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Le cycle de l’azote et les voies de réduction microbiennes des nitrates
Plusieurs processus microbiens agissent sur le cycle de l’azote en transformant les différents composés azotés dont les nitrates.
– La réduction assimilatrice des nitrates : réduit les nitrates en ammonium pour assimiler ce dernier en le fixant à la glutamine.
– La fixation de l’azote : fixation du diazote gazeux en ammonium afin de l’assimiler dans les composés organiques. Ce processus est coûteux en énergie et nécessite une nitrogénase, il existe par exemple des symbioses entre les plantes et les bactéries dans lesquelles ces dernières fixent le diazote nécessaire à la plante.
– La réduction dissimilatrice des nitrates : permet de réduire les nitrates en ammonium, l’ammonium n’est pas assimilé, c’est uniquement une réaction d’oxydoréduction.
– La dénitrification : c’est la réduction des nitrates en espèce gazeuse, oxyde nitreux ou diazote
– Le processus ANAMMOX : c’est l’abréviation en anglais de anaerobic ammonium oxidation, dans lequel l’ammonium est oxydé par les nitrites en diazote.
– La nitrification : oxyde l’ammonium en nitrites ou nitrates.
Dans le contexte de la thèse, les processus microbiens d’intérêtsont ceux qui conduisent à la réduction des nitrates. Ce sont donc les processus de dénitrification ou de réduction dissimilatrice en ammonium qui sont susceptibles de réduire les nitrates. Les microorganismes privilégient l’une ou l’autre voie de réduction selon le ratio C/N et le type de substrat organique biodisponible [31,32]. Dans les environnements à proximité des déchets radioactifs, des concentrations élevées en nitrates et relativement faibles en matière organique sont attendues, le ratio C/N sera très faible ce qui favorise la dénitrification . De plus, la matière organique sera présente essentiellement sous forme d’acides organiques, ce qui favorise la dénitrification. En conséquence le processus de réduction des nitrates attendu est la dénitrification, ce qui a été confirmé par les travaux collaboratif menés depuis 10 ans maintenant par le groupe LMDC-LGC à Toulouse [17,18].
Aspects énergétiques de la dénitrification, comparaison avec la respiration aérobie
La dénitrification biologique, est un processus de respiration bactérienne mettant en œuvre la réduction successive des composés azotés : nitrate, nitrite, oxyde nitrique, oxyde nitreux en diazote. Le processus de la respiration de ces espèces azotées, se déroule en deux phases. Dans une première phase, les coenzymes oxydées NAD+ sont réduites en NADH,H+ par un donneur d’électrons comme le dihydrogène ou l’acétate oxydés respectivement en protons ou en CO2. Dans une seconde phase, les coenzymes NADH,H+ fournissent les électrons qui sont transportés le long de la chaîne de transport d’électrons jusqu’à l’accepteur final nitrates, nitrites, oxyde nitrique ou oxyde nitreux. Ce transport d’électrons est converti en gradient de protons à travers la chaine de transport d’électrons, puis l’ATPsynthase converti le gradient de protons en ATP. Il est possible de calculer l’enthalpie libre standard (∆G0) de la dénitrification qui est l’énergie potentielle libérée par une réaction. Si ∆G0 = 0 le système est à l’équilibre et n’évolue pas. Plus le ∆G0 est négatif plus la réaction libère d’énergie. L’enthalpie libre standard s’exprime en fonction de la différence des potentiels standards des couples d’oxydoréduction .
De la souche Paracoccus denitrificans à un consortium microbien comme inocula dénitrifiants
La démarche expérimentale a consisté d’abord à acquérir des connaissances à partir de systèmes expérimentaux modèles puis au cours de la thèse de progressivement complexifier les systèmes d’étude pour se rapprocher du contexte réel du stockage des déchets radioactifs. En conséquence, le premier inoculum microbien utilisé était une souche bactérienne modèle déjà très étudiée dans le cadre de travaux fondamentaux sur la dénitrification : Paracoccus denitrificans [28,35,36]. P. denitrificans est une bactérie Gram négative, non mobile, aérobie anaérobie facultative, qui a la capacité de vivre dans des environnements variés [28]. Notre choix s’est préférentiellement orienté sur cette souche car elle possède les quatre réductases nécessaires à la dénitrification [35,36] et parce que cette bactérie est capable d’utiliser aussi bien de la matière organique que de l’hydrogène comme donneur d’électrons [28]. Des travaux précédemment réalisés conjointement au LGC et au LMDC ont déjà montré que P. denitrificans pouvait réduire les nitrates jusqu’à pH 9,5 ou en hydrogénotrophie [18].
