Le couplage du transport des ions Cl- et H+ chez les échangeurs ClC

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Rôles des canaux Kir dans les cellules sensibles au pH

Certains canaux Kir, inhibés par les protons intracellulaires, jouent un rôle de capteur de pH. Ce phénomène a clairement été mis en évidence dans les neurones du locus cœruleus, nécessaires à l’augmentation de la fréquence respiratoire durant l’acidose (voir Section Introduction A.II.4). Très tôt, l’implication de courants rectifiants entrants dans ce phénomène a été établie (Pineda & Aghajanian, 1997). Peu après, l’hypothèse que cette sensibilité soit sous-tendue par l’expression des sous-unités Kir4.1 et Kir5.1 dans le système nerveux central est apparue (Xu et al., 2000). Il a finalement été montré que la diminution du pH intracellulaire des neurones du locus cœruleus durant l’hypercapnie provoque la fermeture d’un hétérotétramère Kir4.1/Kir5.1 constitutivement actif. Cette fermeture s’accompagne d’une dépolarisation légère des neurones et augmente leur fréquence de production d’un potentiel d’action. En conséquence, la fréquence respiratoire augmente, ce qui diminue la PCO2 et fait remonter le pH extracellulaire à sa valeur physiologique (D’Adamo et al., 2011).
De façon intéressante, bien que Kir4.1 soit capable de former un homotétramère fonctionnel et que d’autres sous-unités Kir y soient exprimées, la sensibilité au pH des neurones du locus cœruleus requiert la présence de Kir5.1: chez les souris invalidées pour le gène Kcnj16 encodant Kir5.1, ces neurones ne répondent plus à l’hypercapnie. Pour cause, le canal Kir4.1 est peu sensible au pH intracellulaire lorsque celui-ci est physiologique (pKH: 6.0), alors que le canal Kir4.1/Kir5.1 y est très sensible (pKH: 7.1) [Voir Figure 13] (D’Adamo et al., 2011; Zhang et al., 2011). Récemment, la possibilité que Kir5.1 confère leur sensibilité au pH intracellulaire à d’autres neurones a été évoquée (Puissant et al., 2017).
Dans les cellules gliales la sensibilité au pHi du canal Kir4.1/Kir5.1 pourrait également s’avérer nécessaire: elle permettrait de stimuler l’activité de « K+ buffering » lors d’une augmentation de la concentration extracellulaire en ions K+ (voir Section Introduction B.II.1.b). En effet, une telle augmentation, en dépolarisant les cellules gliales, pourrait augmenter l’activité de leurs cotransporteurs électrogéniques Na+/3HCO3-, ce qui alcaliniserait leur cytoplasme et activerait leurs canaux Kir4.1/Kir.5.1 (Ishii et al., 2003; Hibino et al., 2010).
Enfin, il a été récemment rapporté que la sensibilité des papilles gustatives au goût acide est liée à la modulation par le pH intracellulaire de l’activité du canal Kir2.1 exprimé dans l’épithélium lingual (Ye et al., 2016).

Expression et fonctions hypothétiques de Kir4.2 et Kir5.1

La plupart des sous-unités Kir sont reconnues porteuses de fonctions physiologiques, mises en évidence par l’étude de modèles animaux génétiquement modifiés. Pourtant certaines ne sont pas reliée à une pathologie humaine: leurs fonctions sont souvent redondantes avec celles d’autres sous-unités (Torrecilla et al., 2002; Zobel et al., 2003; Fang et al., 2005). Mais le rôle physiologique de quelques sous-unités Kir est inconnu car aucun modèle animal d’invalidation de leur gène n’a été étudié: c’est le cas de Kir2.3 et Kir2.4, exprimées dans le cœur ou le système nerveux central, de la sous-unité Kir2.5 récemment identifiée comme une sous-unité à part entière (voir Section Introduction B.I.1) et de Kir4.2 (Hibino et al., 2010).
Le profil d’expression de Kir4.2 est encore incertain. Chez l’homme, la souris ou le rat, de nombreux tissus ont été testés par différentes équipes et méthodes pour évaluer la présence de Kir4.2 ou de son ARNm. Dans l’ensemble, il ressort que Kir4.2 est exprimée dans le cortex rénal et pourrait être dans les cellules β-pancréatiques, les cellules pariétales de l’estomac, l’épithélium pulmonaire, l’intestin, le cœur, les leucocytes, le cerveau et le foie. Toutefois, pour ces derniers les résultats sont parfois variables ou contradictoires (Gosset et al., 1997; Ohira et al., 1997; Shuck et al., 1997; Pearson et al., 1999; Thiery et al., 2000; Hibino et al., 2004a; Hibino et al., 2004b; Yang et al., 2008; He et al., 2011; Okamoto et al., 2012; Yuan et al., 2015). Il est intéressant de constater que dans le néphron humain, l’ARNm de Kir4.2 est seulement présent dans le TP alors qu’il a été identifié une fois dans le TCD de souris (Lourdel et al., 2002; Chabardes-Garonne et al., 2003). Étonnamment, bien que Kir4.2 soit très sensible au pH intracellulaire physiologique (pKH: 7.5), elle n’est pas exprimée dans le locus cœruleus ou certains neurones sensibles au pH (Pessia et al., 2001; Puissant et al., 2017).
La sous-unité Kir4.2 peut former un homotétramère fonctionnel, mais probablement peu exprimé à la membrane plasmique (voir Section Introduction B.I.2.c), ou un hétérotétramère fonctionnel, avec la sous-unité Kir5.1 (voir Section Introduction B.I.2.b). Or, en dehors du système nerveux central et du néphron distal ou elle est associée à Kir4.1 (voir Section Introductions B.II.1 et B.II.2.c), Kir5.1 est exprimée dans le pancréas et les fibrocytes du ligament spiral de l’oreille interne (Pessia et al., 2001; Hibino et al., 2004b) et pourrait être présente dans le TP (Tucker et al., 2000; Derst et al., 2001b). Dans le ligament spiral, Kir5.1 est seule dans le compartiment intracellulaire et son rôle est incertain (Pan et al., 2016). Kir5.1 est peut-être également exprimée dans l’estomac (Fujita et al., 2002; He et al., 2011) mais n’est vraisemblablement pas exprimée dans les poumons (Wu et al., 2004).

