L’ananas dans le monde et les enjeux de l’exportation

Analyse quantitative des ARN totaux

La concentration des ARN totaux a été déterminée par la mesure 1,5 μl d‟extrait à A λ 260 nm (Nanodrop, ND1000, USA). L‟appareil mesure la concentration des échantillons en utilisant l‟équation de Beer-Lambert modifiée afin que le coefficient d‟extinction utilisé ait comme unité des ng-cm/ml : c = (A x e)/b. Où „c‟est la concentration en acides nucléiques (ng/ml), „A‟ est l‟absorbance, „e‟ le coefficient d‟extinction dépendant de la longueur d‟onde (ng-cm/μl) et „b‟ est le trajet optique. Dans le cas des ARN la valeur de „e‟ est 40 ng-cm/μl et celle de „b‟ 1 mm. 4.3.2

Analyse qualitative des ARN totaux

La pureté des ARN a été évaluée grâce au ratio λ 260/280, celui-ci doit être voisin de 2. La migration des ARN sur gel d‟agarose 1 % a permis de vérifier l‟intégrité des ARN totaux. Celui-ci est préparé avec du tampon TAE 0,5 X (tampon TAE 50 X, Tris acétate 2 M, EDTA 0,05, pH 8,3 ; Qiagen) contenant du bromure d‟éthidium à 0,05 % (Biochemika). Les ARN totaux ainsi qu‟un marqueur de taille de 200 à 10 000 bp (Smart Ladder®, Eurogentec, France) sont déposés sur le gel, puis migrent par électrophorèse (Mupid ® one), pendant 30 min à 100 V. Les acides nucléiques sont révélés sous UV (Gel Doc, Biorad, France). L‟intégrité des ARN totaux extraits a été vérifiée via celle des ARNr (16 S et 25 S).

Synthèse des ADNc par reverse transcription (RT)

La reverse transcription, consiste à synthétiser une molécule d‟ADN complémentaire (ADNc) à partir d‟ARNm en utilisant une enzyme : la transcriptase inverse (ou « reverse transcriptase ») découverte chez les virus à ARN. La reverse transcription a été réalisée au moyen du « kit Omniscript® Reverse transcription » (Qiagen, France). Les ARN totaux sont préalablement chauffés pendant 5 min à 65°C puis traités avec 40 μl de mélange réactionnel

Stratégie d’obtention de nouvelles séquences ADNc partiels

Le génome de l‟ananas n‟est pas entièrement séquencé. Certaines séquences nucléotidiques sont obtenues à partir de la base de données GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), d‟une base de données Australienne crée par Moyle et col. (2005) (http://www.pgel.com.au). En absence de gène séquencé des alignements de séquences multiples ont été réalisés dans le cas de monocotylédones comme le riz et le maïs provenant de la base de données GenBank (http://wwww.ncbi.nlm.nih.gov/). La recherche de zones consensus a été faite à l‟aide du logiciel d‟alignement multiple Clustalw (http://wwww.infobiogen.fr/services/analyseq/cgi-bin/clustalw_in.pl).

Dessin d’amorces pour la PCR semi quantitative et la PCR en temps réel qPCR

Des couples d‟amorces spécifiques (sens et antisens) de 20 à 24 nucléotides sont réalisés sur des séquences nucléotidiques correspondant à différents gènes obtenues dans les bases de données en prenant en compte des règles classiques : pourcentage de résidus G et C d‟environ 50 %, TM (température d‟hybridation des oligonucléotides à la matrice d‟ADN) entre 56 et 62°C, pas de séquences répétées de nucléotides (comme AAAAAAAAA ou GGGGGGG), ni de séquences palindromiques. Afin de vérifier la qualité des amorces, le logiciel Netprimer (http://www.premierbiosoft.com/netprimer/) a été utilisé permettant de détecter la formation d‟épingle à cheveux, et la formation de dimère d‟amorces.

