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L’AGGRECANE : PROTEOGLYCANE DU CARTILAGE
On distingue deux sortes de PGs dans le cartilage, ceux de grande taille (aggrécane) et ceux de petite taille (décorine, biglycane, etc).
L’aggrécane (figure 7) constitue un PG qui interagit avec l’acide hyaluronique pour former des aggrégats de haut poids moléculaire. Chaque molécule d’aggrécane est constituée d’un squelette peptidique de 210-250 kDa auquel sont attachées les GAGs. Le GAG majoritaire de l’aggrécane est le sulfate de chondroitine (CS) (environ 80%) mais on retrouve également du sulfate de kératane (KS).
PROCESSUS ARTHROSIQUE : déséquilibre de la balance synthèse/dégradation
Les mécanismes précis menant à une dégénérescence de l’arthrose sont encore peu connus. On sait que le cartilage est un tissu vivant au ralenti sans grande capacité de régénération et tout porte à croire que les phases précoces de l’arthrose sont caractérisées par un excès du catabolisme et une perte de structuration de l’aggrécane.
Ce défaut entraine essentiellement des modifications quantitatives et qualitatives de ses chaines de GAGs qui conduisent à une dégradation progressive et irréversible du reste des composants de la matricecartilagineuse. (figure 8).
ZONE DE LIAISON LIEE A DES PEPTIDES
La partie peptidique des PGs se compose principalement d’une séquence de résidus Lsérine et glycine alternés le long de la chaine peptidique. Certains résidus L-sérine sont liés de façon O-covalente au résidu D-xylose de la zone de liaison tétrasaccharidique des PGs. Le nombre de résidus sérine substitués n’est pas encore bien déterminé (environ 2/3 pour les héparines et bien moins pour les CSs). Pour ce faire, la synthèse chimique de ces composés semble être une alternative évidente.
Dans ce but, la synthèse de différents fragments peptidiques glycosylés de la zone de des PGs a été entreprise par Rio S. et al. en 1991.
Leur stratégie a consisté à préparer un bloc disaccharidique activé 71 utilisé comme donneur glycosyle pour les condensations ultérieures avec les dipeptides L-séryl-glycine 74-81, adéquatement protégés (Schéma II-11).
SYNTHESE CHIMIO-ENZYMATIQUE DE LA ZONE DE LIAISON
Des synthèses chimioenzymatiques de la zone de liaisons ont également été réalisées.
Ainsi, l’équipe de Kusumoto a publié en 1996 et 1999 la synthèse chimioenzymatique d’un trisaccharide de la zone de liaison lié à un résidu L-sérine 159 (Schéma II-28) en partant soit des paranitrophényl glycosides PNP-Xyl 176a et PNP-Gal 173a, soit des 3-Nitro-2-pyridyl 3NPy-Xyl 176b et 3NPy-Gal 173b. L’intérêt de la synthèse enzymatique est de contrôler grâce aux enzymes utilisées la stéréochimie des liaisons glycosidiques formées et d’éviter les nombreuses étapes de protections/déprotections régiosélectives.
Dans un premier temps, la transglycosylation enzymatique des β-D-Xyl 176a et 176b avec les β-D Gal 173a et 173b avec la β-D-galactosidase (E. Coli) a été réalisée dans un tampon phosphate à 32°C pour donner respectivement les disaccharides β(1→4) 174a (21%) et 174b (36%) (Schéma II 28).
Ainsi, afin de synthétiser les trisaccharides 172, les auteurs ont protégé la position 6 très réactive par un groupement acétyle. Dans le cas du PNP, cette protection a été réalisée chimiquement avec du chlorure d’acétyle en présence d’éthyldiisopropylamine dans le DMF pour donner le disaccharidique 175a (65%). Dans le cas du 3NPy, l’acétylation en 6 a été réalisée de façon enzymatique avec une lipase immobilisée donnant 175b. Cette acétylation enzymatique a donné un meilleur rendement (92%) comparée à l’acétylation chimique.