Revue des sous-unités Kir exprimées dans le tissu rénal

Dans le tissu rénal, des canaux Kir ont été fonctionnellement décrit dans un grand nombre de membranes cellulaires. A l’heure actuelle, une dizaine de sous-unité Kir y ont été moléculairement identifiées et pourraient donc participer à la formation de ces canaux Kir (Hebert et al., 2005; Hibino et al., 2010; Hamilton & Devor, 2012; Welling, 2016).
Parmi les sous-unités Kir rénales se trouvent Kir2.1, Kir2.2, Kir2.3 et Kir6.1 qui sont exprimées dans les cellules vasculaires endothéliales ou musculaires lisses des artérioles glomérulaires et des capillaires péritubulaires. Leurs rôles à l’heure actuelle sont incertains: elles pourraient notamment contribuer à la modulation du tonus des artérioles glomérulaires lors des changements de kaliémie, en permettant indirectement la production du NO par les cellules endothéliales vasculaires (Cao et al., 2007; Chilton et al., 2008; Hibino et al., 2010; Magnusson et al., 2011; Salomonsson et al., 2017). Certaines de ces sous-unités Kir sont également exprimées dans d’autres tissus rénaux. Ainsi, un canal Kir2.1 est exprimé dans les cellules de l’appareil juxtaglomérulaire où il permet le maintien d’un potentiel de repos de -60 mV (Leichtle et al., 2004; Hibino et al., 2010) et son ARNm a été reporté dans les cellules proximales humaines (Derst et al., 2001b). De même, la présence d’un canal Kir2.3 dans la membrane basolatérale des cellules principales du CC a été montrée par immunohistochimie et patch-clamp (Welling, 1997; Millar et al., 2006). Enfin, la sous-unité Kir6.1 est exprimée dans les mitochondries d’un grand nombre de cellules rénales comprenant celles du CC, du TCD et éventuellement du TP (Brochiero et al., 2002; Zhou et al., 2007; Hamilton & Devor, 2012). Par ailleurs, Kir7.1 est exprimée dans les membranes basolatérales du TCD, du TCN, du CC et dans le TP (Krapivinsky et al., 1998; Ookata et al., 2000; Derst et al., 2001a) et l’ARNm de Kir4.2 a été rapporté dans le TP et le TCD (voir Section Introduction B.II.1.d). Cependant, le caractère primordial de ces 7 sous-unités dans l’établissement de la fonction rénale n’a été mis en évidence, ni par l’utilisation de modèles animaux ni par la découverte de pathologies associées à leurs gènes [Voir Tableau 1] (Hibino et al., 2010; Villanueva et al., 2015; Welling, 2016).
Au contraire, les canaux Kir1.1 et Kir4.1/Kir5.1 sont considérés comme les principaux canaux potassiques des membranes apicales ou basolatérales du néphron distal et sont dotés d’une importance physiologique majeure à ces emplacements (Hebert et al., 2005; Wang et al., 2010; Hamilton & Devor, 2012; Su & Wang, 2016; Welling, 2016).

Rôle de Kir1.1 dans la physiologie et la physiopathologie rénale

Kir1.1 est la première sous-unité Kir à avoir été clonée, depuis les reins de rat et d’Homme. L’homotétramère Kir1.1 est plus connu sous le nom lui ayant été initialement donné de canal ROMK (« Rat Outer-Medullary K+ »). Au total, six variants d’épissage de KCNJ1 ont été identifiés, qui codent pour 3 isoformes appelée Kir1.1a, Kir1.1b et Kir1.1c. Les extrémités N-terminales des isoformes a et c sont plus longues de quelques résidus que celle de l’isoforme b (Ho et al., 1993; Shuck et al., 1994; Kondo et al., 1996). Ces 3 isoformes sont exprimées dans les membranes apicales des cellules de la BAL et des cellules principales du CC, mais dans des segments différents: Kir1.1a est exprimée dans le CC cortical et de la médulla externe, Kir1.1b est exprimée de la BAL au CC cortical et Kir1.1c de la BAL au TCD2 [Voir Figure 8, 9 et 14] (Boim et al., 1995; Mennitt et al., 1997; Xu et al., 1997; Kohda et al., 1998; Hebert et al., 2005; Hibino et al., 2010; Wade et al., 2011; Hamilton & Devor, 2012).
L’importance du canal Kir1.1 dans le fonctionnement du néphron a été rapidement souligné lorsque des mutations inactivatrices de KCNJ1 ont été découvertes chez des patients atteints du « syndrome de Bartter » (SB). Ces mutations peuvent affecter la phosphorylation, l’adressage, la stabilité ou les propriétés électrophysiologiques du canal Kir1.1 (Simon et al., 1996a; ICSGFBL, 1997; Jeck et al., 2001; Peters et al., 2003; Hibino et al., 2010).

