Soutenance mémoire
LE COMMERCE INTERNATIONAL DU POISSON
Étude de la pérennité des profils DGGE bactériens
Analyse de bars du même lieu mais issus d’aquariums différents
Nous avons travaillé avec des bars provenant de 2 aquariums différents de l’Ifremer Palavas, Montpellier. Les deux aquariums possèdent des circuits d’eau très différents. L’aquarium ASC possède un circuit fermé, il est alimenté par de l’eau de mer qui est filtrée et recyclée en continu. C’est un système fermé comme les aquariums d’une ferme piscicole. Par contre, l’aquarium C1 possède un circuit ouvert ; l’eau est pompée dans la mer au même endroit que l’aquarium ASC, et donc renouvelée en permanence. C’est un système ouvert assimilable à ce qui se passe en mer (Tableau II.1).
Cinq poissons différents par localisation ont été analysés. De plus, pour vérifier la répétabilité et la fiabilité de cette méthode, 3 extractions différentes et 3 amplifications différentes ont été réalisées avec un seul bar de l’aquarium ASC. Tous les amplicons PCR sont ensuite analysés par la DGGE.
Effet des traitements technologiques sur les profils bactériens du poisson
Effet des traitements de filetage, de marinage, de séchage et de réfrigération
Les objectifs sont d’étudier l’impact de la méthode de conservation (réfrigération) et de la transformation (filetage, séchage, marinage) sur l’expression qualitative de la flore bactérienne des filets du poisson.
L’expérience a été réalisée dans des conditions simulées de deux procédés industriels que sont le marinage et le séchage des poissons.
Nous avons réalisé cette expérience avec des tilapias du CIRAD, Montpellier (Tableau II.5.).
Chaque poisson est débité en 2 filets identifiés Fb et Fa. Un filet est traité (Fa), l’autre sert de référence (Fb). Afin de mesurer l’évolution des flores bactériennes du poisson avant et après l’étape de filetage, le poisson est fileté soit sous condition stérile (sous hotte stérile, scalpel stérile) soit fileté sous conditions propres simulant les conditions de l’usine de transformation (Figure II.10.). Nous sommes toutefois conscients que les conditions expérimentales ne sont pas tout à fait équivalentes à ce qui se passe à l’intérieur de l’usine car les contaminations par les bactéries du lieu de travail en condition réelle sont dues à la fois à l’environnement mais aussi aux manipulateurs du poisson. Cette expérimentation permettra cependant de bien appréhender l’effet des traitements humains et de l’environnement sur la flore microbienne présente sur les filets lors des traitements appliqués.
Le marinage a été réalisé dans un bocal hermétique contenant 100 mL de solution de marinage pour 10g de poisson. La solution de marinage est préparée avec de l’acide acétique (60 g/L) (Gazechim, S.A, France) et du sel (50 g/L) (La Baleine, Salin du midi, France). Chaque filet est trempé dans cette solution pendant 1 h et agité manuellement toutes les dix minutes (Figure II.11). Le pH final du filet de poisson est déterminé avec un pH mètre (Bioblock Scientific, UK) sur cinq grammes de filet de poisson broyés dans 50 mL d’eau distillée pendant 2 min. Pour le séchage, le filet a été coupé en morceaux (2x1cm) et mis dans une étuve à 120°C pendant 3 h (Figure II.11). La teneur en eau finale des filets est déterminée par séchage dans une étuve à 105°C jusqu’à poids constant. Pour la réfrigération, le filet a été conservé dans un réfrigérateur à 4°C pendant 2 semaines. (Figure II.11).
Après les traitements, tous les filets de poissons ont été conservés en chambre froide à -20°C jusqu’à l’extraction d’ADN. Trois répétitions ont été réalisées pour chaque traitement.
L’étude des répétitions de cycles a pour but de vérifier la persistance des bactéries chez les poissons lors des congélations et décongélations successives, événements qui peuvent survenir lors de la rupture de la chaîne du froid pendant le transport. Les nombres de cycles appliqués sont de 1, 5, 10 ou 15.
Nous avons réalisé cette expérience avec des tilapias du CIRAD, Montpellier (Tableau II.5).
Chaque poisson est débité en 2 filets identifiés Fb et Fa. Un filet est traité (Fa), l’autre sert de référence (Fb). Le filetage a été réalisé dans des conditions sanitaires très propres équivalentes aux conditions industrielles. Les filets sont placés à l’intérieur de sacs de polyéthylène stérile et scellés à la chaleur. Chaque sachet est bien identifié (noms, dates). Un filet témoin possède un thermocouple chargé de suivre et d’enregistrer la température à cœur lors de la congélation et la décongélation.