Puis, les disaccharides 175a et 175b ont alors été glycosylés avec les donneurs 173 en présence de la β-D-galactosidase (E. Coli) en milieu tamponné (0,05 M, pH 7,3) pour donner les trisaccharides β(1→4) désiré 172a (23%) et 172b (29%) avec 73% et 54% d’ accepteurs 175a et 175b récupérés, respectivement.
Les trisaccharides 172 ont ensuite été complétement acétylés chimiquement pour donner 171a et 171b. Puis, une glycosylation chimique directe (sans activation) de 171b et indirecte (après activation en acétimidate) de 171a avec le dérivé sérine protégé 160 suivie d’une hydrogénation catalytique et d’une hydrazinolyse ont ensuite donné le composé cible 159. Les auteurs ont ainsi obtenus de meilleurs résultats en utilisant les 3NPy-glycosides comparés aux PNP-glycosides.
ZONE DE LIAISON AVEC AMORCE DE CS
En 1992, Goto F. et Ogawa T. ont publié la synthèse totale d’un hexasaccharide déprotégé 192 correspondant au tétrasaccharide de la zone de liaison des PGs reliée à l’unité disaccharidique de base des CSs ainsi que son dérivé 4-sulfaté sur le sucre aminé 193 (Schéma II-34). Leur stratégie a consisté en la préparation de 2 trisaccharides, le premier donneur 194, correspondant au dernier sucre de la zone de liaison lié à l’unité CS (D-GlcA-DGalNAc-D-GlcA) et le second accepteur 195, correspondant aux 3 premiers sucres de la zone de liaison (D-Xyl-D-Gal1-D-Gal2).
Le bloc donneur 194 a été construit par addition successive des précurseurs monosaccharidiques 201, 200 et 196 en partant de l’extrémité réductrice. D’abord, 200 et 201 ont été glycosylés en présence de TMSOTf entre -78°C et -40°C pour donner le β-disaccharide correspondant (62%) et 28% d’anomère α, puis l’unité D-glucosyle a été transformée en unité D-glucuronique par oxydation. Une déacétylation a ensuite donné l’accepteur 197 (73%). Ce dernier a pu ainsi être glycosylé avec le donneur D-glucuronique 196 à -25°C en présence de BF 3 .Et 2 O sous micro-ondes et une série de réactions de protections/déprotection suivie d’une activation en acétimidate ont fourni le bloc donneur 194.
Le bloc accepteur 195 (D-Xyl-D-Gal-D-Gal) a été obtenu par l’ajout successif des monosacchairdes précurseurs 203, 202 et 198 en partant de l’extrémité réductrice. D’abord, le disaccharide 199 a été obtenu après glycosylation de l’accepteur 203 avec le donneur Dgalactosyle 202 en présence de triflate d’argent (AgOTf) (63%). L’acétate en 2 du précurseur D-galactosyle a ensuite été remplacé par un groupement benzyle puis une déallylation a fourni l’accepteur (91%) correspondant qui a alors été glycosylé avec le donneur D-galactosyle 198 en présence de CuBr2 -n-Bu4 NBr-AgOTf pour donner le trisaccharide correspondant (97%) qui a été transformé en accepteur 195 avec 83% de rendement en 3 étapes ; déacétylation, benzylation et déallylation.
L’étape délicate de glycosylation des deux intermédiaires clé 194 et 195 a été réalisée entre -20°C et -30°C en présence de BF 3 .Et 2 O dans le mélange toluène/CH 2 Cl2 donnant l’hexasaccharide désiré avec 47% de rendement. Ce dernier a ensuite été, soit, entièrement déprotégé pour donner à 83% le composé cible 192 non sulfaté, soit, d’abord délévulinoylé sélectivement puis sulfaté en 4 avec du Me 3N.SO3 dans le DMF à 60°C, et enfin déprotégé totalement pour donner le composé cible 193 avec 17% de rendement en tout.