Identité des canaux potassiques apicaux du tubule proximal

La membrane apicale du TP contient plusieurs canaux potassiques [voir Figure 16]. Chez le lapin et la souris, différents canaux ayant des conductances unitaires de 30, 40, 60 et 200-300 pS y ont été enregistrés (Gogelein, 1990; Hebert et al., 2005). Le canal de 200-300 pS est identifié comme Maxi-K, canal activé par la dépolarisation et le gonflement cellulaire généralement fermé (Zweifach et al., 1991). Sur une lignée cellulaire de TP humain, un canal Kir de 42 pS sensible à l’ATP a été observé (Nakamura et al., 2001). Chez la souris et le rat un canal de 12 pS appelé MinK, constitué du duo de protéines KCNQ1/KCNE1, forme un canal potassique apical (Sugimoto et al., 1990; Vallon et al., 2001). L’importance de MinK est illustrée par les pertes urinaires modérées de NaCl, d’acides aminés et de glucose des souris invalidées pour KCNE1 (Vallon et al., 2001). Cependant KCNQ1 n’est pas toujours rapportée dans le TP (Zheng et al., 2007). Le canal KCNA10 de 10-12 pS est lui aussi exprimé dans la membrane apicale du TP de rat: stimulé par la dépolarisation, il pourrait coupler son activité a l’entrée apicale du sodium (Yao et al., 2002). Enfin, le canal potassique TWIK-1 a été immunomarqué dans la bordure en brosse du TP de souris (Cluzeaud et al., 1998) et les souris invalidées pour TWIK-1, qui expriment moins de Napi-2 à la surface de leurs cellules, ont une capacité de réabsorption proximale des phosphates réduite [Voir Figure 4] (Nie et al., 2005).

Identité des canaux potassiques basolatéraux du tubule proximal

Plusieurs canaux potassiques basolatéraux du TP décrits fonctionnellement ne sont toujours pas identifiés: ils possèdent des conductances unitaires de 12, 36, 46, 54 et 60 pS (Gogelein & Greger, 1987; Gogelein, 1990; Noulin et al., 1999; Hamilton & Devor, 2012). Inversement, la conductance de THIK-2, canal potassique immunomarqué du coté basolatéral du TP de souris, n’a pas été rapportée (Theilig et al., 2008). Chez le lapin, un canal Kir peu actif de 50-60 pS inhibé par l’ATP intracellulaire a été décrit. Il s’agirait de Kir6.1: l’ARNm de Kir6.1 est présent dans le TP de lapin et le canal est inactif en présence d’un sulfonylurée, inhibiteur des protéines SUR associées aux sous-unités Kir6.x (Tsuchiya et al., 1992; Hurst et al., 1993; Noulin et al., 1999). Son rôle est toutefois incertain: il pourrait n’être exprimé que dans les mitochondries et/ou n’être actif qu’en cas d’hypoxie (Reeves & Shah, 1994; Zhou et al., 2007). Finalement, les souris n’exprimant pas Kir6.1 n’ont pas de phénotype rénal évident, bien qu’elles présentent des lésions inflammatoires rénales (Kane et al., 2006; Li et al., 2015).
TASK-2 est un canal potassique clairement identifié dans la membrane basolatérale du TP, activé par l’alcalinisation extracellulaire et le gonflement cellulaire (Niemeyer et al., 2001; Warth et al., 2004). Les souris n’exprimant pas TASK-2 présentent une légère augmentation de leur diurèse et de leur natriurèse, ainsi qu’une difficulté à réabsorber les ions HCO3- filtrés, qui s’accompagne d’une faible acidose métabolique proximale. Ce phénotype serait la conséquence d’un couplage entre l’activité de TASK-2 et NBCe-1A: TASK-2 maintien le potentiel de membrane négatif nécessaire à NBCe-1A tandis que NBCe-1A, qui réabsorbe les ions HCO3-, active TASK-2 en augmentant le pH interstitiel (Warth et al., 2004; Sepulveda et al., 2015).
Plusieurs des canaux K+ basolatéraux non-identifiés du TP de lapin sont rectifiants entrants, possèdent une conductance de 50-60 pS et sont inhibés par les protons intracellulaires (Gogelein & Greger, 1987; Parent et al., 1988; Gogelein, 1990; Beck et al., 1993). Si le canal Kir7.1 a pu être observé dans la membrane basolatérale du TP de hamster, sa conductance de 50 fS est trop faible pour correspondre à ces canaux Kir non-identifiés (Derst et al., 2001a; Hibino et al., 2010). Au contraire, les canaux non-identifiés ont des propriétés similaires à celles de l’hétérotétramère Kir4.2/Kir5.1 in vitro (voir Section Introduction B.I.2.d). Or Kir5.1 a parfois été rapportée dans le TP et les souris invalidées pour Kir5.1 ont une ammoniurie faible qui pourrait être le signe d’un défaut d’ammoniogenèse proximale (voir Section Introduction A.II.4.b) (Tucker et al., 2000; Derst et al., 2001b; Paulais et al., 2011). Kir5.1 n’étant active qu’associée à Kir4.1, qui n’est pas exprimée dans le TP, ou à Kir4.2 qui y est possiblement (voir Section Introduction B.II.1.d), un canal Kir4.2/Kir5.1 pourrait être exprimé dans la membrane basolatérale des cellules du TP [Voir Figure 16] (Ito et al., 1996; Chabardes-Garonne et al., 2003; Hibino et al., 2004a; Lachheb et al., 2008; Bockenhauer et al., 2009; Zhang et al., 2015).

