leur densité cellulaire va progressivement diminuer avec l’âge au profit d’une augmentation du diamètre des cellules, soit de 5000 cellules/mm2 à la naissance vers 2500 cellules/mm2 chez l’adulte (Yee et al., 1985 ; Abib et Barreto, 2001 ; Dawson et al., 2011). La membrane de Descemet, aussi appelée lame limitante postérieure, est une membrane basale de 3 μm à la naissance qui s’épaissit avec l’âge jusqu’à environ 10 μm d’épaisseur chez l’adulte et qui est sécrétée par les cellules endothéliales, assurant ainsi son maintien structural. La portion antérieure en contact avec le stroma est fibreuse tandis que la portion postérieure en contact avec l’endothélium est plus homogène (Holgan et Alvarado, 1971 ; Johnson et al., 1982 ; Beuerman et Pedroza, 1996). La membrane de Descemet est principalement constituée de collagènes de types IV et VIII mais contient aussi du collagène de type III, V, VII, (Sawada et al., 1990 ; Marshall et al., 1991a ; Marshall et al., 1991b ; Tamura et al., 1991) ainsi que de la fibronectine et des laminines (Marshall et al., 1991a ; Tervo et al., 1986).

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Table des matières

RÉSUMÉ
ABSTRACT
Table des matières
Liste des tableaux
Liste des figures
Liste des abréviations
Remerciements
Avant-propos
Chapitre I : Revue de la littérature
1.Introduction
1.1. Le globe oculaire humain
1.2. La cornée
1.2.1. L’épithélium cornéen
1.2.2. Le stroma cornéen et la membrane de Bowman
1.2.3. L’endothélium cornéen et la membrane de Descemet
1.3. Maladies de la cornée : Syndromes de déficience en cellules souches limbiques
1.3.1. Les traitements
1.3.1.1. Greffes de limbe et de cornée
1.3.1.2. Greffe d’épithélium cornéen cultivé in vitro
1.3.1.3. Cornées reconstruites in vitro par génie tissulaire
1.4. Cicatrisation cornéenne
1.4.1. Les étapes de la cicatrisation de l’épithélium cornéen
1.4.1.1. Phase latente
1.4.1.2. Migration cellulaire
1.4.1.3. Prolifération et différenciation cellulaire
1.4.1.4. Adhésion cellulaire
1.4.2. Cicatrisation du stroma cornéen
1.4.3. Cicatrisation de l’endothélium cornéen
1.4.4. Modèles pour l’étude de la guérison des plaies cornéenne
1.4.5. Facteurs modulant la cicatrisation de la cornée
1.4.5.1. Les facteurs de croissance, les cytokines et les facteurs neuraux
1.4.5.2. Les sérine-protéases et les métalloprotéinases matricielles (MMPs)
1.4.5.2.1. Les sérine-protéases
1.4.5.2.2. Les métalloprotéinases matricielles (MMPs)
1.4.5.2.2.1. Les membres de la famille des métalloprotéinases matricielles et leurs substrats
1.4.5.2.2.2. La régulation des métalloprotéinases
1.4.5.2.2.3. Les métalloprotéinases et la guérison des plaies cornéennes
1.4.5.2.2.3.1. MMP‐1
1.4.5.2.2.3.2. MMP‐3
1.4.5.2.2.3.3. MMP‐9
1.4.5.2.2.3.4. MMP‐10
1.4.5.2.2.3.5. MMP‐12
1.4.5.3. Les protéines de la matrice extracellulaire (MEC)
1.4.5.3.1. Les Laminines (LM)
1.4.5.3.2. Les collagènes
1.4.5.3.3. La Ténascine (TN)
1.4.5.3.4. La Fibronectine (FN)
1.4.5.3.5. Remodelage de la MEC durant la cicatrisation cornéenne
1.4.5.4. Les Intégrines
1.4.5.4.1. Généralités, structure et ligands des intégrines
1.4.5.4.2. Les fonctions des intégrines
1.4.5.4.3. Les voies de signalisation intracellulaires modulées par les intégrines
1.4.5.4.4. Modification de l’expression des intégrines durant la cicatrisation cornéenne
1.5. Intégrine α5β1
1.5.1. Généralités
1.5.2. Les fonctions de l’intégrine α5β1
1.5.3. Le gène de la sous-unité d’intégrine α5
1.5.4. Le gène de la sous-unité d’intégrine β1
1.5.5. La régulation de l’expression de l’intégrine α5β1
1.5.6. Les facteurs de transcription importants dans la modulation de la transcription du gène ITGA5 .
1.5.6.1. Le facteur de transcription Sp1
1.5.6.2. Le facteur de transcription AP-1
1.5.6.3. Les facteurs de transcription NFI
1.6. Problématique et Objectifs de recherche
1.6.1. Déterminer l’influence des composantes combinées de la matrice extracellulaire sur la sous-unité α5 dans les cellules épithéliales de cornée
1.6.2. Évaluer l’influence des matrices simples de collagènes (CI ou CIV) sur l’expression du gène α5 dans les cellules épithéliales de cornée
1.6.3. Étudier l’influence régulatrice du segment d’ADN conservé (50 et 300 nucléotides) entre les gènes α3, α5, α9 et αv sur la transcription du gène α5
1.6.4. Étudier l’influence des composantes de la MEC sur l’expression d’autres gènes susceptibles de participer à la cicatrisation cornéenne dans les cellules épithéliales de cornée
Chapitre II Modulation de l’expression du gène de la sous-unité d’intégrine α5 dans les cellules épithéliales de cornée par des matrices extracellulaires humaines reconstruites
2.1. Résumé
2.2. Title Page
2.3. Abstract
2.4. Introduction
2.5. Materials and Methods
2.5.1. Cell culture and matrix production
2.5.2. Plasmids and oligonucleotides