A PARTIR DE LA D-GLUCURONO-6,3-LACTONE
En 1955, Bollenback G. N. et al. ont publié la synthèse du méthyl (2,3,4-tri-Oacétyl-β-D-glucopyranosyluronate 215 en partant de la D-glucurono-6,3-lactone (schéma IV-3). En présence de méthanol et de soude en quantité catalytique, la lactone subit une attaque nucléophile sur la position 6, son ouverture est suivie d’un réarrangement du sucre sous sa forme pyranique, thermodynamiquement plus stable. L’acétylation est alors réalisée avec de l’anhydride acétique dans la pyridine et le β-tétracétate 215b est isolé par cristallisation fractionnée.
PREPARATION DES PRECURSEURS D-GALACTOSYLES 249 ET 250
Les précurseurs D-galactosyles 249 et 250 portent les mêmes groupements protecteurs sur les positions 2, 4 et 6 (figure IV-1). La position anomérique de ces composés comporte cependant deux groupements différents. Le groupement MP de Gal2 249 central a été choisi pour une protection temporaire, clivable. Le bras éthanolamine de Gal1 250 servira d’amorce à la biotine sur l’extrémité réductrice des oligosaccharides cibles.
La préparation des précurseurs D-galactosyles Gal1
250 et Gal2 249 a été réalisée à partir du D-Gal commercial (schéma IV-16). Une peracétylation avec de l’anhydride acétique en présence d’acétate de sodium à 100°C a fourni le β-pentacétate 251 (41%). Celui-ci a alors été soit directement glycosylé avec le 4-méthoxyphénol en présence de TMSOTf de 0°C à TA, pour donner le composé 252 (81%), précurseur de Gal2, soit O-déacylé sélectivement sur l’acétate anomère avec de l’acétate d’hydrazine dans le DMF anhydre pour conduire à l’hémiacétal intermédiaire qui a été activé en trichloroacétimidate 253 en présence de Cl 3CCN et de DBU (78% sur les deux étapes). Une glycosylation en présence TMSOTf avec l’éthanolamine N-protégée par le groupement benzyloxycarbonyle a alors mené au composé254 (70%), précurseur de Gal1.
PREPARATION DES BLOCS DISACCHARIDIQUES
Une fois obtenus, les monosaccharides précurseurs clés 227, 249 et 250 ont servi à la construction du squelette oligosaccharidique. Dans un premier temps, les précurseurs 227 et 249 ont été utilisés pour la construction des disaccharides (schéma IV-18). Une glycosylation de ces deux précurseurs en présence de TMSOTf dans le CH 2 Cl2 a donné le premier disaccharide 265 (92%). Une déprotection sélective de l’acétal silylène avec le complexe de triéthylamine trihydrofluorure (Et 3 N.3HF) à 0°C dans le THF a fourni le bloc disaccharidique commun 266 (83%) aux deux séries de composés finaux : les oligosaccharides non sulfatés et monosulfatés en 4 ou 6 de Gal1 et les oligosaccharides monosulfatés en 4 ou 6 de Gal2.
PREPARATION DU TRISACCHARIDE BIOTINYLE, NON SULFATE 204
Afin d’obtenir le trisaccharide non sulfaté (schéma IV-24), nous avons effectué une saponification du précurseur 274 afin de déprotéger les esters du sucre. En raison de la présence de l’ester méthylique sur l’unité D-GlcA, un risque de β-élimination était prévisible par l’utilisation de soude 4M. Il a donc fallu effectuer une saponification en deux temps 66,67 . D’abord, une saponification sélective de l’ester méthylique par une solution de lithine et d’eau oxygénée (LiOH + H2O2 qui en solution donne LiOOH + H2O). En effet, HOO avec un pKa de 11,6 est plus nucléophile et moins basique que HO -(pKa = 15,8), ce qui permet d’éviter les risques de β-élimination. Ce risque étant éloigné, les autres esters ont été saponifiés par une solution de soude 4M et nous avons ainsi obtenu après purification sur LH-20 dans l’eau le trisaccharide déprotégé 275 (69%).