Modèles cellulaires d’expression transitoire de Kir4.2 et Kir5.1

L’expression hétérologue de sous-unité Kir dans la lignée cellulaire OK a été permise par l’utilisation de plasmides appelés pCDNA3-rKir5.1 et pBF-mKir4.2, qui nous ont été fournis par le Pr. Stephen J. Tucker (Université d’Oxford, Grande Bretagne). Le premier plasmide est un vecteur d’expression de 5.4 kb qui contient la séquence codante de Kir5.1 du rat dans son site de multi-clonage (SMC), situé en aval du promoteur du Cytomégalovirus (CMV), ainsi qu’une cassette de résistance à l’ampiciline (AmpR) placée en aval d’un promoteur AmpR [voir Figure 17]. Le plasmide pBF contient la séquence codante de Kir4.2 de souris mais ne permet son expression hétérologue que dans l’ovocyte de Xénope (voir section Matériel et Méthodes n°2 I.1). Avec l’aide du Dr. Olivier Lahuna (Institut Cochin, Paris, France), la séquence codante de Kir4.2 a été sous-clonée entre 2 sites de restriction du SMC d’un plasmide pCDNA3 [voir Figure S5 dans l’article], générant un plasmide d’expression de Kir4.2 de 6.9 kb appelé pCDNA3-mKir4.2 [voir Figure 17]. Les séquences des sous-unités Kir des plasmides pCDNA3 ont été entièrement séquencées avant utilisation (GATC Biotech, Allemagne).

Analyses des recueils urinaires et des prélèvements sanguins

Les prélèvements de sang veineux rétro-orbitaux ont immédiatement été analysés à l’aide d’un automate epoc blood system analysis (Alere) qui permet de mesurer le pH, l’hématocrite, la glycémie, la lactatémie, la pO2, la pCO2, les concentrations en ions Cl-, HCO3-et en Ca2+ ionisé. Le plasma et l’urine ont été analysés à l’aide d’un automate Konelab 20i Analyzer (ThermoFischer) qui permet de mesurer les concentrations en créatinine, en protéine, en urée et en ions Mg2+, Ca2+ ou phosphates. Leurs contenus en ions Na+ et K+ ont été mesurés à l’aide d’un photomètre de flamme Sherwood 420 (Servilab).
Le pH urinaire a été déterminé à l’aide d’un pH-mètre (Metrohm) relié à une électrode de petit diamètre. Les concentrations urinaires en ions NH4+ et en acidité titrable ont été dosées avec un titrateur DL55 (Mettler Toledo). L’osmolarité urinaire a été mesurée grâce à un osmomètre à point de congélation Autocal 13DR (Hermann Rœbling) sur des urines diluées 10 fois dans de l’eau déminéralisée. Enfin, l’aldostérone urinaire a été dosée par Geneviève Escher de l’équipe du Pr. Bruno Vogt (Département de Néphrologie et Hypertension, Berne, Suisse).
Toutes ces mesures ont permis de calculer un trou anionique plasmatique ou d’estimer un DFG en μl/minute selon les formules [Na+]+[K+]–[Cl-]–[HCO3-] et [créatinine urinaire(mM)*Débit urinaire(μl/min)/(créatinine plasmatique(μM)*1000, respectivement.

Analyses biochimiques et moléculaires

L’extraction d’ARNm a été réalisée par création d’une phase d’acides nucléiques, à l’aide de 1-bromo-3-chloropropane, dans le surnageant d’un lysat de rein total broyé dans du TRI Reagent (ThermoFischer). Cette phase a été précipitée au 2-propanol, lavée à l’éthanol et traitée par une DNAse. Enfin, les ARNm ont été purifiés à l’aide du kit « RNeasy Mini Kit » (Qiagen). L’extraction d’ARNm depuis des segments du néphron a nécessité l’exsanguination d’un rein d’une souris sacrifiée par injection locale d’un milieu Leibovitz L-15 (ThermoFischer) supplémenté avec 300 U/ml de collagénase. La capsule et les pôles du rein prélevé ont été retirés, puis l’organe a été découpé en tranches de 1 mm dans l’axe cortico-papillaire. La médulla et le cortex ont été séparés et les fragments mis à incuber 45 minutes à 37 °C dans le milieu Leibovitz (Sigma-Aldrich) (Teulon et al., 1987; Lourdel et al., 2002). La collagénase dégrade les membranes basales du néphron, ce qui permet la microdissection manuelle, sous loupe binoculaire, des segments du néphron selon des critères d’identification morphologiques. Pour chaque souris, 50 fragments de chaque segment ont été isolés. Leur longueur totale (en mm) a été déterminée à l’aide d’un logiciel à partir de photographies. Ils ont ensuite été lysés dans un volume précis de tampon, puis une extraction d’ARNm a été réalisée par réaction avec de l’acide guanidinium-thiocyanate, du phénol et du chloroforme (Chabardes et al., 1996).
Les ARNm extraits subissent ensuite une rétro-transcription (RT) à l’aide d’amorces hexamériques aléatoires et de la Reverse Transcriptase du kit « Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit » (Roche). Les ADNc obtenus ainsi ont été dilués en gamme puis amplifiés par PCR quantitative (qPCR) à l’aide du kit « Lightcycler 480 SYBR Green I Master » (Roche) et d’une machine de PCR en temps réel LIGHTCYCLER 480 (Roche) selon les recommandations du fabriquant. Les qPCR ont été réalisées avec des amorces conçues pour être spécifiques des ADNc désirés [voir Tableau S2 dans l’article]. Par ailleurs, des contrôles négatifs ont été réalisés, sans ADNc ou sur des échantillons rétro-trancrits sans enzyme. L’analyse quantitative en temps réel est basée sur la comparaison du nombre de cycles de PCR nécessaire à la détection de l’ADNc désiré par rapport à celui d’un ADNc contrôle (RPL26), dans chaque échantillon et dans une gamme d’ADNc. Les résultats sur rein total ont été obtenus depuis des ARNm extraits et rétro-transcrits en même temps, chez des souris Kcnj15-/- et Kcnj15+/+ issues des mêmes périodes expérimentales de cage à métabolisme (voir section Matériel et Méthodes n°1 II.1).

