Le domaine THAP, un nouveau domaine de liaison à l’ADN

Le domaine THAP, un nouveau domaine de liaison à l’ADN 

Identification de la protéine THAP1 

La protéine humaine THAP1 a été identifiée par Myriam Roussigne et ses collaborateurs (Roussigne et al., 2003a). Elle est associée à des complexes multiprotéiques nucléaires, les PML-NBS (Promyelocytic leukemia Nuclear Bodies) impliqués dans la régulation de nombreux processus vitaux tels que la transcription, la croissance cellulaire, l’apoptose et la défense antivirale. Les premiers travaux réalisés montrent que la surexpression de GFP-THAP1 renforce le processus apoptotique des cellules en apoptose sous l’effet du facteur de nécrose tumorale TNFα ou du sevrage en sérum, soulignant le caractère pro-apoptotique de THAP1 (Roussigne et al., 2003a). C’est de là que provient le nom de cette protéine : THanatos Associated Protein 1, Thanatos étant le dieu grec de la mort. Dans le cadre de cette étude, le facteur pro-apoptotique Par4 (Prostate apoptosis response 4) a été identifié comme partenaire protéique de THAP1 par des expériences de double hybride. De plus il a été montré que THAP1 interagit et colocalise avec Par4 au niveau des PML-NBs dans les cellules primaires endothéliales ou les fibroblastes. Ces résultats mettent en évidence un lien entre la protéine THAP1, la protéine proapototique Par4 et les corps nucléaires PML-NBs (Roussigne et al., 2003a).

Le domaine THAP définit une nouvelle famille de protéines 

La protéine THAP1 humaine est composée de 213 acides aminés. Des analyses de séquence ont permis de mettre en évidence que la région N-terminale de THAP1 présente de l’homologie avec de nombreuses protéines non caractérisées et a ainsi permis de définir un nouveau domaine protéique d’environ 90 acides aminés conservé dans ces protéines, le domaine THAP (Roussigne et al., 2003b). Le domaine THAP est restreint au règne animal, il a été recensé dans plus de 100 protéines chez différents organismes animaux vertébrés et invertébrés, mais il n’est pas retrouvé dans les plantes, les levures, les champignons et les bactéries (Clouaire et al., 2005; Roussigne et al., 2003b). Le domaine THAP n’est pas requis pour l’interaction avec Par4 ni pour la colocalisation aux PML-NBs, mais il est essentiel à l’activité pro-apoptotique identifiée pour la protéine THAP1 humaine (Roussigne et al., 2003a). Chez l’homme, le domaine THAP définit une nouvelle famille de protéines, les protéines THAP. Cette famille comprend 12 membres, THAP0 à THAP11 .

La protéine THAP0 était déjà référencée sous le nom de DAP4 (Death Associated Protein 4). Elle est impliquée dans la régulation de l’apoptose (Deiss et al., 1995), notamment par son interaction avec la sérine/thréonine kinase MST1 (Lin et al., 2002). La co-expression de THAP0 et MST1 permet d’augmenter l’apoptose induite par MST1. MST1 est en effet impliquée dans la condensation de la chromatine caractéristique de l’apoptose par phosphorylation de l’histone H2B (Cheung et al., 2003). Aucune étude n’a pour l’instant mis en évidence le rôle du domaine THAP dans l’effet pro-apoptotique de THAP0. Des données fonctionnelles supplémentaires sont aussi disponibles pour THAP1 qui, outre ses propriétés pro-apoptotiques en surexpression, est impliqué dans le contrôle  de la prolifération cellulaire et la régulation du cycle cellulaire (Cayrol et al., 2007) que nous développerons ci-après. Enfin, des données fonctionnelles sont également disponibles pour THAP7. Ce facteur est impliqué dans la régulation transcriptionnelle et interagit avec des enzymes de modification de la chromatine (Macfarlan et al., 2005; Macfarlan et al., 2006). THAP7 réprime la transcription par recrutement de l’histone désacétylase HDAC3 et le corépresseur du récepteur nucléaire aux hormones NCoR (Macfarlan et al., 2005). De plus THAP7 interagit avec TAF-Iβ et inhibe l’acétylation des histones H3 et H4 pour réprimer la transcription (Macfarlan et al., 2006).