Dans un second temps, pour se rapprocher de la réalité du contexte du stockage des déchets radioactifs, un consortium de microorganismes a été utilisé. Le consortium microbien a été échantillonné à partir de boues activées collectées dans une station d’épuration. Ce choix a été décidé en accord avec l’Andra en considérant que les bactéries susceptibles de se développer dans les alvéoles de stockage des déchets radioactifs sont majoritairement apportées par l’activité humaine [11,12] et pas nécessairement déjà adaptées à des pH ou des concentrations en nitrates élevées. Les consortia microbiens qui composent les boues activées sont caractérisés par une importante diversité microbienne. Il est donc probable qu’ils renferment les microorganismes capables de se développer dans les alvéoles de stockage. Il a d’ailleurs déjà été montré que les consortia microbiens issues des boues activées étaient capables de s’adapter et de réduire les nitrates, à des pH élevés [37], ou des concentrations en nitrates élevées [38] ou encore en hydrogénotrophie [39].
Dénitrification bactérienne en présence d’acier et de ciment solides
De l’acier et des matrices cimentaires seront présents dans la structure en béton armée des alvéoles de stockage. De plus, les déchets MAVL seront conditionnés dans un colis en acier et dans un surconteneur en béton armé. En présence de bactéries, l’acier et la matrice cimentaire solides peuvent favoriser la colonisation de biofilms bactériens sur leurs surfaces. L’organisation des bactéries en biofilm leur offre de nombreux avantages, en particulier la résistance à des stress environnementaux [15,147]. Par ailleurs, l’acier et le ciment peuvent influencer l’équilibre chimique du milieu réactionnel des bactéries. En outre, le ciment a tendance à élever le pH par le relâchement d’OH- en solution. Le ciment peut aussi relâcher des ions potentiellement utilisés par les bactéries en particulier le Na, K et le Ca. L’acier quant à lui peut être impliqué dans de nombreuses réactions d’oxydoréductions générant des produits de corrosion tels que le dihydrogène et des oxydes de fer modifiant aussi le pH.
Croissance de biofilm sur les surfaces solides
Les bactéries sont capables de coloniser sans problème l’acier [15,148], ou les matrices cimentaires [149,150]. Ces matériaux utilisés en industrie sont parfois colonisés par une densité de population tellement élevée qu’on parle d’encrassement (biofouling en anglais) [15,147,148]. Un biofilm microbien est une communauté pluricellulaire complexe adhérant à une surface, et secrétant une matrice protectrice. Le biofilm génère un microenvironnement protecteur qui permet aux cellules de survivre dans des environnements hostiles puis de se disperser pour coloniser de nouveaux habitats [147]. Dans les biofilms, des multitudes d’espèces microbiennes peuvent coexister en exprimant des métabolismes microbiens qui peuvent être assez différents[151]. La structure du biofilm, bien souvent complexe et hétérogène, est constituée de micro-colonies de microorganismes et d’une matrice de polymères sécrétés par les microorganismes [147]. Cette matrice est classiquement composée de substances polymériques extracellulaires, c’est-à-dire de protéines et de polysaccharides et en quantité moindre d’ADN, lipides, et autres macromolécules organiques. Si les biofilms microbiens sont observés dans une grande variété d’environnements, c’est qu’ils offrent plusieurs avantages. Les surfaces sur lesquelles adhèrent les biofilms apportent une stabilité dans des environnements turbulents. Elles peuvent aussi accélérer les réactions microbiennes. De plus, la structuration en biofilm offre aux bactéries une protection contre un large éventail de stress environnementaux : toxicité des métaux, pH, salinité, températures extrêmes, antibiotiques [147,152]. De plus, dans le biofilm, des zones de dormance où l’activité bactérienne est très ralentie ont parfois été identifiées, les bactéries en état de dormance sont inactives mais peuvent survivre à des environnements extrêmes en attendant des conditions plus favorables [147]. Enfin la résistance globale du biofilm à un stress particulier peut être augmentée en accueillant en son sein des bactéries spécialisées dans la résistance à ce stress. Ces bactéries sont appelées persistantes [147]. En définitive en s’organisant en biofilm, les bactéries sont capables de résister à des conditions qualifiées d’extrêmes. Elles sont par exemple capables de survivre dans des piscines de stockage de combustibles nucléaires avec peu de matière organique [15].