Extraction et déglycosylation des protéines

L’extraction des protéines totales issues des organes prélevés et cryoconservés ou des cellules OK transfectées a été réalisée par lyse mécanique et incubation à 4 °C dans un tampon de lyse contenant (en mM): 150 NaCl, 50 Tris, 1 EDTA, supplémenté soit par 0.1 % de SDS et 1 % de Triton-X100, soit par 0.2 % de SDS et 1 % de NP-40, respectivement. Les tampons de lyse contenaient également un mix d’inhibiteurs de protéases « Complete EDTA Free protease inhibitor mix » (Sigma-Aldrich). Après centrifugation à 5000 g et 4 °C durant 10 minutes, les surnageants protéiques ont été dosés par spectrophotométrie à l’aide du kit « BCA Protein Assay quantification kit » (Pierce) et d’une gamme étalon de BSA, puis stockés à -80 °C.
Les déglycosylations ont été réalisées à l’aide des endoglycosidases EndoH ou PNGaseF (New England Biolabs) sur 80 µg de protéines issues d’organes ou 12 µg de protéines issues de cellules OK. La 1ère enzyme clive uniquement les N-glycosylations riches en mannoses qui sont spécifiques d’une étape de maturation dans le RE, tandis que la 2nde enzyme clive ces mêmes glycosylations riches en mannoses et les N-glycosylations complexes ajoutées progressivement dans l’appareil de Golgi et qui subsistent chez la protéine mature [voir Figure 19]. Pour réaliser les déglycosylations, les protéines ont été dénaturées 10 minutes à 50 °C dans une solution contenant 40 mM de DTT et 2 % de SDS, puis incubées durant 1 heure à 37 °C dans une solution contenant un tampon enzymatique et 25 U/µl de PNGaseF + 1 % de NP-40 ou 17 U/µl d’EndoH.

Co-immunoprécipitation des sous-unités Kir depuis le tissu rénal

La co-immunoprécipitation a été réalisée à l’aide du kit « Pierce Co-immunoprecipitation kit » (ThermoFisher) selon les recommandations du fabriquant, à partir de protéines extraites dans un tampon de lyse contenant 0.02 % de sodium azide et 0.5 % de sodium-deoxycholate (Tanemoto et al., 2000), depuis un rein fraichement prélevé de souris sauvage. Brièvement, 1.5 mg de protéines rénales ont été incubés durant une nuit à 4 °C avec des billes d’agaroses sur lesquelles 15 µg d’anticorps sc-22434 de chèvre anti-Kir5.1 (Santa Cruz) ont été fixés. Après précipitation par centrifugation, lavage et élution de Kir5.1 et des protéines co-immunoprécipitées avec elle, un quart de l’éluât précipité a permis à la réalisation d’un Western blot révélant Kir5.1 et Kir4.2 avec les anticorps sc-2005 de chèvre anti-souris ou HPA-016702 de lapin anti-Kir4.2 (Sigma-Aldrich). La réaction contrôle a été réalisée par incubation des protéines dans des billes sans anticorps.

Marquages fluorescents et histochimiques de coupes de rein

Chez des souris Kcnj15-/- ou Kcnj15+/+ sacrifiées, les reins ont été exsanguinés et fixés par perfusion intracardiaque de PBS + 4 % de paraformaldéhyde, puis prélevés. Les reins ont ensuite été découpés en blocs transversaux de 2 mm d’épaisseur et inclus en paraffine, ou lavés à 4 °C dans du PBS. Afin d’être congelés, les blocs lavés sont collés sur du liège à l’aide du « Tissue-Tek OCT Compound » (Sakura). La congélation des blocs ainsi obtenus est réalisée par 20 secondes d’immersion dans de l’isopentane refroidit à l’azote liquide, suivie d’une immersion prolongée dans de l’azote liquide. Les blocs congelés sont finalement conservés à -80 °C.
Les marquages fluorescents ont été effectués sur des coupes transversales de 7 µm d’épaisseur posées sur lame de verre, réalisées au cryostat dans les blocs de rein congelés. Ces coupes ont été incubées 1 heure dans du PBS contenant 10 % de sérum de chèvre (Sigma-Aldrich) afin de bloquer les sites de fixation non-spécifiques des anticorps. Elles ont alors été exposées durant une nuit à 4 °C avec les anticorps APC-058 de lapin anti-Kir4.2 (Alomone Labs; 1:500) ou APC-123 de lapin anti-Kir5.1 (Alomone Labs; 1:250), dilués dans la solution de blocage. Elles ont ensuite été lavées 3 fois 10 minutes au PBS et placées durant 2 heures à température ambiante dans la solution de blocage contenant du DAPI (1 µg/ml), de la Phalloidine-488 (Cytoskeleton; 1:250) et l’anticorps fluorescent A31572 d’âne anti-lapin AlexaFluor555 (ThermoFisher; 1:1000). Le DAPI est un intercalant fluorescent de l’ADN tandis que la phalloidine-488 rends l’actine fluorescente. Sur le tissu rénal, le marquage de l’actine rend fortement fluorescente la bordure en brosse des cellules proximales. Après lavage au PBS, les coupes sont montées sous lamelle dans un milieu « Glycergel mounting medium » (DAKO). Des coupes transversales de 7 μm d’épaisseur, réalisées au microtome depuis le tissu inclus en paraffine, ont été colorées durant quelques secondes à l’Hématoxyline. Les résultats ont été photographiés à l’aide d’un microscope confocal LSM710 ou d’un scanner automatique de lame Axio Scan.Z1 (Zeiss). Les profils d’expression intracellulaire ont été déterminés via l’analyse d’une quinzaine de TP à l’aide du logiciel Zen Blue (Zeiss) et sont exprimés en % de l’intensité maximum observée sur l’axe a-b de 20 μm, auquel est soustrait le bruit de fond.