PREPARATION DU TRISACCHARIDE BIOTINYLE 6 SULFATE SUR GAL1 205
La synthèse du trisaccharide cible 205, sulfaté en 6 (schéma IV-26), a nécessité une sulfatation régiosélective du diol 274 avec le complexe d’anhydride sulfuriquetriméthylamine (Me3N.SO3 ) dans le DMF à 40°C. Il est important de ne pas dépasser 40°C en température pour éviter les risques de sulfatation de la position 4. Nous avons ensuite réalisé une acétylation directe dans le but de confirmer la structure par RMN et un échange d’ion sur colonne sephadex SP-C25 [Na + ] a ensuite donné le sel de sodium 276 (71%).
D. PREPARATION DU TRISACCHARIDE BIOTINYLE 4 SULFATE SUR GAL1 206
La préparation des composés sulfatés en 4 (schéma IV-28) a nécessité la protection préalable de la position 6 réactive du diol 274. Ainsi, une benzoylation régiosélective a été réalisée avec du cyanure de benzoyle (BzCN) dans la pyridine donnant le trisaccharide 278 avec 77% de rendement. Une sulfatation en position 4 avec un large excès de Me 3N.SO3 à 60°C dans le DMF suivie d’une purification sur LH : 20 pour éliminer l’excès de réactif et deDMF et un échange d’ion ont alors été nécessaires pour obtenir le sel de sodium 279 (83%).
TETRASACCHARIDES : Zone de liaison et amorce de CS
Après avoir obtenu la collection complète de trisaccharides de la zone de liaison biotinylés, nous nous sommes intéressés dans un deuxième temps à la synthèse de tétrasaccharides diversement sulfatés ou non et biotinylés, composés des trois derniers sucres de la zone de liaison liés à une amorce monosaccharidique de CS (figure IV-5). Ces synthèses sont présentées ici. Nous traiterons d’abord les composés non sulfatés et monosulfatés en 4 ou en 6 sur Gal1 209, 210 et 211, puis nous verrons les composés monosulfatés en 4 ou en 6 sur Gal2 212 et 213, dérivants tous des mêmes trisaccharides précurseurs 273 et 284 utilisés pour la synthèse des trisaccharides.
PREPARATION DU TETRASACCHARIDE NON SULFATE 209
Afin d’obtenir le tétrasaccharide non sulfaté (schéma IV-48), nous avons effectué une saponification en deux temps du précurseur 306 afin de déprotéger les esters du sucre. D’abord, une saponification sélective de l’ester méthylique par une solution de lithine. Les autres esters ont été saponifiés par une solution de soude 4M et nous avons ainsi obtenu après purification sur LH-20 dans l’eau le tétrasaccharide déprotégé 307 (85%).
Le groupement benzyloxycarbonyle (Z) de 307 a ensuite été clivé par hydrogénolyse en présence de Pd/C libérant ainsi l’amine primaire non isolée (schéma IV-48), et un couplage avec un dérivé succinimide de la biotine dans un mélange eau/DMF/Et 3 N a donné le premier tétrasaccharide cible biotinylé et non sulfaté 209 avec 81% de rendement après purification (annexe).
PREPARATION DU TETRASACCHARIDE 6 SULFATE SUR GAL1 210
Le diol 306 obtenu, nous avons alors procédé à une sulfatation régiosélective en 6 suivie d’une acétylation en 4 (schéma IV-49) dans les mêmes conditions que celles décrites pour la sulfatation de 274 et nous avons obtenu le sel de sodium 308 (81%).
Une saponification de 308 en deux temps (schéma IV-49) comme décrit pour le diol 274 afin de déprotéger les esters du sucre a ensuite été réalisée et a donné 309 (69%). Puis, le groupement Z a été clivé par hydrogénolyse en présence de Pd/C libérant ainsi l’amine primaire non isolée (schéma IV-49). Nous avons ensuite réalisé une réaction de couplage avec un dérivé succinimide de la biotine dans un mélange eau/DMF/Et 3N pour obtenir, après purification, le trisaccharide cible biotinylé et 6 sulfaté 210 (64%) (annexe 7).
