Le genre Enterococcus

Le genre Enterococcus 

Historique

Les entérocoques ont été décrits pour la première fois en 1899 par deux équipes en parallèle. L’une de ces études fait état d’une endocardite chez un jeune patient de 37 ans causée par une nouvelle bactérie que MacCallum et Hastings nommeront Micrococcus zymogenes (22). La même année, Thiercelin caractérise une nouvelle bactérie retrouvée dans les fèces humaines qu’il décrit comme des diplocoques parfois organisés en courtes chainettes (23). Il propose le nom d’entérocoque pour rappeler à la fois leur morphologie et leur habitat naturel mais ce nom ne sera retenu que près d’un siècle plus tard. On sait aujourd’hui que ces deux études font vraisemblablement référence à Enterococcus faecalis. Les entérocoques seront néanmoins longtemps associés au genre Streptococcus où ils seront répertoriés comme « Streptocoques du groupe D » ou encore « Streptocoques de Lancefield ». Il faudra attendre 1984 pour que les deux espèces Streptococcus faecalis et Streptococcus faecium soient phylogénétiquement attribuées au genre Enterococcus devenant par la même les deux premiers représentants connus de ce genre bactérien (24). La connaissance du genre Enterococcus s’étoffe avec le temps et le nombre d’espèces associées a augmenté avec plus de 30 espèces d’entérocoques différentes décrites en 2012 (25). Actuellement, 57 espèces différentes d’entérocoques ont été décrites d’après le site « List of prokaryotic names with standing in nomenclature » (LPSN) (26–28).

Caractéristiques des entérocoques 

Caractéristiques générales

Les entérocoques sont phylogénétiquement classés dans le phylum des firmicutes. Ce sont des bactéries positives à la coloration de Gram qui présentent un faible pourcentage de bases GC dans leur génome. Les entérocoques sont des cellules en forme de coques souvent associés par paires et parfois en courtes chaînettes, non sporulantes et mésophiles, leur température optimale de développement se situe aux environs de 35°C (25). Ces bactéries sont capables de supporter des conditions défavorables comme de fortes concentrations en NaCl, la présence de sels biliaires, l’absence prolongée de nutriments ou encore la dessiccation. Ces microorganismes présentent également de nombreuses résistances aux antibiotiques, qu’elles soient intrinsèques ou acquises (29).

Les entérocoques peuvent être retrouvés de manière ubiquitaire dans la nature mais le plus souvent associés aux animaux (35). E. faecalis et E. faecium sont les espèces les plus documentées à ce jour. Elles sont décrites comme étant les espèces d’entérocoques les plus abondantes dans les fèces humaines (25). Ces deux espèces représenteraient typiquement environ 0,1 % de la flore microbienne chez l’Homme en bonne santé (36,37) où elles occupent alors une place de microorganismes commensaux. Certaines souches d’E. faecalis ont par exemple été décrites comme capables d’assimiler le cholestérol ou encore de produire des acides gras à longues et courtes chaines (LCFA et SCFA respectivement) reconnus comme bénéfiques pour la santé humaine (38–41).

Malgré leur caractère commensal pour l’Homme, les entérocoques sont fréquemment décrits comme des bactéries responsables d’infections nosocomiales associées aux soins ou acquises en milieu hospitalier (42). Certaines souches peuvent en effet agir comme des germes opportunistes et être responsables de maladies graves comme des endocardites principalement chez des personnes immunodéprimées ou affaiblies (43). D’après un rapport de juillet 2018 de l’Institut National de Veille Sanitaire (InVS) basé sur une surveillance épidémiologique couvrant la période de 2001 à 2017, les entérocoques représentent en France la deuxième cause bactérienne la plus enregistrée dans le cadre de signalement externe des infections nosocomiales (SIN) avec 9,4% derrière l’entérobactérie Klebsiella pneumoniae .

Cette présence récurrente en milieu hospitalier peut s’expliquer, au moins en partie, par leurs fortes tolérances aux conditions de leur environnement et leurs résistances aux antibiotiques énoncées précédemment. E. faecium a été classé par l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) comme un agent pathogène de priorité élevée pour la recherche et le développement de nouvelles méthodes de lutte en raison de ses nombreuses résistances aux antibiotiques, notamment à la vancomycine (45).