Kir5.1 permet la maturation N-glycosidique de Kir4.2

Un élément supplémentaire renforce l’idée que Kir4.2 et Kir5.1 sont associées en un hétérotétramère Kir4.2/Kir5.1 dans le TP de souris. En effet, en Western blot depuis des protéines rénales de souris Kcnj15+/+, Kir4.2 est révélée à 3 poids moléculaires différents: 36, 39 et de 48 à 55 kDa [voir Figures 3A-B dans l’article]. La sous-unité est également immunomarquée à ces 3 poids moléculaires lorsqu’elle est surexprimée dans la lignée rénale d’origine proximale OK [voir section Matériel et Méthodes n°1 I.2]. De plus, dans ces cellules la co-expression de Kir5.1 avec Kir4.2 augmente fortement l’expression de la forme 48-55 kDa de Kir4.2 [voir Figure 3D dans l’article]. Inversement, des Western blots réalisés sur des protéines rénales de souris invalidées Kcnj16-/- montrent qu’en l’absence de Kir5.1, la forme 48-55 kDa de Kir4.2 n’est pas présente [voir Figure 3C dans l’article]. Or, via l’utilisation de la N-glycosidase PNGaseF, nous avons montré que dans les reins, les poumons et l’estomac les bandes de poids moléculaire supérieur à 36 kDa sont des formes N-glycosylées de Kir4.2 [voir Figure 3B dans l’article]. Dans les cellules OK, la bande immunoréactive à 39 kDa est sensible à l’endoglycosidase EndoH qui retire spécifiquement la N-glycosylation riche en mannose, alors que la forme à 48-55 kDa n’est sensible qu’a l’endoglycosidase PNGaseF qui clive aussi les glycosylations complexes des résidus [voir Figure 3D dans l’article]. La bande de 39 kDa correspond donc à la forme core-glycosylée de Kir4.2 (présente transitoirement dans le RE) tandis que les bandes de 48-55 kDa correspondent à sa forme complexe-glycosylée. Chez les Kir et les protéines de la voie de sécrétion, cette dernière forme est présente dans le compartiment final d’adressage, soit dans notre cas la membrane plasmique [voir Figure 19] (voir section Introduction B.I.2.c). L’ensemble de ces résultats montre que la maturation de Kir4.2, pré-requis et témoin de son adressage à la membrane plasmique, requiert l’expression de Kir5.1 à partir du RE, qui est le compartiment d’hétérotétramérisation des Kir.

L’absence de Kir4.2 provoque une acidose tubulaire proximale isolée

Dans un second temps nous avons comparé les phénotypes et les fonctions rénales des souris Kcnj15-/- et Kcnj15+/+. Pour cela, les souris ont été placées en cage à métabolisme et leurs urines, leurs plasmas et leurs sangs ont été prélevés puis analysés (voir section Matériel et Méthodes n°2 II). L’aspect, l’espérance de vie et le poids des souris Kcnj15-/- sont normaux [voir Figure S3 dans l’article]. De même, le poids du rein, la morphologie générale et l’aspect du parenchyme rénal sont inchangés en l’absence de Kir4.2 [voir Figure S4 dans l’article].
De plus, les prises d’eau ou de nourriture, le volume urinaire quotidien et le DFG (estimé par la clairance de la créatinine plasmatique) des souris Kcnj15-/- sont équivalents à ceux des souris sauvages. Les concentrations urinaires (normalisées par la créatinine) et plasmatiques des ions Na+, K+, Mg2+, des protéines, de l’aldostérone et du glucose ne sont pas modifiées par l’absence de Kir4.2 [voir Tableaux 1 et 2 dans l’article]. Les souris invalidées génétiquement pour Kcnj15 n’ont donc pas d’insuffisance rénale, de glomérulopathie ou de tubulopathie entraînant une diurèse ou une natriurèse excessive à l’origine d’une activation du système RAA. L’absence de PiBPM, de glycosurie et de phosphaturie montre que les souris Kcnj15-/- ne développent pas non plus de syndrome de Fanconi (voir section Introduction A.II.5.a).
En revanche, l’absence de Kir4.2 modifie l’équilibre acido-basique des souris. En effet, les souris Kcnj15-/- développent spontanément une acidose métabolique hyperchlorémique d’origine tubulaire proximale (pRTA) (voir section Introduction A.II.5.a). Celle-ci se traduit par une diminution du pH sanguin, d’une réduction de 2 mmoles/L de la bicarbonatémie et d’une augmentation équivalente de la chlorémie. Dans le même temps, l’ENA des souris Kcnj15-/- et l’ammoniurie ne sont pas augmentées malgré l’acidose. Contenant toutefois plus d’ions H+ libres ou conjugués à des acides faibles, l’urine des souris Kcnj15-/- a un pH inférieur à celui de l’urine des souris sauvages [voir Figure 4 dans l’article]. L’origine métabolique de l’acidose est déduite de l’hyperchlorémie, tandis que le pH urinaire bas des souris Kcnj15-/- démontre la capacité de leurs CC à acidifier l’urine en sécrétant des protons dans la lumière tubulaire. Enfin, la pRTA des souris Kcnj15-/- est assortie d’une faible augmentation de la calcémie, d’une calciurie doublée et d’une augmentation de 20 % de l’urémie [voir Tableaux 1 et 2 dans l’article].
Afin d’établir si la pRTA des souris Kcnj15-/- est liée à une ammoniurie inappropriée, nous avons analysé leur fonction rénale durant une charge acide élevée et chronique. Pour cela, 0.28M de NH4Cl ont été ajoutées dans l’eau de boisson des souris (voir section Introduction A.II.4.c). En théorie, cette charge est censée provoquer une acidose métabolique, qui peut être compensée en quelques jours par une hausse de l’amoniogénèse proximale, de l’ammoniurie et in fine de l’ENA (Nowik et al., 2010). En pratique, les souris Kcnj15+/+ ont bien subi une telle acidose, qu’elles ont complètement compensée en 8 jours. En revanche, les souris Kcnj15-/ ont vu leur pRTA être durablement accentuée [voir Figure 4A dans l’article]. Dans le même temps, alors qu’elles ont été capables d’acidifier leurs urines, leur ENA et leur ammoniurie étaient plus faibles que celles des souris sauvages [voir Figure 4B-C dans l’article]. Enfin, la charge acide a multiplié par 5 leur calciurie et par 3 celle des souris sauvages [voir Tableau S1 dans l’article].

