Soutenance mémoire
Le cytosquelette neuronal
Le fonctionnement du système nerveux dépend de l’architecture des réseaux de neurones. Au cours de leur différenciation, les neurones acquièrent une morphologie complexe en devenant des cellules polarisées. Ils développent, à partir de leur corps cellulaire, différentes ramifications neuritiques : l’axone (prolongement long et fin transmettant l’information) et les dendrites (nombreux prolongements effilés et courts recevant l’information). Cette architecture leur permet d’assurer des fonctions spécialisées de collecte, d’intégration et de transfert d’information sous la forme d’influx électriques. La morphologie et la fonction des cellules neuronales sont soutenues par une réorganisation dynamique et coordonnée des différents éléments du cytosquelette. Ceuxci peuvent être classés d’après leur diamètre en microscopie électronique : microfilaments d’actine (7 à 9 nm de diamètre), filaments intermédiaires (10 nm de diamètre) et microtubules (25 nm de diamètre).
Les microfilaments d’actine
Structure et dynamique
Dans les cellules, l’actine se présente soit sous la forme de monomères d’actine G, protéines globulaires de 43 kDa, soit sous la forme d’une structure fibrillaire, l’actine F (actine filamenteuse) ou microfilaments d’actine (MFs) qui résultent de la polymérisation de l’actine G. L’actine n’existe pas de manière figée sous l’une ou sous l’autre forme mais est en permanence en équilibre entre ces deux formes. Trois types d’actine G issus de gènes différents ont été caractérisés : l’actine α, spécifique des cellules musculaires, l’actine β et l’actine γ, présentes dans tous les autres types de cellules (Khaitlina et al., 2001).
L’actine G a la capacité de lier des nucléotides (ATP ou ADP) ainsi que certains cations divalents (calcium, magnésium). Le processus de polymérisation de l’actine nécessite de l’énergie et se réalise en trois étapes (Carlier et al., 1991). Lors de la première étape ou étape d’activation, les monomères d’actine G lient les cations divalents et l’ATP, provoquant leur changement conformationnel. Les complexes Actine G–ATP-cations alors formés sont appelés complexes activés et ont les compétences nécessaires pour entrer dans la deuxième phase ou phase de nucléation. Trois complexes activés s’associent et forment un noyau de polymérisation. Ce noyau de polymérisation est nécessaire à la future élongation du filament. Enfin, lors de l’étape d’allongement, la polymérisation se poursuit par l’addition de monomères d’actine G aux extrémités du noyau de polymérisation ou du filament en cours de formation. Le monomère d’actine G hydrolyse son ATP lors de son incorporation dans le filament (Carlier et al., 1991).
La polymérisation et la dépolymérisation des MFs ne se produisent pas de façon équivalente à chaque extrémité du filament : l’extrémité barbée (extrémité positive) riche en actine ATP favorisera l’assemblage des monomères, alors que l’extrémité pointue (extrémité négative) riche en Actine-ADP, favorisera plutôt leur dissociation. Le filament peut atteindre un état d’équilibre dynamique c’est-à-dire un état où la dissociation à l’extrémité pointue est compensée par l’ajout de monomères à l’extrémité barbue. La longueur du filament d’actine ne varie pas alors que les molécules d’actine G assemblées à l’extrémité barbue migrent vers l’extrémité pointue. C’est le processus « de tapis roulant » ou « treadmilling » (Wegner et al., 1976).
Contrôle de la dynamique de l’actine
Afin de pouvoir répondre à un besoin immédiat ou à un signal extracellulaire, les neurones doivent être capables de contrôler en permanence et rapidement l’organisation et la dynamique du cytosquelette d’actine. La polymérisation, in vitro, de l’actine seule est extrêmement lente. Elle ne peut donc expliquer à elle seule la plupart des phénomènes dynamiques rapides. La cellule a donc à sa disposition un grand nombre de protéines particulières, les ABPs (Actin Binding Proteins ; Pollard et al., 2000). Elles interagissent directement avec l’actine et peuvent modifier ses propriétés dynamiques et/ou structurales. Elles peuvent être regroupées suivant leur rôle sur le contrôle de la dynamique et de l’organisation des filaments d’actine. Certaines peuvent contrôler simultanément plusieurs aspects de cette dynamique. Les ABPs peuvent donc :
– Maintenir une concentration élevée d’actine monomérique nécessaire au renouvellement rapide des filaments d’actine.