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Table des matières

PARTIE 1 : Synthèse bibliographique
1. Ananas comosus (L) M
1.1 Caractéristiques
1.1.1Classification botanique et origine
1.1.2 Morphologies et particularités physiologiques
a) Généralités
b) De l’inflorescence au fruit
1.2 La culture de l’ananas
1.2.1 Les conditions de culture
a) Climat
b) Pédologie
1.2.2 L’itinéraire technique
a) Préparation du sol
b) La plantation
c)Irrigation et traitements
1.3 L’ananas dans le monde et les enjeux de l’exportation
1.3.1 Historique et leader de production
1.3.2 Ananas transformés et ananas frais
1.3.3 Les tendances du marché
1.4 Diversité variétale et critères de qualité des fruits
1.4.1 Les variétés d’ananas et leurs particularités
1.4.2 Sélection variétale et critères de qualité des fruits
1.4.3 Les contraintes liées à l’exportation des fruits frais
2 Le brunissement interne de l’ananas
2.1 Généralités
2.1.1 Les conditions de brunissement
2.1.2 Impact économique du brunissement
2.2 Les symptômes du BI
2.3 Les gènes et enzymes associés au BI
2.3.1 Synthèse et oxydation des phénols
a) Les composés phénoliques (polyphénols)
b) La phénylalanine ammonia-lyase (PAL, EC 4.3.1.5)
c) Les Polyphenols oxidases (PPO, EC 1.14.18.1 et EC 1.10.3.1)
d) Les peroxydases (POD, EC 1.11.1.7)
2.3.2 Les enzymes antiradicalaires
2.4 Les facteurs influençant le brunissement interne
2.4.1 Les hormones
a) Ethylène
b) La gibbérelline
2.4.2 Les composés chimiques
a) Le calcium
b) L’acide ascorbique
2.5 Les méthodes pour inhiber ou limiter le BI
2.5.1 Les traitements chimiques
a) Les traitements thermiques
b) Atmosphère contrôlée et conditions de stockage
2.5.3 L’amélioration variétale
3 La contrainte au froid
3.1 Les conditions 7
3.2 La contrainte au froid : « chilling stress »
3.2.2 La stratégie adaptative des plantes au froid
3.2.3 Les réponses cellulaires et moléculaires associées au « chilling stress »
a) Une modification des membranes
b) Altération de la structure du cytosquelette
c) Les phénomènes dégradatifs impliqués dans la balance anabolique/catabolique
4 La protéolyse chez les plantes
4.1 Les protéases des organites
4.1.1 Les fonctions protéolytiques
4.1.2 Mode d’action des protéases, classification et nomenclature
4.2 Les protéases à cystéine
4.2.1 Classification des protéases à cystéine
4.2.2 Un exemple de protéase à cystéine : la papaine
4.3 Les protéases à acide aspartiques
4.3.1 Classification
4.3.2 Site actif et mode d’action
4.3.3 Les fonctions des protéases à acide aspartiques
4.4 Régulation et inhibition des endoprotéases
4.4.1 Les inhibiteurs de protéases
4.4.2 La cystatine
a) Mode d’action et structure
b) Fonctions
PARTIE 2 : Matériel et Méthodes
1 Matériel végétal
1.1 Conditions de culture et de récolte des fruits
1.2 Les Traitements
1.3 Echantillonnages
2 Analyses physiologiques
2.1 Caractéristiques chimiques
2.1.1 Mesure d’extraits secs solubles
2.1.2 Mesure d’acidité titrable
2.2 Evaluation de l’intégrité des membranes cellulaires
3 Analyses biochimiques
3.1 Extraction des protéines et dosages enzymatiques
3.1.1 Extraction de protéines adaptées aux dosages enzymatiques de PPO, POD et APX
3.1.2 Dosage enzymatique et séparation de protéines
a) La polyphenol oxidase PPO
b) La guaiacol peroxidase POD
c) Séparation des protéines de PPO et POD en conditions non dénaturante
d) Milieu de révélation des activités protéiques PPO et POD
e) L’ascorbate peroxidase APX
3.1.3 Extraction des protéines et dosage enzymatique de la PAL
3.1.4 Extraction des protéines et dosage enzymatique des enzymes du catabolisme protéique
a) Dosage de la protéase à cystéine
b) Dosage de la protéase à acide aspartique
3.1.5 Dosage des protéines des extraits
4 Analyses moléculaires
4.1 Préparation des échantillons
4.2 Extraction des ARN totaux
4.3 Contrôle de la qualité et de la quantité d’ARN
4.3.1 Analyse quantitative des ARN totaux
4.3.2 Analyse qualitative des ARN totaux
4.4 Synthèse des ADNc par reverse transcription
4.5 Stratégie d’obtention de nouvelles séquences d’ADNcs partiels
4.6 Dessin d’amorces pour la PCR semi quantitative et la PCR en temps réel
4.7 Amplification des gènes par PCR semi-quantitative
4.7.1 La réaction
4.7.2 Analyse des produits PCR
4.8 Clonage des produits d’amplification par PCR
4.8.1 Ligation des produits d’amplification PCR dans un vecteur de clonage
4.8.2 Préparations de bactéries compétentes
4.8.3 Transformations des bactéries compétentes
4.8.4 Préparation de l’ADN plasmidique
4.8.5 Séquençage d’ADN et analyse de séquences nucléotidiques
4.8.6 Amplification d’une séquence partielle d’ADNc par RACE
a)Amplification de l’extrémité 5’de l’ADNc de la protéase à acide aspartique
b) Amplification de l’extrémité 3’ de l’ADNc de la proréase à acide aspartique
4.8.7 Amplification des gènes par PCR en temps réel qPCR
a) Etapes préliminaires permettant de normaliser l’étude qPCR
b) La réaction
c) Quantification relative de l’expression des gènes
Partie 2 Résultats
Chapitre 1 Mise au point d’un système expérimental
Chapitre 2 Article 1 Polyphenol oxidase and Peroxidase expression in Four Pineapple varieties (Ananas comosus L.) after chilling injury
Chapitre 3 Article 2 Postharvest chilling treatment induces distinct expression in fruit bromelain and cystatin in two pineapple (Ananas comosus (L) Merr.) varieties differing in their susceptibility to blackheart physiopathy
Chapitre 3 Article 3 A novel aspartic acid protease gene from pineapple fruit
(Ananas comosus (L) Merr.): cloning, characterization, and relation
to postharvest chilling stress
Chapitre 4 Etude préalable de l’implication de l’ascorbate peroxidase et de la phenylalanine ammonia-lyase dans le brunissement interne de l’ananas et mise au point d’outils moléculaires
Discussion générale
Références
Annexes