L’absence de Kir4.2 réduit l’ammoniogénèse proximale

Les souris Kcnj15-/- excrètent difficilement une charge acide, ce que traduit leur acidose métabolique hyperchlorémique. Cette acidose est accompagnée d’un pH urinaire faible, signe d’une bonne aptitude du néphron distal à acidifier l’urine. Pourtant, l’ENA des souris Kcnj15-/-est inappropriée compte tenu de leur acidose, du fait d’une ammoniurie faible [voir Figure 4D dans l’article]. Or, l’ammoniurie nécessite en premier lieu la formation d’ions NH4+ ou ammoniogénèse, majoritairement par les cellules du TP où est exprimée Kir4.2. Le TP est, de plus, le seul segment du néphron impliqué dans l’augmentation de l’ammoniogénèse lors d’une charge acide élevée. Les données de la littérature montrent que cette augmentation est permise par une surexpression rapide au niveau transcriptionnel du transporteur basolatéral SNAT3 de la glutamine (substrat de l’ammoniogénèse) ainsi que des enzymes PDG, GDH et PEPCK de l’ammoniogénèse dans le TP, en réponse à une diminution du pH intracellulaire (voir section Introduction A.II.4). C’est pourquoi nous avons déterminé l’expression transcriptionnelle de gènes impliqués dans l’ammoniogénèse, par RT-qPCR depuis du tissu rénal de souris sauvages ou Kcnj15-/- placées en régime normal ou en charge acide élevée durant 2 jours.
Nos résultats montrent qu’en régime normal, l’expression de SNAT3 est 25 % plus faible chez les souris Kcnj15-/- que chez les souris sauvages. De plus, alors que cette expression est fortement stimulée dans les deux groupes par la charge acide élevée, elle reste 60% plus faible chez les souris invalidées [voir Figure 6A dans l’article]. En revanche, les expressions des transporteurs de glutamine B0AT1 (apical) et LAT2 (basolatéral) sont à peine stimulées par l’acidose et ne sont pas réduites chez les souris Kcnj15-/-. Chez les souris Kcnj15+/+, la transcription des ARNm de la PEPCK, de la PDG et de la GDH est augmentée par l’acidose. Toutefois, chez les souris Kcnj15-/-, l’ARNm de la PEPCK est 2 fois moins exprimé que chez les souris sauvages, en régime normal ou en charge acide élevée. Chez ces souris invalidées, l’expression de l’ARNm de la PDG n’est pas stimulée lors de la charge acide et celle de la GDH l’est trop faiblement pour atteindre le même niveau que chez les souris sauvages [voir Figure 6A dans l’article]. Enfin, l’expression protéique de NHE3, stimulée dans les 2 groupes de souris en charge acide élevée, n’est pas modifiée par l’absence de Kir4.2 [voir Figure 6B dans l’article].