En plus de leurs fortes capacités d’adaptation et de résistance, les entérocoques présentent une virulence intrinsèque dont plusieurs facteurs ont été identifiés particulièrement chez E. faecalis  (46,47). La première étape du processus d’infection est l’adhésion des cellules bactériennes à celles de l’hôte, pour cela E. faecalis possède des protéines de surface regroupées sous le nom d’adhésines. On retrouve parmi elles un groupe de protéines nommées « substance d’agrégation » ou AG. Ces protéines sont ancrées dans la paroi par un motif LPxTG et possèdent deux motifs RGD (Arg-Gly-Asp). Ces protéines permettent l’agrégation bactérienne indispensable à la conjugaison de plasmides. Cette agrégation est le plus souvent stimulée en réponse à des phéromones bactériennes. L’AG peut également favoriser l’adhésion de la bactérie à la matrice extra cellulaire ou directement aux cellules de l’hôte. La protéine Ace représente un autre exemple de protéine de surface permettant une adhésion efficace à la matrice extracellulaire de l’hôte, la classant ainsi dans les constituants MSCRAMM (Microbial Surface Components Recognizing Adhesive Matrix Molecules) (48). Un autre acteur, la protéine EfaA, constituant d’un transporteur ABC a également été relié à la virulence d’E. faecalis même si la nocivité atténuée d’un mutant pour cette protéine pourrait s’expliquer par une perte de fitness plutôt que par une perte de virulence directe. D’autres protéines comme les pili EbpABC ou la protéine Esp joueraient quant à elles un rôle dans la formation de biofilm qui est un facteur important dans le processus infectieux et pourrait avoir un rôle dans l’adhésion aux cellules de l’hôte. Le biofilm représente chez les bactéries une organisation communautaire favorisant la mise en place de communication intercellulaire via le système de Quorum Sensing (QS). Ce QS régule via le système Fsr des gènes également impliqués dans la virulence d’E. faecalis comme par exemple les protéases sécrétées GelE et SprE qui possèdent une activité endopeptidase à large spectre. Elles seraient impliquées dans la dégradation des protéines de l’hôte, l’autolyse, le renouvellement des protéines de surface, le relargage d’ADN extracellulaire voire la translocation à travers des épithéliums de l’hôte (46). En plus de ces protéases sécrétées, certaines souches d’E. faecalis sont capables de sécréter une bactériocine de la famille des lantibiotiques appelée cytolysine. Cette dernière confère un avantage en limitant la compétition avec d’autres espèces procaryotes mais peut également cibler des cellules eucaryotes et serait potentiellement capable d’affecter les cellules du système immunitaire inné de l’hôte (46). Une autre stratégie pour éviter les défenses immunitaires de l’hôte est la synthèse d’une capsule polysaccharidique via les gènes cpsC-K ( 48) qui confère également un avantage en contexte infectieux.

Table des matières

Introduction
I. Le genre Enterococcus
A. Historique
B. Caractéristiques des entérocoques
C. Les souches de référence : V583 et OG1RF
II. L’import de substrats
A. Les facilitateurs
B. Les transporteurs actifs primaires : les transporteurs ABC
C. Les transporteurs actifs secondaires
D. Les transports par translocation de groupe : les Systèmes PhosphoTransférases PEP dépendent (PTS)
III. Les régulateurs transcriptionnels
A. Les régulateurs transcriptionnels de la famille LacI/GalR
B. Les régulateurs transcriptionnels de la famille RpiR
IV. Le métabolisme du maltose et des maltodextrines chez différents organismes modèles
A. Escherichia coli
B. Streptococci
C. Enterococcus faecalis
V. Le métabolisme du gentiobiose et autres ȕ-glycosides chez différents organismes modèles
A. Escherichia coli
B. Streptococcus pneumoniae
C. Enterococcus faecalis
Matériel et méthode
I. Matériel biologique
A. Conditions de culture et souches bactériennes
B. Plasmides
II. Cellules compétentes et transformations par électroporation
A. Escherichia coli
B. Enterococcus faecalis
III. Biologie moléculaire
A. Réactions de polymérisation en chaîne (PCR)
B. Electrophorèse en gel d’agarose
C. Restriction et ligation de fragments d’ADN
D. Purification des fragments d’ADN
E. Extraction de plasmides d’E.coli
F. Extraction d’ADN génomique
G. Extraction d’ARN totaux
H. Réactions de transcription inverse
I. RACE-PCR
J. Fusion transcriptionnelle
K. Empreintes à la DNAse I
L. Séquençage du transcriptome entier (RNA-seq)
IV. Constructions de mutants par génie génétique et complémentations
A. Mutants par allèles mutés
B. Mutant de délétion
C. Complémentations des mutants
V. Méthodes biochimiques
A. Surexpression et purification de protéines présentant une étiquette poly-histidines
B. Phosphorylation de HPr in vitro
C. SDS-PAGE
D. Native-PAGE
E. Retard sur gel
F. Microscale Thermophoresis (MST)
G. Chromatographie sur couche mince (CCM)
H. Dosage des sucres dans le surnageant par HPLC
I. Thermal Shift Assays (TSA)
Résultats
Conclusion

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