Pour suivre les paramètres de traitement, la mesure des températures selon des intervalles de temps programmables est réalisée grâce à une centrale d’acquisition de température multiports (ALMEMO 22-8, France), équipée de thermocouples de type T (cuivre-constantan, de diamètre 1/10ème de mm). La taille et la flexibilité des thermocouples permettent d’instrumenter finement les filets de poissons pour acquérir en cours de congélation et de décongélation la température à cœur.
Une heure avant le début de l’opération, l’enceinte de surgélation (Facis, France) à air pulsé utilisée est mise en marche et la température de consigne fixée à -50°C afin que la température soit stable au moment de l’introduction des échantillons. Les filets sont congelés en 30 min.
La décongélation est réalisée par douchage continu (eau à 20°C environ) des filets emballés jusqu’à ce que la température à cœur du témoin soit positive (environ 15 min). Cette pratique n’est pas forcement la plus hygiénique mais est la plus largement répandue dans l’industrie de transformation des produits de la mer. Après le traitement, tous les filets de poissons ont été conservés en chambre froide à -20°C jusqu’à l’extraction d’ADN. Trois répétitions ont été réalisées pour chaque traitement (Figure II.12).
L’étude de l’effet de la congélation a pour but de vérifier la stabilité des profils microbiens au cours de la congélation, une technique souvent utilisée pour l’exportation des poissons.
Nous avons réalisé cette expérience avec des tilapias du CIRAD, Montpellier (Tableau II.5).
Chaque poisson est débité en 2 filets identifiés Fb et Fa. Le filet Fb a subit immédiatement une extraction d’ADN bactérien total. Le filet Fa est conservé dans une chambre froide à -20°C pendant 3 semaines puis subit une extraction d’ADN bactérien total. Une analyse de PCR-DGGE a ensuite été réalisée pour comparer les profils microbiens des filets Fa et du filet témoin Fb (Figure III.13). Trois répétitions ont été réalisées.
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Table des matières
INTRODUCTION
I. SYNTHÈSE BIBLIOGRAPHIQUE
I.1. SITUATION MONDIALE DU SECTEUR DES PÊCHES ET DE
L’AQUACULTURE
I.1.1 PRODUCTION DES PÊCHES DE CAPTURE
I.1.2. PRODUCTION DE L’AQUACULTURE
I.1.3. UTILISATION DU POISSON
I.1.4. LE COMMERCE INTERNATIONAL DU POISSON
I.2. LE POISSON CHAT PANGASIUS
I.2.1. GÉNÉRALITÉS
I.2.2. LA PANGASICULTURE DANS LE DELTA DU MÉKONG AU VIETNAM
I.2.3. LA GUERRE DU CATFISH
I.3. LE TILAPIA
I.3.1. GÉNÉRALITÉS
I.3.2. LE MARCHÉ DES TILAPIAS
I.4. LE BAR
I.4.1. GÉNÉRALITÉS
I.4.2. LE MARCHÉ DU BAR
I.5. DIVERSITÉ DE LA FLORE MICROBIENNE DU POISSON
I.5.1. LES BACTÉRIES DES ŒUFS DU POISSON
I.5.2. LES BACTÉRIES DE LA LARVE DU POISSON
I.5.3. LES BACTÉRIES DU POISSON MATURE
I.6. FACTEURS INFLUENÇANT LA DIVERSITÉ DE LA MICROFLORE BACTÉRIENNE DU POISSON
I.6.1. INFLUENCE DE LA QUALITÉ DE L’EAU
I.6.2. INFLUENCE DE LA SALINITÉ DE L’EAU
I.6.3. INFLUENCE DE LA TEMPÉRATURE DE L’EAU ET DES SAISONS