Table des matières

AVANT-PROPOS
A. INTRODUCTION GÉNÉRALE
I. Généralités de physiologie rénale
1. Anatomie rénale
a. Organisation du parenchyme rénal
b. Le néphron et l’interstitium
2. Fonction rénale
II. Le tubule proximal
1. Ultrastructure du tubule proximal et de ses cellules épithéliales
2. Les transports transépithéliaux du tubule proximal
a. Revue des principaux transports impliqués dans la réabsorption proximale
b. Régulation des activités de réabsorption du tubule proximal
3. L’endocytose des protéines filtrées par le tubule proximal
4. Rôles du tubule proximal dans le maintien de l’équilibre acido-basique
a. Rôles du tubule proximal dans la réabsorption des tampons plasmatiques
b. Rôle de l’ammoniogénèse proximale dans l’excrétion urinaire nette d’acide
c. Régulation des transports proximaux et de l’ammoniogenèse par l’acidose
5. Aperçu de physiopathologie et de pharmacologie du tubule proximal
a. Les différentes formes d’atteinte des fonctions du tubule proximal
b. L’acidose tubulaire rénale proximale au sein des acidoses métaboliques
c. Le tubule proximal est une cible et un effecteur pharmacologique
III. Les segments distaux du néphron
1. Aperçu des principaux transports transépithéliaux du néphron distal
2. Régulations physiologiques des activités de transport du néphron distal
B. PREMIÈRE ÉTUDE: IMPLICATION DE LA PROTÉINE Kir4.2 DANS LA PHYSIOLOGIE RÉNALE INTRODUCTION DE LA 1ÈRE ÉTUDE
I. Les canaux potassiques Kir
1. Structure et phylogénie des canaux Kir
2. Propriétés électrophysiologiques et régulations des canaux Kir
a. Propriétés et régulations générales des canaux Kir
b. Règles particulières d’assemblage en tétramère des sous-unités Kir
c. Régulation de l’expression membranaire des canaux Kir
d. Régulations des propriétés électrophysiologiques des canaux Kir
II. Rôles physiologiques et physiopathologiques des canaux Kir
1. Principales fonctions extra-rénales des canaux Kir
a. Rôles des canaux Kir dans la modulation du potentiel de repos
b. Rôles des canaux Kir dans le maintien de l’excitabilité cellulaire
c. Rôles des canaux Kir dans les cellules sensibles au pH
d. Expression et fonctions hypothétiques de Kir4.2 et Kir5.1
2. Rôles des canaux Kir dans la physiologie rénale
a. Revue des sous-unités Kir exprimées dans le tissu rénal
b. Rôle de Kir1.1 dans la physiologie et la physiopathologie rénale
c. Rôle de Kir4.1/Kir5.1 dans la physiologie et la physiopathologie rénale
3. Revue des pathologies monogéniques associées aux canaux Kir
III. Rôles et revue des canaux potassiques du tubule proximal
1. Rôles des canaux potassiques du tubule proximal
2. Revue des canaux potassiques du tubule proximal
a. Identité des canaux potassiques apicaux du tubule proximal
b. Identité des canaux potassiques basolatéraux du tubule proximal
MATÉRIEL ET MÉTHODES N°1
I. Modèles d’étude
1. Modèle murin génétiquement invalidé pour Kcnj15
2. Modèles cellulaires d’expression transitoire de Kir4.2 et Kir5.1
II. Analyses métaboliques
1. Phénotypage et analyse de la fonction rénale en cage à métabolisme
2. Analyses des recueils urinaires et des prélèvements sanguins
III. Analyses biochimiques et moléculaires
1. Extractions d’ARNm et RT-qPCR
2. Extraction et déglycosylation des protéines
3. Immunomarquage des protéines par Western blot
4. Co-immunoprécipitation des sous-unités Kir depuis le tissu rénal
5. Marquages fluorescents et histochimiques de coupes de rein
IV. Présentation et analyse statistique des résultats
RÉSULTATS DE LA 1ÈRE ÉTUDE
I. Article n°1
II. Résumé de l’article n°1
1. Kir4.2 et Kir5.1 s’associent du coté basolatéral du tubule proximal
2. Kir5.1 permet la maturation N-glycosidique de Kir4.2
3. L’absence de Kir4.2 provoque une acidose tubulaire proximale isolée
4. L’absence de Kir4.2 réduit l’ammoniogénèse proximale
DISCUSSION DE LA 1ÈRE ÉTUDE
I. Invalider Kir4.2 ou Kir5.1 affecte l’ammoniurie et la calciurie
II. KCNJ15 est un gène candidat pour l’acidose proximale isolée
III. Mécanisme physiopathologique et rôle hypothétique de Kir4.2
C. SECONDE ÉTUDE: ANALYSE D’UN MUTANT DE ClC-5 IMPLIQUÉ DANS LA MALADIE DE DENT INTRODUCTION DE LA 2NDE ÉTUDE
I. La Maladie de Dent
1. Aspects cliniques de la Maladie de Dent
2. Déterminants génétiques de la Maladie de Dent
II. L’échangeur ClC-5 et la famille des ClC
1. Découverte et phylogénie des transporteurs de la famille ClC
2. Structure des transporteurs de la famille ClC
3. Propriétés electrophysiologiques et régulations des ClC
a. Le slow gating et le fast gating de ClC
b. Le couplage du transport des ions Cl- et H+ chez les échangeurs ClC
c. Principales régulations électrophysiologiques des transporteurs ClC
d. La régulation des ClC par des sous-unités β et les domaines CBS
4. Revue des rôles physiologiques et physiopathologiques des ClC
a. Profil d’expression et rôles connus des transporteurs ClC
b. Récapitulatif des rôle physiologiques et physiopathologiques des ClC
III. Physiopathologie de la Maladie de Dent de type I
1. Profil d’expression physiologique et pathologique de ClC-5
a. Profil d’expression tissulaire de l’échangeur ClC-5
b. Classification des mutants de ClC-5 par leur adressage et leur activité in vitro
2. Physiopathologie de la Maladie de Dent de Type I
a. Phénotype des modèles murins invalidés pour Clcn5
b. Modifications structurelles et moléculaires en l’absence de ClC-5
c. Mécanismes physiopathologiques impliqués dans la Maladie de Dent
3. Fonctions intracellulaires attribuées à ClC-5 dans le tubule proximal
a. Rôles des transports de ClC-5 dans l’acidification des endosomes précoces
b. Rôles des interactions protéine-protéine de ClC-5 dans le tubule proximal
MATÉRIEL ET MÉTHODES N°2
I. Biologie moléculaire
1. Plasmides
2. Mutagénèse dirigée et amplification bactérienne des plasmides
3. Transcription in vitro du plasmide pTLN
II. Modèles et méthodes d’expression hétérologue
1. Expression hétérologue par injection d’ARNm dans l’ovocyte de Xénope
2. Culture et transfection transitoire des cellules HEK293T
III. Analyses biochimiques de l’expression de ClC-5
1. Mesures de luminescence de surface dans l’ovocyte de Xénope
2. Biotinylation de surface des cellules HEK293T
3. Extraction et dosage des protéines totales et biotinylées
4. Analyse des échantillons protéiques par Western blot
5. Immunofluorescence indirecte sur les cellules HEK293T
IV. Analyses des propriétés de transport de ClC-5
1. Voltage-clamp en double microélectrodes dans l’ovocyte de Xénope
2. Mesures du transport de H+ de ClC-5 dans les cellules HEK293T
3. Détermination du pH endosomal dans les cellules HEK293T
V. Présentation et analyse statistique des données
RÉSULTATS DE LA 2NDE ÉTUDE
I. Article n°2
II. Résumé de l’article n°2
1. Description d’un patient Dent porteur d’une mutation E211G de ClC-5
2. La mutation E211G n’altère ni l’expression ni l’adressage de ClC-5
3. La mutation E211G convertit l’échangeur ClC-5 en canal chlorure
4. Le mutant E211G de ClC-5 permet l’acidification endosomale
DISCUSSION DE LA 2NDE ÉTUDE
I. Conséquences de la substitution du gating glutamate de ClC-5
II. Importance du chlorure dans la fonction endosomale
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES .

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