Soutenance mémoire
LE DIAGNOSTIC EN BACTERIOLOGIE
GENERALITES DU DIAGNOSTIC
La meilleure façon d’affirmer la nature infectieuse d’une maladie est d’isoler de l’organisme le germe en cause. C’est là le diagnostic direct qui n’est malheureusement pas toujours réalisable. Dans le laboratoire de microbiologie, il n’existe pas une méthode générale d’examen qui puisse permettre l’isolement de tous les microorganismes pathogènes susceptibles d’être présents dans un prélèvement donné. Le clinicien doit donc orienter les recherches en communiquant des renseignements cliniques concernant son malade. Quelques fois, les premiers résultats de l’examen microbiologique peuvent conduire le médecin à reconsidérer son diagnostic clinique et à modifier la thérapeutique qu’il a entreprise. Le bactériologiste doit faire la différence entre, d’une part, le germe responsable, d’autre part, les germes commensaux normalement présents sur les manifestations infectieuses. Dans certains cas l’agent infectieux peut avoir disparu avant ou après l’apparition des symptômes, à la suite d’un traitement antibiotique antérieur. Dans d’autres cas, les techniques d’isolement sont longues et délicates et d’application difficile dans un laboratoire non spécialisé. Le diagnostic indirect, alors seul possible, cherche à mettre en évidence chez le sujet suspect divers anticorps caractéristiques de l’affection (sérodiagnostic). Ils n’apparaissent pas immédiatement mais après une certaine durée d’évolution de la maladie et persistent souvent longtemps après la guérison. La recherche d’une hypersensibilité de type retardé dont le mécanisme d’installation est identique, rentre aussi dans la cadre du diagnostic indirect. La nécessité de la liaison laboratoire-clinique est essentielle. Si cette coopération n’existe pas, les malentendus se produiront au détriment du malade.
DIAGNOSTIC BACTERIOLOGIQUE OU DIRECT
Prélèvement à effectuer en cas d’infection microbienne
Il est indispensable que tout envoi soit accompagné d’une fiche donnant les indications sur la nature du produit pathologique, le nom, le prénom, l’âge du sujet, les conditions de prélèvement. Il faudra en cas de prélèvements multiples (hémocultures) indiquer le jour et l’heure de leur réalisation. Au cas où le malade aurait reçu des antibiotiques avant le prélèvement, il sera nécessaire de le mentionner. Il va de soi que, chaque fois que c’est possible, les prélèvements seront effectués avant toute administration d’antibiotiques. Les méthodes de prélèvement varient selon le siège de l’infection et selon le germe que l’on compte découvrir. En général, un prélèvement précoce augmente les chances de découvrir le micro organisme responsable. Toute contamination du produit prélevé peut être cause d’erreur dans l’interprétation des résultats. Aussi faut-il chercher à l’éviter en respectant les règles d’asepsie élémentaires. Le transport des prélèvements doit être fait selon des règles précises. Certains germes ne peuvent survivre à l’exposition, même courte, à une température inférieure à celle de l’hôte. D’autres supportent très mal la dessication ou le contact avec l’oxygène. La conséquence en est la nécessité d’un ensemencement très rapide, l’utilisation d’un milieu de transport ou le prélèvement dans un flacon à fermeture hermétique rempli d’un mélange gazeux inerte (anaérobies). La plupart des germe, au contraire, se multiplient activement et risquent, en cas d’association dans un produit pathologique, de rendre difficile l’isolement du germe recherché. Dans ce cas, il faut conserver les prélèvements à basse température.
Examen macroscopique
Il permet de noter une modification de l’aspect, de l’odeur, orientant déjà le diagnostic.
Examen microscopique
Il peut se faire à l’état frais, après coloration ou même par immunofluorescence.
a. Examen à l’état frais : Une goutte du produit pathologique placée entre la lamelle et la lamelle est examinée au microscope à l’objectif 40. Cet examen rapide permet de définir le nombre, la morphologie et surtout la mobilité des germes présents. Il permet également d’apprécier la composition de l’exsudat inflammatoire. Le microscope à fond noir est employé pour la détection du tréponème dans la sérosité d’un chancre ou d’un ganglion.
b. Examen après coloration : Un étalement du produit pathologique ou de son sédiment centrifugé est soumis à la coloration de Gram. Pour certains germes des colorations spéciales sont indispensables, telle la coloration de Ziehl-Neelsen pour la mise en évidence des mycobactéries.
Il est évident que l’examen microscopique ne permet que rarement l’identification précise d’un germe. En revanche, il renseigne sur la présence de bactéries dans un produit pathologique. De ce fait, il peut être utile pour le clinicien. Parfois il constitue le seul moyen de diagnostic bactériologique, par exemple pour la lèpre, dont l’agent causal est incultivable.
c. Examen par immunofluorescence : Cette méthode permet d’emblée l’identification de certaines bactéries et permet de déterminer le sérotype au sein d’une espèce bactérienne. Elle consiste à faire agir sur un étalement du produit pathologique un antisérum spécifique, marqué par incorporation d’une substance fluorescente (isothiocyanate de fluorescéine). Examiné en lumière ultraviolette, le germe, revêtu de l’anticorps spécifique, peut être facilement repéré par sa fluorescence.