L’étude de la famille des protéines THAP chez C. elegans est particulièrement riche en informations sur le rôle biologique de ces protéines. On retrouve ainsi des régulateurs du cycle cellulaire Lin-15B et Lin-36 qui sont des inhibiteurs de la transition de phase G1/S du cycle cellulaire (Boxem and van den Heuvel, 2002) ainsi qu’une protéine impliquée dans la modification de la chromatine, HIM-17 (Reddy and Villeneuve, 2004). L’ensemble de ces données semble indiquer que les protéines THAP, à la fois chez l’homme et dans les organismes modèles animaux, sont des régulateurs de la prolifération cellulaire et du cycle cellulaire et qu’elles agissent au niveau de la régulation de la chromatine. L’analyse des alignements de ces différentes séquences permet de caractériser le domaine THAP. Il présente une signature C2CH de consensus C-X2-4-C-X35-50-C-X2- H, quatre autres résidus strictement conservés P26, W36, F58, P78 (numérotation  relative à THAP1) et une boîte AVPTIF en position C-terminale (Roussigne et al., 2003b) .

De façon intéressante, le domaine THAP présente des similarités de séquence avec le domaine de liaison à l’ADN de l’élément P de la transposase (Lee et al., 1998; Roussigne et al., 2003b). L’homologie comprend la taille, la localisation N-terminale et la conservation des résidus constituant la signature du domaine THAP. Ces données ont permis alors de suggérer que les protéines THAP définissent une nouvelle famille de protéines de liaison à l’ADN jusqu’alors non caractérisée comprenant une signature C2CH, motif de coordination au zinc. Il n’est pas si surprenant d’observer le partage d’un domaine de liaison à l’ADN entre des protéines cellulaires et la transposase d’un élément génétique mobile. Par exemple, le domaine de liaison BED, un domaine à doigt de zinc, est présent à la fois dans les protéines cellulaires BEAF et DREF et dans le domaine de liaison à l’ADN des transposases de la famille hAT (Aravind, 2000).

Le domaine THAP de THAP1, nouveau domaine de liaison à l’ADN 

La liaison du domaine THAP au zinc ainsi que le rôle du domaine THAP de THAP1 en tant que motif d’interaction avec l’ADN ont été démontrés dans l’équipe de biologie vasculaire (Clouaire et al., 2005). Des expériences de type SELEX (Selective Evolution of Ligands by EXponential enrichment) (Bouvet, 2001) ont permis d’isoler une séquence oligonucléotidique spécifiquement reconnue par le domaine THAP de THAP1 .

Les résultats de SELEX ont été validés par des expériences de mutagénèse dirigée sur la séquence oligonucléotidique combinées à des expériences de gels retard (Electrophoretic Mobility Shift Assay) pour observer la liaison au domaine THAP. Cette séquence présente un cœur GGCA essentiel pour la reconnaissance par le THAP domaine de THAP1. Des mutations d’oligonucléotides sur ce motif abolissent la liaison au domaine THAP (figure 4). D’une façon générale, les expériences de mutagénèse dirigée sont en accord avec les données de SELEX sauf pour la thymine à la position 3 qui n’apparaît pas absolument nécessaire pour la reconnaissance protéine-ADN. Cette étude a ainsi conduit à l’identification d’une séquence consensus d’ADN cible de 11 nucléotides du domaine THAP de la protéine humaine THAP1, nommée THABS (THAP1 Binding Sequence) : AGTAAGGGCAA (Clouaire et al., 2005)  .

La liaison au zinc a été démontrée par l’emploi de chélateurs comme l’EDTA ou la phénanthroline qui abolissent la liaison à l’ADN (observé par gel retard). La liaison peut être rétablie par ajout d’ions zinc spécifiquement. De plus, la mutation ponctuelle des quatre résidus de la signature C2CH, susceptibles de coordonner le zinc, abolit également la liaison à l’ADN (figure 5). Enfin, il est montré de la même façon que les résidus strictement conservés, P26, W36, F58 et P78 sont essentiels pour la liaison THAP-THABS (Clouaire et al., 2005).

Le domaine THAP constitue un nouveau motif de liaison à l’ADN séquencespécifique, dépendant du zinc qui définit une nouvelle famille de protéines. Le domaine THAP appartient à la famille des domaines à doigts de zinc. Le nombre de membres, à peu près 100 protéines identifiées, en fait l’un des domaines de liaison à l’ADN impliquant une coordination au zinc, les plus abondants, après le domaine à doigts de zinc C2H2 et les récepteurs nucléaires (Clouaire et al., 2005). Le domaine THAP a une taille particulière (90 acides aminés contre 30 pour le domaine C2H2) et surtout une signature C2CH originale. En effet, l’espacement des résidus entre les cystéines en position 2 et 3 du motif C2CH est particulièrement grand (35 à 53 acides aminés contre 10 à 12 pour le domaine C2H2). De plus, la taille de la séquence spécifiquement reconnue par ce domaine est particulière puisque THAP1 reconnaît une séquence de 11 nucléotides contre 3 pour le domaine C2H2 classique. Ces originalités suggèrent un repliement nouveau et rendent ce domaine et son complexe avec l’ADN intéressants d’un point de vue structural.