I.6.4. INFLUENCE DU RÉGIME ALIMENTAIRE
I.6.5. INFLUENCE DE L’UTILISATION DES ANTIBIOTIQUES
I.6.6. INFLUENCE DES FACTEURS DANS LES PROCÉDÉS DE TRANSFORMATION
I.6.6.1. Effet du froid
I.6.6.2. Effet du traitement thermique
I.6.6.3. Effet du séchage et du salage
I.6.6.4. Effet du fumage
I.6.6.5. Effet du marinage (acidification)
I.6.6.6. Effet synergique par association de différents procédés
I.7. LA TRAÇABILITÉ
I.7.1. DÉFINITION
I.7.2. IMPORTANCE DE LA TRAÇABILITÉ EN AGRO-ALIMENTAIRE
I.7.3. LÉGISLATION EUROPÉENNE POUR LA TRAÇABILITÉ
I.7.4. LA TRAÇABILITÉ DU POISSON ET DES PRODUITS HALIEUTIQUES
I.8. DÉTERMINATION DE L’ORIGINE GÉOGRAPHIQUE
I.8.1. OBJECTIF
I.8.2. MÉTHODES ANALYTIQUES PERMETTANT LA DÉTERMINATION DE L’ORIGINE GÉOGRAPHIQUE
I.8.2.1. Eléments minéraux et oligoéléments
I.8.2.2. Les isotopes stables
I.8.2.3. Composition chimique globale ou analyse des constituants majeurs
I.8.2.4. Composés volatils
I.8.2.5. Détermination génétique des animaux
I.8.2.6. Profil microbiologique
I.8.2.7. Analyse de la résistance aux antibiotiques
I.9. MÉTHODES D’ANALYSE DE LA BIODIVERSITÉ MICROBIENNE
I.9.1. MÉTHODES TRADITIONNELLES
I.9.2. MÉTHODE DE CULTURE-INDÉPENDANTE
I.10. LES ACIDES NUCLÉIQUES ET LES TECHNIQUES DE BIOLOGIE MOLÉCULAIRE EN ÉCOLOGIE MICROBIENNE
I.10.1. LE DÉVELOPPEMENT DES TECHNIQUES MOLÉCULAIRES
I.10.2. ETUDE DES ARN RIBOSOMIQUES (ARNR)
I.10.3. LE CHOIX DE L’ARNR 16S
I.10.4. LES TECHNIQUES MOLÉCULAIRES DITES D’« EMPREINTE GÉNÉTIQUE »
I.11. LA MÉTHODE DE PCR-DGGE
I.11.1. PRINCIPE
I.11.2. LES APPLICATIONS DE LA PCR-DGGE
I.11.2.1. Étude de la biodiversité de la communauté microbienne dans l’environnement
I.11.2.2. Suivi et identification de la communauté microbienne au cours des fermentations
I.11.2.3. Contrôle de qualité des produits alimentaires
I.11.2.4. Authentification et identification d’origine géographique
I.11.3. LES LIMITES DE LA PCR-DGGE
I.11.3.1. Echantillonnage et conservation des échantillons
I.11.3.2. Extraction des acides nucléiques
I.11.3.3. Amplification par PCR
I.11.3.4. La DGGE
I.11.3.5. Limite de la détection bactérienne
I.12. REP PCR (REPETITIVE ELEMENT SEQUENCE-BASED POLYMERASE CHAIN REACTION)
I.12.1. TECHNIQUE
I.12.2. APPLICATIONS DE LA REP-PCR
II. MATÉRIELS ET MÉTHODES
II.1. ÉCHANTILLONNAGE DES POISSONS
II.1.1. ÉCHANTILLONNAGE DES BARS DE FRANCE
II.1.2. ÉCHANTILLONNAGE DES POISSONS-CHATS PANGASIUS AU VIETNAM
II.1.3. ÉCHANTILLONNAGE DES POISSONS-CHATS PANGASIUS AU CAMBODGE
II.1.4. ÉCHANTILLONNAGE DE L’EAU DE L’ÉTANG D’ÉLEVAGE DES POISSONS-CHATS
PANGASIUS AU VIETNAM
II.1.5. ÉCHANTILLONNAGE POUR L’ÉTUDE DE L’ENVIRONNEMENT DE TRAVAIL DANS UNE USINE DU VIETNAM
II.1.6. ÉCHANTILLONS DE TILAPIAS
II.2. EXTRACTION DE L’ADN BACTÉRIEN TOTAUX DES POISSONS
II.2.1. PROTOCOLE D’EXTRACTION
II.2.2. VÉRIFICATION DE L’EXTRACTION D’ADN SUR GEL D’AGAROSE
II.3. AMPLIFICATION DES ADN EXTRAITS PAR RÉACTION DE
POLYMÉRISATION EN CHAÎNE (PCR)
II.3.1. AMORCES UTILISÉES
II.3.2. PRÉPARATION DU MÉLANGE RÉACTIONNEL DE PCR
II.3.3. CONDITION DE LA PCR ET APPAREILLAGE