PREPARATION DU TETRASACCHARIDE 6 SULFATE SUR GAL2 212
Le diol 316 obtenu, nous avons alors procédé à la sulfatation régiosélective suivie d’une acétylation (schéma IV-54) dans les mêmes conditions décrites pour la sulfatation de 274 conduisant au sel de sodium 317 (84%). Une saponification de 317 en deux temps (schéma IV-54) comme décrit pour le diol 274 a alors donné 318 (70%) dont le groupement Z a été clivé par hydrogénolyse en présence de Pd/C. L’amine primaire ainsi libérée (schéma IV-54) a été couplée au dérivé succinimide de la biotine pour conduire au tétrasaccharide cible biotinylé et 6 sulfaté 212 avec 69% de rendement après purification (annexe 9).
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Table des matières
I. INTRODUCTION BIOLOGIQUE
I-1 ARTHROSE
I-2. CARTILAGE
I-2.1 GENERALITES
I-2.2 FONCTIONNEMENT DE L’ARTICULATION
I-2.3 COMPOSANTS PRINCIPAUX DU CARTILAGE
A. LE COLLAGENE
B. PROTEOGLYCANES (PGS)
B-1 LE SQUELETTE PEPTIDIQUE OU CORE PROTEINE
B-2 LA ZONE DE LIAISON
B-3 LES GLYCOSAMINOGLYCANES (GAGS)
B-4 L’AGGRECANE : PROTEOGLYCANE DU CARTILAGE
I-3 PROCESSUS ARTHROSIQUE
I-4 BIOSYNTHESE DES PROTEOGLYCANES (PGS)
I-5 CONCLUSION
II. TRAVAUX DECRITS DANS LA LITTERATURE SUR LA ZONE DE LIAISON. – 14
II-1 ZONE DE LIAISON TOTALE OU PARTIELLE
II-2 ZONE DE LIAISON LIEE A DES PEPTIDES
II-3 SYNTHESE CHIMIO-ENZYMATIQUE DE LA ZONE DE LIAISON
II-4 ZONE DE LIAISON BIOTINYLEE
II-5 ZONE DE LIAISON AVEC AMORCE DE CS
III- OBJECTIFS ET STRATEGIE DE SYNTHESE
III. OBJECTIF DE RECHERCHE
III-1 STRATEGIE DE SYNTHESE
IV-SYNTHESE
IV-1 SYNTHESE DES MONOSACCHARIDES CLES 227, 249 ET 250
IV-1.1 PREPARATION DU PRECURSEUR D-GLUCURONYLE DONNEUR 227
IV-1.1.3 SYNTHESES REALISEES AU LABORATOIRE : RESULTATS
IV-3 PREPARATION DES PRECURSEURS D-GALACTOSYLES 249 ET 250
IV-3 PREPARATION DES BLOCS DISACCHARIDIQUES
IV-5 TRISACCHARIDES DE LA ZONE DE LIAISON BIOTINYLES
IV-5.1 TRISACCHARIDES NON SULFATE ET SULFATES SUR GAL1
IV-5.2 TRISACCHARIDES SULFATES SUR GAL2
IV-6 TETRASACCHARIDES : Zone de liaison et amorce de CS
IV-6.1 TETRASACCHARIDES NON SULFATE ET SULFATES SUR GAL1
IV-6.2 TETRASACCHARIDES SULFATE SUR GAL2
V-PERSPECTIVES
V-1 PENTASACCHARIDES : zone de liaison et amorce disaccharidique de CS
V-2 VERS LES HEPARANES SULFATES (HS)
VI. CONCLUSION GENERALE
VII. PARTIE EXPERIMENTALE
VIII. ANNEXES
IX. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
