L’APPORT DE LA MICROSCOPIE A FLUORESCENCE

L’APPORT DE LA MICROSCOPIE A FLUORESCENCE

Hybridation in situ en fluorescence

FISH est une technique de biologie moléculaire, de cytogénétique, d‟hybridation in situ utilisant des sondes marquées à l‟aide d‟un marqueur fluorescent. Elle permet de mettre en évidence des éléments situés à l‟intérieur même de la cellule. Elle permet également de localiser une séquence de nucléotides connue mono-brin sur une coupe histologique (3)L‟hybridation in situ fait appel à deux propriétés de la molécule d’ADN: d‟une part la possibilité de la dénaturer et d’autre part, la complémentarité des bases des deux brins et leur tendance à se réassocier lorsqu’ils sont séparés.
La dénaturation permet d’obtenir des molécules monocaténaires ou simples brins qui auront tendance à se réassocier une fois replacées dans des conditions physiologiques. Si des molécules d’ADN dénaturées sont placées dans un milieu contenant des molécules simple brin d’ADN ou d’ARN de séquence connue, celles-ci auront tendance à s’associer avec les portions des ADN dénaturés qui leur sont complémentaires

 Principe de la technique

Le principe repose sur l’utilisation d’une sonde moléculaire, c’est-à-dire une petite séquence d’ADN (ou d‟ARN) dont l’emplacement normal est connu dans le génome et qui est marquée chimiquement de façon à pouvoir être repérée par la suite. Cette sonde est mise en contact avec les chromosomes d’une mitose et va s’hybrider (se fixer) spécifiquement au niveau de sa séquence complémentaire. On peut alors visualiser la sonde au microscope dont l’emplacement identifie précisément la région chromosomique dont elle est complémentaire.
La sonde hybridée avec la cible est révélée par un signal fluorescent (4) (figure 1)

Hybridation

C’est l’opération qui consiste à mettre en présence la sonde dénaturée généralement par la chaleur et l’ADN des chromosomes et des noyaux également dénaturés. Elle permet aussi de trouver des séquences identiques à différents éléments génétiques ou pour identifier la localisation d‟un gène spécifique et également de détecter la présence de séquences d‟ADN spécifiques d‟un organisme donné (6)L‟hybridation est menée à une température permettant la formation d‟un complexe stable entre les séquences homologues de l‟ADN cible et de l‟ADN de la sonde. Son efficacité dépend du temps d’hybridation et de la concentration de la sonde, un lavage élimine les sondes non hybridées.Il existe plusieurs techniques basées sur l‟hybridation de sonde, la plus couramment utilisée est la technique du Southern blot.
C‟est une méthode permettant de détecter et de visualiser des fragments d‟ADN de toute portion précise du génome.
• Principe de Southern blot :
• Extraction de l‟ADN à analyser
• Digestion de l‟ADN par une enzyme de restriction
La technique de FISH, Application, Principe, HER2 dans le diagnostic tumoral
• Séparation des fragments par électrophorèse
• Traitement du gel d‟agarose par la soude (dénaturation des fragments de restriction)
• Transfert des fragments dénaturés sur membrane de nitrocellulose (transfert se fait par capillarité)
• Hybridation
• Lavages pour éliminer de sonde non hybridée
• Détection de l‟hybridation selon le marqueur utilisé.

Les différents types de sondes

Une sonde est un brin d‟acide nucléique qui peut être marqué et employé pour s‟hybrider avec un acide nucléique complémentaire situé dans un mélange.
Les sondes peuvent être générales ou spécifiques.
Les sondes d‟acides nucléiques correspondent généralement à l‟ADN simple brin complémentaire d‟une séquence unique d‟un gène d‟intérêt(7)
Les sondes d‟acides nucléiques présentent différents avantages, sont plus stables que les protéines et sont plus résistantes aux solvants organiques et autres produits chimiques Plusieurs types de sondes sont disponibles pour la détection des remaniements chromosomiques. Elles peuvent être classées en quatre catégories (figure 2) :
• les sondes spécifiques d‟un locus donné,
• les sondes de peinture chromosomique spécifiques d‟un chromosome entier ou d‟un bras chromosomique
• les sondes de séquences répétées centromériques
• les sondes télomériques
• Les sondes de séquences uniques ont une taille de 0,5 kb à 1-2 Mb
Comme leur nom l‟indique, ces sondes de petite taille permettent d’identifier une région très précise du génome. Elles sont obtenues par marquage de l’ADN cloné dans différents vecteurs (plasmides, cosmides, YACs, BACs…). Leur intérêt principal réside dans la mise en évidence rapide de remaniements impliquant une région chromosomique précise (amplifications, microdélétions, translocations, inversions …)
• Les sondes de peinture chromosomique
Elles sont constituées d’un ensemble de sondes de petite taille qui couvrent l’ensemble du chromosome. Après hybridation, on observe un marquage de tout le chromosome (10). Il existe également des peintures spécifiques d’un bras ou même de quelques bandes chromosomiques. Ces sondes sont très utiles pour interpréter certaines translocations complexes, mettre en évidence des échanges de petite taille, ou identifier précisément l’origine d’un fragment non identifié.
• Les sondes de séquences répétées centromériques
Elles s’hybrident au niveau des centromères des chromosomes. Les séquences dont elles sont complémentaires sont naturellement présentes en un grand nombre d’exemplaires au niveau des centromères. Le signal obtenu est donc en général intense car la sonde s’hybride sur chacune des séquences complémentaires présentes. Ces sondes sont surtout utiles pour dénombrer les chromosomes, aussi bien en métaphase qu’en interphase et pour identifier l’origine des chromosomes marqueurs.
• Sondes télomériques
Elles sont spécifiques des extrémités terminales des bras courts et longs des chromosomes. Elles permettent de mettre en évidence des anomalies chromosomiques impliquant les régions télomériques des chromosomes, difficiles à visualiser avec d‟autres techniques

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Table des matières

I. INTRODUCTION
II. ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
1. HYBRIDATION IN SITU EN FLUORESCENCE
a. Hybridation
b. Les différents types de sondes
c. Le Marquage
2. L’APPORT DE LA MICROSCOPIE A FLUORESCENCE
3. HER2
a. Définition et structure
b. Intérêt de HER2 dans le diagnostic du cancers
c. La voie de signalisation de HER2
4. LA FISH DANS LE DIAGNOSTIC TUMORAL
a. Le diagnostic du cancer gastrique avec HER2
b. Le diagnostic du cancer du sein avec HER2
III. MATERIELS ET METHODES
1. L’EXAMEN HISTOLOGIQUE
2. COLORATION
3. PROTOCOLE EXPERIMENTAL DE LA FISH SUR COUPES TISSULAIRES
a. Préparation des lames pour la FISH
b. Déparaffinage
c. Prétraitement
d. Traitement à la pepsine
e. Hybridation des échantillons
f. Lavages Post- Hybridation
g. Contre-Coloration des noyaux au DAPI
h. Lecture et interprétation
IV. RESULTATS ET DISCUSSION
V. CONCLUSION
VI. REFERENCES