– Nucléer (ou initier) des filaments d’actine. Citons, par exemple, le complexe Arp2/3, les protéines Spirs ou les formines.
– Inhiber la nucléation de l’actine comme, par exemple, les protéines thymosine-β4 calbindine et Cofiline/ADF ou bloquer la croissance des extrémités barbues (protéines de la coiffe).
– Organiser les filaments d’actine en structures élaborées. Ceci est le rôle des protéines de réticulation comme l’α-actinine, la filamine et la spectrine qui permettent de lier les filaments d’actine entre eux avec une géométrie et une élasticité particulières (câbles d’actine ou réseaux branchés denses d’actine).
Rôle des microfilaments d’actine
Au sein des cellules, le cytosquelette d’actine est plus particulièrement responsable des phénomènes motiles et de la transmission de forces en général. L’actine filamenteuse peut exister sous la forme de longs filaments individuels, mais la plupart du temps, que ce soit pour répondre à des fonctions cellulaires précises ou pour résister à des contraintes mécaniques, les filaments d’actine sont organisés en structures élaborées qui cohabitent dans les différents types cellulaires chez les Eucaryotes.
dans la structure et la motilité des cônes de croissance
Dans le neurone, et plus précisément au niveau du cône de croissance, l’actine F adopte différentes structures élaborées. Le cône de croissance contient une zone en forme d’éventail, le lamellipode qui présente de nombreuses extensions, nommées filopodes (Baker et al., 2007 ; Grzywa et al., 2006 ; Figure 2). Dans le lamellipode, le réseau d’actine se présente sous la forme d’un réseau branché dense et, au sein des filopodes, sous la forme de câbles d’actine (Figure 2). Les filaments d’actine, dans ces deux structures, sont majoritairement orientés avec leurs extrémités barbues au niveau de la membrane alors que les extrémités pointues sont dirigées vers le centre du cône de croissance.
La polymérisation du réseau d’actine se fait au contact de la membrane (Wang et al., 1985). Le « treadmilling » de l’actine est responsable, soit directement soit par l’intermédiaire de protéines associées, de la force nécessaire à la protusion du cytoplasme au niveau de la membrane qui est, par la suite, responsable de la motilité du cône de croissance (Heidemann et al., 1990 ; Tanaka et al., 1995 ; Dent et al., 2001 et 2003a). La motilité du cône de croissance lui permet d’explorer l’environnement extra-cellulaire afin de trouver sa cible (Dent et al., 2003b ; Zito et al., 2004).
La formation du réseau d’actine branché est dépendante de la collaboration de nombreuses ABPs ; un modèle a été proposé (Pollard et al., 2003). L’actine complexée à la profiline forme un réservoir de monomères pour la cellule. L’activation à la membrane des protéines de la famille WASP active le complexe Arp2/3 qui créé de nouvelles extrémités barbues à proximité de la membrane. L’élongation rapide de ces extrémités permet au cytosquelette de pousser la membrane vers l’avant. Rapidement, les protéines de coiffe bloquent l’élongation des filaments. L’action combinée des protéines de coiffe et du complexe Arp2/3 permet de former des réseaux branchés denses de filaments d’actine. L’hydrolyse progressive du nucléotide ATP des filaments d’actine suivi de la dissociation du phosphate permet la fixation sur les filaments de l’ADF/cofiline qui désassemble le réseau par fragmentations successives puis dépolymérisation des petits filaments ADP. Enfin, les monomères d’actine-ADP perdent l’ADF/cofiline à laquelle ils sont liés au profit d’une complexation avec la profiline qui accélère l’échange du nucléotide ADP pour un nucléotide ATP. Cela permet le recyclage du monomère d’actine, qui est de nouveau disponible pour polymériser à une nouvelle extrémité barbue.