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Table des matières
INTRODUCTION GENERALE
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
I.1. Généralités sur la dénitrification
I.1.1. Le cycle de l’azote et les voies de réduction microbiennes des nitrates
I.1.2. Aspects énergétiques de la dénitrification, comparaison avec la respiration aérobie
I.1.3. De la souche Paracoccus denitrificans à un consortium microbien comme inocula dénitrifiants
I.2. Influence du dihydrogène, du pH alcalin et des concentrations élevées en nitrates sur la dénitrification microbienne
I.3. Dénitrification bactérienne en présence d’acier et de ciment solides
I.3.1. Croissance de biofilm sur les surfaces solides
I.3.2. Effet de l’insertion d’acier solide dans un milieu aqueux
I.3.3. Réductions des nitrates et des nitrites en présence d’acier
I.3.4. Influence de l’insertion de ciment en milieu aqueux
I.4. Conclusions de la synthèse bibliographique et perspectives de recherche
MATERIELS ET METHODES
II.1. Inocula, et milieux de culture
II.1.1. Inocula : P. denitrificans
II.1.2. Inocula : boues activées
II.1.3. Milieu de culture de P. denitrificans
II.1.4. Lixiviat de ciment
II.1.5. Régulation du pH
II.1.6. Régulation de la température
II.2. Bioréacteurs et montage expérimental
II.2.1. Bioréacteurs batch
II.2.2. Bioréacteurs continus
II.2.1. Sources de H2 et de N2
II.2.2. Acier et ciment solide, disposition dans les réacteurs
II.2.3. Liste des expériences
II.3. Méthodes analytiques
II.3.1. Analyses de la biomasse
II.3.2. Analyse du pH, des carbonates
II.3.3. Dosage des ions nitrate et nitrite
II.3.1. Dosages de l’acétate, et de la DCO
II.3.2. Dosages des éléments (Na, K, Ca, Fe, Si…)
II.3.3. Analyse des matériaux solides
DENITRIFICATION AVEC LA SOUCHE MODELE PARACOCCUS DENITRIFICANS
III.1. Comparaison de l’acétate et le dihydrogène comme accepteurs d’électrons en bioréacteurs batch
III.2. Simulation de l’évolution du pH lors de la dénitrification
III.2.1. Calculs théoriques de l’évolution du pH avec acétate
III.2.1. Calculs théoriques de l’évolution du pH avec dihydrogène
III.3. Comparaisons de deux méthodes d’acclimatation
III.3.1. Comparaison de deux méthodes d’acclimatation à une élévation progressive de pH
III.3.2. Acclimatation à des concentrations élevées de nitrates en réacteurs batch successifs
III.4. Conclusions du chapitre
DENITRIFICATION HETEROTROPHE AVEC UN CONSORTIUM BACTERIEN
IV.1. Comparaison de trois méthodes d’acclimatation
IV.1.1. Acclimatation par inoculations successives
IV.1.2. Acclimatation en réacteurs continus
IV.1.3. Acclimatation en réacteurs discontinus séquentiels à des concentrations élevées en nitrates (50-400 mM) dans trois cultures à pH 9, 10 et 11
IV.1.4. Conclusions de la comparaison des trois méthodes d’acclimatations
IV.2. Comparaison de l’apport de nitrates et ou de nitrites sous forme de NaNO3, NaNO2 et KNO3
IV.3. Dénitrification à pH hyperalcalins (pH 11,5 et 12)
IV.4. Transition d’un donneur d’électrons organique (acétate) vers un donneur d’électrons inorganique (H2)
IV.5. Conclusions du chapitre
CONCLUSION GENERALE