2.5.3. Mass spectrometry
2.5.4. Transfections and chloramphenicol acetyltransferase (CAT) assays
2.5.5. Nuclear extracts and electrophoretic mobility shift assays (EMSA)
2.5.6. Western Blots
2.5.7. Gene expression profiling
2.5.8. Quantitative PCR (qRT-PCR)
2.5.9. Indirect immunofluorescence
2.5.10. Statistical analyses
2.6. Results
2.6.1. Analysis of the extracellular matrix secreted in vitro by human corneal fibroblasts
2.6.2. Influence of the reconstructed extracellular matrix biomaterial on the activity of the human α5 integrin gene promoter
2.6.3. Influence of the reconstructed stromal biomaterial on the expression of the transcription factors that regulate expression of the α5 gene
2.7. Discussion
2.8. Conclusion
2.9. Acknowledgments
2.10. References
2.11. Tables
2.12. Figure legends
2.13. Supplementary data
Chapitre III Impact fonctionnel des collagènes sur l’activité transcriptionnelle dirigée par le promoteur du gène de la sousunité d’intégrine α5 dans les cellules épithéliales de la cornée
3.1. Résumé
3.2. Title Page
3.3. Abstract
3.4. Introduction
3.5. Methods
3.5.1. Cell culture and matrix production
3.5.2. Indirect immunofluorescence
3.5.3. Plasmids and oligonucleotides
3.5.4. Transfections and chloramphenicol acetyltransferase (CAT) assays
3.5.5. Nuclear extracts and electrophoretic mobility shift assays (EMSA)
3.5.6. Western Blots
3.5.7. Gene expression profiling
3.5.8. Semi-quantitative RT-PCR assays
3.5.9. Quantitative PCR (qRT-PCR)
3.5.10. Statistical analyses
3.6. Results
3.6.1. Collagens exert different regulatory influences on the human α5 gene promoter in RCECs
3.6.2. CIV alters both expression and DNA binding of the transcription factors that regulate expression of the α5 gene
3.6.3. The influence of collagens is different in human corneal epithelial cells
3.6.4. The genes signature of human corneal epithelial cells is influenced by collagens
3.6.5. Expression of the collagen binding integrins changes in HCECs grown on CI and CIV
3.7. Discussion
3.8. Acknowledgments
3.9. References
3.10. Figure legends
3.11. Supplementary data
CHAPITRE IV Modulation de l’expression du gène de la sous-unité α5 de l’intégrine α5β1 par l’élément conservé identifié en amont des promoteurs des gènes α3, α5, α9 et αv
4.1. Introduction
4.2. Matériel et Méthodes
4.2.1. Culture cellulaire
4.2.2. Identification des séquences conservés et des facteurs de transcription potentiels
4.2.3. Construction des plasmides et oligonucléotides
4.2.4. Transfections transitoires
4.2.5. Extraits nucléaires et Retards sur gel de polyacrylamide (EMSA)
4.2.6. Profilage d’expression génique (Agilent)
4.3. Résultats
4.3.1. Influence de l’élément conservé en amont des gènes des sous-unités d’intégrines α3, α5, α9 et αv sur l’activité du promoteur du gène α5
4.3.2. Facteurs de transcription impliqués dans la modulation de l’expression du gène α5 par l’élément conservé en amont des gènes de sous-unités d’intégrines α3, α5, α9 et αv
4.4. Discussion
CHAPITRE V Modulation de l’expression génique par les composantes de la matrice extracellulaire
5.1. Introduction
5.2. Matériel et Méthodes
5.3. Résultats
5.3.1. Influence des matrices extracellulaires reconstruites et des matrices simples de collagènes sur l’expression de gènes autres que les gènes des intégrines dans les CECHs
5.3.2. Influence des matrices extracellulaires reconstruites et des matrices simples de collagènes sur l’expression des gènes MMPs dans les CECHs
5.4. Discussion
Chapitre VI : Conclusions et Perspectives de recherche
Conclusions
6.1. Modulation de l’expression du gène de la sous-unité d’intégrine α5 par des matrices extracellulaires humaines reconstruites (Chapitre II)
6.2. Impacts fonctionnels des matrices simples de collagènes sur l’expression du gène de la sous-unité d’intégrine α5 (Chapitre III)
6.3. Modulation de la transcription du gène α5 par la région distante conservée en amont des gènes α3, α5, α9 et αv (Chapitre IV)
6.4. Modulation de l’expression des autres gènes que les intégrines par les composantes de la matrice extracellulaire (Chapitre V)
6.5. Élaboration d’un modèle d’action de la matrice extracellulaire sur l’expression du gène α5
6.6. Perspectives de recherche
Bibliographie
ANNEXE 1 Influence de matrices extracelluaires humaines reconstruites sur l’expression du gène α5 de l’intégrine α5β1 dans les cellules épithéliales de cornée de lapin.
ANNEXE 2 Modulation de l’expression du gène α5 de l’intégrine α5β1 et des autres gènes par des matrices extracelluaires humaines reconstruites dans les cellules épithéliales de cornée humaine à sous-confluence.
ANNEXE 3 Les séquences des éléments conservés en amont des promoteurs des gènes α3, α5, α9, αv et leurs sites de liaisons potentiels pour certains facteurs de transcription.