Recherche d’antigènes solubles
Elle consiste à rechercher immunologiquement des antigènes bactériens libérés au cours de l’infection dans divers liquides organiques.
Mise en culture du produit pathologique
L’examen microscopique ne constitue généralement qu’une étape d’orientation, seule la culture permettra l’identification complète des bactéries.
a. Isolement des bactéries : Le produit pathologique est ensemencé dans des milieux favorables simples ou enrichis, en aéro anaérobiose, éventuellement sélectifs, lorsqu’on soupçonne un germe particulier. On utilise principalement des milieux solides qui permettent d’isoler les bactéries et de reconnaître l’existence éventuelle d’une flore microbienne mixte.
Le plus souvent, l’isolement est obtenu en étalant l’inoculum au moyen d’une anse de platine, en stries serrées à la surface d’une boîte de Pétri contenant un milieu solide. Après une ou deux nuits d’étuve, les germes ainsi séparés les uns les autres donneront naissance chacun à une colonie bactérienne, constituant un clone homogène. En repiquant une colonie dans un milieu neuf on obtiendra une culture pure.
Il est fréquemment fait appel à des milieux sélectifs. Bien souvent les renseignements cliniques ou l’examen direct du produit pathologique permettent d’orienter l’examen d’emblée vers la recherche précise de tel ou tel germe. On peut alors utiliser des milieux enrichis de substances diverses connues pour favoriser la croissance d’un germe, ou pour inhiber les bactéries non recherchées.
b. Identification des bactéries : Cette identification doit obligatoirement être faite à partir d’une culture pure. Rappelons-en brièvement les différentes étapes:
♦ Caractères morphologiques du germe: forme, groupement, mobilité, type de ciliature, spore, capsule, coloration de Gram…
♦ Caractères de culture : rapport avec l’oxygène, exigences nutritives aspect des colonies, pigmentation, hémolyse sur gélose au sang, odeur particulière.
♦ Propriétés biochimiques qui consistent à définir l’équipement enzymatique de la bactérie; métabolisme glucidique, lipidique, protéique.
♦ Si pour certaines bactéries l’identification s’arrête à ce stade, pour d’autres il est important de préciser les constituants antigéniques au moyen de sérums spécifiques agglutinants ou précipitants.
♦ Eventuellement le pouvoir pathogène expérimental sera recherché par inoculation à l’animal, mettant alors en évidence la virulence de la souche (bacille de la tuberculose) ou ses caractères toxigènes (bacille diphtérique).
♦ Dans un contexte épidémiologique particulier, il peut être utile de pousser l’identification de la souche jusqu’au stade du lysotype .
Inoculation à l’animal
Dans certains cas précis, l’inoculation directe du produit pathologique à l’animal réceptif peut être envisagée. Les bactéries, même peu nombreuses, trouvent alors dans cet hôte des conditions plus favorables à leur multiplication. Le développement d’une maladie typique permet du même coup de suspecter l’identification de la bactérie. A partir du sang ou des viscères de l’animal on peut isoler le germe en culture pure.
DIAGNOSTIC IMMUNOLOGIQUE OU INDIRECT
L’infection bactérienne entraîne la libération, dans l’organisme infecté, de nombreux antigènes : antigènes somatiques (antigène 0), antigènes flagellaires (antigènes H), antigènes d’enveloppe (antigènes K), antigènes enzymatiques (hémolysines, protéases, lipases, DNAses…), antigènes toxiques, etc. Ces antigènes induisent une réponse immunitaire spécifique. Celle-ci est double :
-réponse humorale: c’est l’apparition d’anticorps spécifique.
-réponse cellulaire: c’est l’apparition d’une hypersensibilité de type retardé.
Recherche des Anticorps Spécifiques = Sérodiagnostic
♦ Principe : Le réactif à utiliser est l’antigène bactérien (Ag) connu, plus ou moins complexe (corps bactériens ou antigène purifié ). Cet antigène est mélangé avec le sérum à tester. Si ce sérum possède des anticorps (Ac), spécifiques de l’antigène, il se forme des immums-complexes Ag-Ac, détectables. Le sérum est dit « positif ». Si ce sérum ne possède pas d’anticorps spécifiques de l’antigène, on ne peut détecter la présence d’immuns complexes. Le sérum est dit « négatif ».
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Table des matières
I)INTRODUCTION
II) GENERALITES
III) METHODOLOGIE
IV) RESULTATS
V) COMMENTAIRES ET DISCUSSION
VI) CONCLUSION
VII) REFERENCES
ANNEXES
RESUME