THAP1 est impliquée dans la régulation de la prolifération cellulaire et du cycle cellulaire

Pour compléter cette caractérisation biophysique du domaine THAP de THAP1, des études ont été menées sur le rôle biologique de THAP1 par l’équipe de Biologie Vasculaire, Cayrol et ses collaborateurs ont montré que THAP1 est un régulateur de la prolifération des cellules endothéliales et du cycle cellulaire (Cayrol et al., 2007). Ainsi la surexpression de THAP1 ou sa déplétion par RNAi (RNA interférence) dans des cellules endothéliales entraînent un arrêt de la prolifération cellulaire suggérant qu’un niveau optimal de l’expression de THAP1 est crucial pour la prolifération cellulaire. L’analyse du transcriptome de cellules endothéliales, par puce à ADN, a permis d’identifier des gènes sous-exprimés lors de la surexpression de THAP1. De façon intéressante, ces gènes sont impliqués dans la voie de régulation pRb/E2F du cycle cellulaire (Dimova and Dyson, 2005; Dyson and Wright, 2005)l. L’inhibition de THAP1 dans des cellules endothéliales entraîne la sous-expression de plusieurs de ces gènes, évaluée par PCR quantitative. En particulier, le gène RRM1 qui est un gène activé à la transition G1/S, codant pour la sous-unité M1 de la réductase ribonucléotidique, et essentiel pour la synthèse de l’ADN en phase S (Bjorklund et al., 1993; Johansson et al., 1998), fait partie des gènes dont l’expression est modulée par THAP1. Des expériences de ChiPs (chromatin immunoprecipitation) et de footprinting ont montré que THAP1 se liait directement à l’ADN au niveau du promoteur de RRM1 sur un site comprenant la séquence consensus THABS. Ces données complètent les données obtenues sur les organismes animaux modèles et permettent d’associer les protéines THAP à la voie pRB/E2F du cycle cellulaire et à la prolifération cellulaire.

Le domaine THAP de THAP1 fait l’objet de notre étude. Nous venons de voir qu’il s’agit d’un domaine de liaison à l’ADN faisant intervenir une coordination au zinc. Nous allons maintenant décrire les protéines à doigt de zinc et passer en revue les trois domaines les plus importants de liaison à l’ADN faisant intervenir une coordination au zinc : le doigt de zinc classique C2H2, le domaine GATA, et le domaine de liaison à l’ADN des récepteurs nucléaires.

Les protéines à doigt de zinc 

Le zinc est le métal le plus abondant dans le corps humain après le fer, il fut d’abord mis en évidence dans des métalloenzymes dans les années 1950 (Coleman, 1992) et en 1983 dans un facteur de transcription, TFIIIA (Hanas et al., 1983). Initialement, le terme doigt de zinc décrit le motif structural de coordination de l’ion zinc avec les quatre résidus Cys2His2 (C2H2) du facteur TFIIIA (Miller et al., 1985). Ce motif répété consécutivement au sein de la protéine se compose d’une trentaine de résidus. L’origine de cette désignation en doigt de zinc provient de la représentation topologique du domaine et en particulier de la région entre la deuxième cystéine et la première histidine du motif C2H2 déjà pressenti comme région liant l’ADN (figure 6). Le terme de doigt étant également associé au fait que cette région « s’accroche » à l’ADN (Klug and Schwabe, 1995).