II.3.4. VÉRIFICATION DES PRODUITS PCR
II.4. ÉLECTROPHORÈSE EN GEL D’ACRYLAMIDE AVEC GRADIENT DÉNATURANT (DGGE)
II.4.1. COMPOSITION DU GEL DE DGGE
II.4.2. PRÉPARATION DU GEL DGGE
II.4.3. CONDITIONS ÉLECTROPHORÉTIQUES DE LA DGGE
II.4.4. TRAITEMENT D’IMAGE ET TRAITEMENT STATISTIQUE DES PROFILS DGGE
II.4.5. SÉQUENÇAGE DES FRAGMENTS D’ADN À PARTIR DES BANDES DGGE
II.5. ÉTUDE DE LA VARIABILITÉ DE LA POSITION DES BANDES ET DE LA
RÉPÉTABILITÉ DES GELS DGGE
II.6. ÉTUDE DE LA PÉRENNITÉ DES PROFILS DGGE BACTÉRIENS
II.6.1. ANALYSE DE BARS DU MÊME LIEU MAIS ISSUS D’AQUARIUMS DIFFÉRENTS
II.6.2. EFFET DES TRAITEMENTS TECHNOLOGIQUES SUR LES PROFILS
BACTÉRIENS DU POISSON
II.6.2.1. Effet des traitements de filetage, de marinage, de séchage et de réfrigération
II.6.2.2. Effet des répétions de cycles de congélation-décongélation
II.7. ÉTUDES SUR LA DIVERSITÉ DES PSEUDOMONAS AU VIETNAM
II.7.1. PRÉLÈVEMENT DES PSEUDOMONAS À PARTIR DE L’ENVIRONNEMENT ET DES PANGASIUS
II.7.2. ISOLEMENT ET PURIFICATION DES PSEUDOMONAS
II.7.3. REP–PCR (REPETITIVE ELEMENT SEQUENCE-BASED POLYMERASE CHAIN REACTION)
II.7.3.1. Amorce utilisée et conditions de la Rep-PCR
II.7.3.2. Électrophorèse en gel d’agarose
II.7.3.3. Traitement statistique des profils obtenus sur gel d’agarose
II.7.4. IDENTIFICATION DES PSEUDOMONAS PAR BIOLOGIE MOLÉCULAIRE
II.7.4.1. Extraction d’ADN à partir des souches isolées
II.7.4.2. Amplification des ADN extraits par réaction de polymérisation
en chaîne (PCR)
II.7.4.3. Purification et séquençage des produits PCR
III. RÉSULTATS ET DISCUSSION
III.1 ÉTUDE DE LA RÉPÉTABILITÉ DE LA MÉTHODE
III. 2. APPLICATION DE LA PCR-DGGE SUR DES POISSONS D’ORIGINES
GÉOGRAPHIQUES DIFFÉRENTES
III.2.1. ANALYSE DE BARS ÉLEVÉS DANS TROIS RÉGIONS DIFFÉRENTES
III.2.2 ANALYSE DE PANGASIUS DU VIETNAM ET DU CAMBODGE
III.2.3 ANALYSE DES PANGASIUS DE DIFFÉRENTS DISTRICTS DE LA MÊME RÉGION D’AN
GIANG AU VIETNAM
III.2.4. IDENTIFICATION PAR SÉQUENÇAGE DES BACTÉRIES DOMINANTES SUR LES POISSONS
PANGASIUS DU VIETNAM
III.2.5. ÉTUDE DE LA RELATION ENTRE L’EAU DES ÉTANGS D’ÉLEVAGE ET LES PANGASIUS
CAPTURÉS DANS CES ÉTANGS
III.2.6 COMPARAISON DE LA TOTALITÉ DES PROFILS DGGE DES POISSONS DE
DIFFÉRENTES ORIGINES GÉOGRAPHIQUES
III.3. ÉTUDE DE LA PÉRENNITÉ DU MARQUAGE MICROBIEN
III.3.1. INFLUENCE DE LA SAISON SUR LE MARQUAGE
III.3.2. ANALYSE DE BARS DU MÊME LIEU MAIS ISSUS D’AQUARIUMS DIFFÉRENTS
III.3.3. EFFET DES TRAITEMENTS TECHNOLOGIQUES SUR LE MARQUAGE
III.3.3.1. Effet des traitements de marinage, de séchage, de réfrigération
et de filetage
III.3.3.2. Effet des répétions de cycles de congélation-décongélation
III.3.3.3. Evolution des profils DGGE microbiens lors de transformation
en filet de Pangasius dans une usine au Vietnam
III.3. ETUDES SUR LA DIVERSITÉ DES SOUCHES PSEUDOMONAS AU VIETNAM
CONCLUSION GÉNÉRALE ET PERSPECTIVES
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXES
ANNEXE 1
ANNEXE 2
ANNEXE 3
ANNEXE 4
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