Soutenance mémoire
Le système nerveux
L’auto-phosphoryation de la thréonine 286 de la CaMKII diminue son autoassociation mais des CaMKII auto-phosphorylées sont présentes dans les agrégats de CaMKII auto-associées
La CaMKII sauvage a la capacité de s’auto-phosphoryler à la thréonine 286, ce qui confère une activité autonome à la kinase en maintenant séparé le segment auto-inhibiteur du domaine catalytique. Par ailleurs, l’auto-association de la CaMKII pourrait consister en l’interaction du segment auto-inhibiteur d’une CaMKII avec le domaine catalytique d’une autre CaMKII. Dans cette condition, l’auto-phosphorylation de T286 sur le segment inhibiteur pourrait perturber l’auto-association. Ainsi, tel qu’il a été vu dans la section précédente, les mutants T286D et T286/287D possèdent une ou des charges négatives qui imitent l’auto-phosphorylation de la T286 et ces mutants ne s’auto-associent pas (Figure 4B). Par ailleurs, le mutant T286A qui empêche l’auto-phosphorylation de T286 est un mutant qui s’auto-associe très fortement (T286A). Ces résultats démontrent l’importance de la T286 dans la formation des interactions d’auto-association et suggèrent que l’autophosphorylation de la T286 pourrait être un mécanisme régulant l’auto-association de la CaMKII.
Afin d’examiner si des sous-unités phosphorylées à T286 sont malgré tout présentes dans des agrégats de CaMKII auto-associées, nous avons mesuré le niveau de phosphorylation des agrégats par immunocytochimie avec un anticorps spécifique à la T286 phosphorylée (Figure 5, publiée dans Hudmon et al., 2005). La Figure 5 montre qu’il y a bel et bien présence de CaMKII auto-phosphorylée à la T286 dans les agrégats de CaMKII auto-associées. Ce résultat suggère que des sous-unités des CaMKII autoassociées ne participant pas à l’auto-association peuvent être auto-phosphorylée à la T286. En comparaison, les cellules stimulées sans Ca2+ ne présentent pas de CaMKII autophosphorylées à T286 tout comme les cellules transfectées avec la CaMKII incapable de s’auto-phosphoryler à T286 (T286A) (montrant par la fait même la haute spécificité de l’anticorps).
Nos résultats obtenus à partir de transfection de GFP-CaMKII dans les cellules HEK confirment que la CaMKII interagit avec NR2B et avec elle-même dans certaines conditions. Dans notre article (Hudmon et al, 2005), mon collègue Eric LeBel a montré que les mutants incapables de s’auto-associer (Figure 4) sont moins recrutés à la synapse. De plus, une autre étude du laboratoire (Bayer et al, 2006) a montré que l’interaction CaMKlINR2B est aussi critique pour le recrutement de la CaMKII à la synapse.
Le FRAP permet de mesurer la mobilité de protéines dans les épines de neurones en culture
Le FRAP est une technique qui permet de mesurer la mobilité de protéines dans des cellules vivantes. Nous avons utilisé cette technique afin de mesurer l’impact des interactions de la CaMKII à NR2B et de l’auto-association de la CaMKII sur la mobilité de la kinase dans les neurones, notamment dans les synapses. Ainsi, cette mobilité a été mesurée en photoblanchissant, à l’aide d’un faisceau laser à haute puissance (voir matériel et méthode), les protéines fluorescentes présentes dans une ou plusieurs régions choisies et en mesurant par imagerie le recouvrement de la fluorescence provenant d’un remplacement de ces protéines photoblanchies par des protéines non-photoblanchies présentes dans le reste du neurone (Figure 6). Cette technique nous permet de mesurer simultanément trois paramètres, soit la forme du recouvrement, la constante de temps et la fraction qui est mobile.La forme de la courbe du recouvrement renseigne sur les différents types de cinétique qui agissent sur le retour de fluorescence.