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Table des matières
Introduction
Chapitre 1 : Le cytosquelette neuronal
I – Les microfilaments d’actine
I – 1 Structure et dynamique
I – 2 Contrôle de la dynamique de l’actine
I – 3 Rôle des microfilaments d’actine
I – 3-1 dans la structure et la motilité des cônes de croissance
I – 3-2 dans l’organisation de la synapse
II – Les filaments intermédiaires neuronaux
II – 1 Structure et dynamique
II – 2 Rôle des neurofilaments dans les neurones
III – Les microtubules
III – 1 La structure des microtubules
III – 1-1 La tubuline
III – 1-2 Les microtubules
III – 2 L’assemblage des microtubules
III – 2-1 Dynamique des microtubules in vitro
III – 2-2 Dynamique des microtubules in vivo
III – 2-3 Les modifications post-traductionnelles de la tubuline
III – 2-3-1 L’acétylation de la tubuline
III – 2-3-2 La polyglycylation de la tubuline
III – 2-3-3 La polyglutamylation de la tubuline
III – 2-3-4 La tyrosination/détyrosination de la tubuline
III – 2-3-5 La phosphorylation de la tubuline
III – 2-3-6 La palmitoylation de la tubuline
III – 3 Rôles des microtubules neuronaux
III – 3-1 Microtubules et croissance neuronale
III – 3-2 Microtubules, transport vésiculaire et maintien des organites
Chapitre 2 : Les effecteurs microtubulaires neuronaux
I – Les protéines stabilisatrices des microtubules
I – 1 Les MAPs classiques
I – 1-1 Les MAPs de type 1 (MAP1)
I – 1-2 Les MAPs de type 2 (MAP2)
I – 1-3 La protéine Tau
I – 2 La protéine doublecortine (DCX)
I – 3 Les protéines STOPs
I – 4 Compensations et/ou régulations des MAPs entre elles
II – Les protéines régulatrices de la polymérisation des microtubules neuronaux
II – 1 La famille stathmine
II – 2 La tubuline cofacteur B (TBCB)
III – Les moteurs moléculaires
III – 1 Les kinésines
III – 2 La dynéine
IV – Les protéines STOPs
IV – 1 Les différentes isoformes des protéines STOPs
IV – 1-1 Les isoformes spécifiques des neurones
IV – 1-1-1 Expression tissulaire et localisation des STOPs neuronales
IV – 1-1-2 Fonctions des STOPs neuronales
IV – 1-2 Les isoformes non neuronales
IV – 1-2-1 Expression tissulaire et localisation des STOPs non neuronales
IV – 1-2-2 Fonctions des isoformes non neuronales
IV- 2 Domaines fonctionnels des STOPs
IV – 2-1 Domaines de liaison aux microtubules
IV – 2-2 Domaines de liaison à la calmoduline
IV – 2-3 Sites de phosphorylation par la CamKII
IV – 3 La souris KO STOP
Chapitre 3 : La palmitoylation dans les neurones
I – La palmitoylation
I – 1 Généralités
I – 2 Mécanismes de palmitoylation
I – 2-1 Les Palmitoyl Acyl Transférases
I – 2-2 Les Palmitoyl Thioestérases
I – 3 Les sites de palmitoylation
II – Rôle de la palmitoylation dans les neurones
II – 1 Ciblage au membranes et Tri des protéines
II – 2 Croissance axonale
II – 3 Signalisation pré-synaptique
II – 4 Signalisation post-synaptique
II – 5 Régulation de la palmitoylation par l’activité synaptique
Objectifs de travail
Matériels et méthodes
I – Biologie cellulaire
I – 1 Matériels
I – 1-1 Plasmides utilisés
I – 1-2 Anticorps primaires
I – 1-3 Anticorps secondaires
I – 2 Méthodes
I – 2-1 Culture cellulaire
I – 2-1-1 Culture des lignées cellulaires
I – 2-1-2 Culture primaire des neurones d’hippocampe de souris
I – 2-1-2-a Préparation des boites de cultures
I – 2-1-2-b Obtention de la suspension des neurones d’hippocampe
I – 2-2 Transfections transitoire des lignées cellulaires
I – 2-3 Traitement des cellules au 2-bromopalmitate
I – 2-4 Fixation des cellules
I – 2-5Immunofluorescence indirecte
II – Biochimie
II – 1 Extraits protéiques
II – 1-1 A partir de cerveaux de souris
II – 1-2 A partir de cellules en culture
II – 2 Immunoprécipitation
II – 3 Palmitoylation « in vitro » dans les cellules HeLa et Cos
II – 4 Détection et analyse des protéines radiomarquées
Résultats
Conclusion