Le terme doigt de zinc désigne désormais l’ensemble des domaines protéiques comportant une coordination au zinc. Il définit un motif de petite taille, replié de manière autonome autour d’une coordination au zinc par plusieurs résidus (Klug and Schwabe, 1995), le plus souvent quatre, de type histidines ou cystéines (occasionnellement aspartates ou glutamates). Toutefois, certains préfèreront réserver le terme de doigt de zinc pour désigner le domaine de type C2H2 et parleront plus généralement de motif structural liant le zinc. Nous faisons le choix de parler de doigt de zinc pour l’ensemble des motifs structuraux liant le zinc, considérant que le terme fait référence au schéma topologique de la coordination au zinc et puisqu’il semble être admis par la communauté scientifique (Krishna et al., 2003; Laity et al., 2001). Ce motif structural est surtout connu pour son implication dans la reconnaissance d’ADN mais il est aussi retrouvé dans le cas d’interactions protéine-ARN (Kelly et al., 2007) et protéine-protéine (Gamsjaeger et al., 2007). Les membres de cette super famille protéique peuvent contenir un ou plusieurs de ces motifs. Les protéines à doigts de zinc sont très nombreuses. Andreini et ses collaborateurs estiment la proportion de protéines liant le zinc à 10% du génome humain, dont 40% de protéines à doigt de zinc, associées quasi exclusivement à des facteurs de transcription (Andreini et al., 2006).

Table des matières

INTRODUCTION
Le domaine THAP, un nouveau domaine de liaison à l’ADN
Identification de la protéine THAP1
Le domaine THAP définit une nouvelle famille de protéines
Le domaine THAP de THAP1, nouveau domaine de liaison à l’ADN
THAP1 est impliquée dans la régulation de la prolifération cellulaire et du cycle cellulaire
Les protéines à doigt de zinc
Introduction
La coordination au zinc
Classification des protéines à doigts de zinc
Classification structurale
Les doigts de zinc liant l’ADN
Introduction
Le doigt de zinc classique Cys2His2 (CCHH)
Introduction
Structure du domaine
Liaison à l’ADN
La région linker TGEKP
Des doigts de zinc synthétiques
Le doigt de zinc GATA, Cys4
Introduction
Structure du domaine
Liaison à l’ADN
Le domaine de liaison à l’ADN des récepteurs nucléaires, Cys8
Introduction
Structure du domaine de liaison à l’ADN
Liaison à l’ADN
La reconnaissance protéine-ADN
Introduction
Thermodynamique de l’interaction
La reconnaissance de forme
La reconnaissance chimique
Existence d’un code de reconnaissance ?
Rôle de la structure de l’ADN
La reconnaissance non spécifique
Cinétique de l’interaction protéine-ADN
Détermination de structure par RMN
Introduction
Préparation de l’échantillon
RMN des protéines en solution : stratégie d’attribution
Les données fournies par la RMN : contraintes structurales
Contraintes de distances
Structures secondaires
Les angles dièdres
Attribution stéréospécifique
Génération des structures
Calcul de structure
Qualité de la structure obtenue
PRODUCTION DES ECHANTILLONS ET DETERMINATION DE LA STRUCTURE DU DOMAINE THAP DE THAP1
Production et purification du domaine THAP de THAP1
Construction
Production
Purification
Formation du complexe THAP-ADN
Détermination de la structure du domaine THAP de THAP1
Conditions d’étude
Effet du pH
Ajout de zinc
Effet de la température
Concentration en NaCl
Acquisition et transformation des spectres
Attribution
Contraintes structurales
Contraintes de distance
Contraintes d’angles
Calcul de structure
ETUDE DE LA STRUCTURE ET DE LA LIAISON A L’ADN DU DOMAINE THAP DE THAP1
Présentation des résultats publiés
Caractérisation biophysique du domaine THAP de THAP1
Structure par RMN en solution du doigt de zinc THAP de THAP1
Une séquence ADN cible non partagée parmi les domaines THAP
Analyse structure-fonction du domaine THAP de THAP1 par mutagénèse dirigée
Identification de la surface de liaison du domaine THAP avec l’ADN par variations de déplacements chimiques
Structure-function analysis of the THAP-zinc finger of THAP1, a large C2CH DNA-binding module
linked to Rb/E2F pathways
Résultats complémentaires et discussions
Le domaine THAP de THAP1
Redéfinition du domaine d’un point de vue structural
Comparaison des domaines de THAP1, THAP2 et CtBP
Un nouveau motif en doigt de zinc
Homologues structuraux
Dynamique du domaine THAP
Liaison à l’ADN
Etude de la liaison par RMN
Etude de la liaison par Fluorescence
Etude de la liaison par RPS
Détermination de la constante de dissociation
Influence de la force ionique
Résidus impliqués dans l’interaction avec l’ADN
Un mode de reconnaissance original
Modélisation du complexe THAP-ADN
Une fonction différente associé à chaque domaine THAP
CONCLUSIONS

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