Deux processus peuvent influencer le recouvrement de fluorescence, soit la diffusion et les interactions moléculaires (Sprague et McNally, 2005). La diffusion dépend de la viscosité du milieu et des obstacles au mouvement des molécules. Dans le cas du FRAP, la diffusion conduit à l’échange de molécules libres photoblanchies par des molécules libres non-photoblanchies (fluorescentes). Cependant, une certaine fraction des molécules observées par FRAP peut être liée par des interactions moléculaires, ce qui fera dépendre le FRAP de l’association/ dissociation des interactions moléculaires. Dans ce cas, c’est l’association et la dissociation des interactions moléculaires qui influencera l’échange de molécules libres photoblanchies par des molécules libres non-photoblanchies et la diffusion servira seulement à conduire les molécules aux sites d’interaction.
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Guide du mémoire de fin d’études avec la catégorieLe système nerveux |
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Table des matières
A- Résumé
B- Avant propos
C- Table des matières
C1 – Liste des figures VI
D- Introduction
D1 – Le système nerveux
D2- Le neurone
D3- Les synapses
D4- La plasticité synaptique
D5- L’épine post-synaptique
D6-La CaMKII
D7- La CaMKII : sa structure et son activation
D8- La CaMKII : ses auto-phosphorylations
D9- La CaMKII : ses interactions protéiques
D10- La CaMKII : ses interactions au récepteur NMDA 11 DM- La CaMKII : son auto-association
D12- La CaMKII : sa localisation synaptique et ses changements de localisation
D13- La CaMKII : les enjeux de la régulation de sa localisation
E- Matériel et méthodes
El-Constructions de CaM Kl I-GFP et de NR2B
E2- Culture, transfection, stimulation et fixation des cellules HEK
E3- Immunocytochimie
E4- Microscopie confocale
E5- Analyse des images
E6- Cultures, transfections et imagerie de neurones
E7-Analyse du FRAP
F- Résultats
FI- La CaMKII translocalise dans le neurone suite à l’activation des récepteurs NMDA
F2- L’interaction de la CaMKII avec le récepteur NMDA (via NR2B) dépend d’une élévation de la concentration de calcium
F3- L’auto-association de la CaMKII dépend d’une élévation de la concentration de calcium et d’une baisse de pH F4- L’auto-association de la CaMKII dépend de la structure multimérique de la CaMKII, de l’activation par le Ca2+/CaM et d’interactions du domaine catalytique, mais est inhibée par l’auto-phosphorylation de laT
F5- L’auto-phosphorylation de la thréonine
de la CaMKlI diminue son auto-association mais des CaMKII auto-phosphorylées sont présentes dans les agrégats de CaMKII auto-associées
F6- Le FRAP permet de mesurer la mobilité de protéines dans les épines de neurones en culture
F7- FRAP de laGFP-CaMKII dans les épines de neurones en culture
F8- Caractérisation de l’étendue du photoblanchiment lors du FRAP
F9- Des protéines de différentes grosseurs ont des mobilités différentes dans les épines de neurones en culture
F10- Interprétation de la courbe du FRAP de la GFP-CaMKII dans les épines
Fil- Interprétation de la courbe du FRAP de la GFP-CaMKII 1-326 dans l’épine
FI2- Interprétation de la courbe du FRAP de laGFP dans l’épine
FI 3- La mobilité des protéines dépend de la morphologie compartimentée du neurone
F14- L’activation transitoire des récepteurs NMDA induit des changements pour la mobilité des protéines (GFP) dans l’épine post-synaptique
F15- L’effet de l’activation transitoire des récepteurs NMDA sur la mobilité de la CaMKII dans : – L’épine post-synaptique
– La dendrite
FI6- L’activation transitoire des récepteurs NMDA modifie la mobilité de la CaMKII 1-326 dans l’épine 50
G- Discussion
Gl- Étude des interactions de la CaMKII
G2- Étude de la mobilité de la CaMKII
H- Conclusion
I- Bibliographie
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