L’ADN : SUPPORT DE L’INFORMATION GENETIQUE 

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La transduction du signal

La détection des dommages a donc pour effet d’activer l’une des deux voies majeures de signalisation chez les mammifères ; la voie ATM et la voie ATR (Huen and Chen, 2010). ATM (Tel1 chez S. cerevisiae) et ATR (Mec1 chez S. cerevisiae) sont ce que l’on nomme des transducteurs du signal, c’est-à-dire qu’ils initient la transduction d’une cascade d’activation qui propage et amplifie le signal conduisant entre autre à l’arrêt du cycle cellulaire, néanmoins ils sont parfois classés parmi les protéines senseurs car ils sont capables de reconnaître certaines configurations ADN-protéines. Ces protéines font partie de la famille des PI3K-like kinases (Phosphatidylinositol 3-kinase like) (Ciccia and Elledge, 2010; Finn et al., 2011). Bien qu’il existe des homologues de ATM et ATR chez S. cerevisiae ; Tel1 et Mec1 respectivement, les fonctions que ces derniers effectuent sont différentes. En effet, alors qu’ATM et ATR sont activés en fonction du type de lésion présente dans l’ADN (ATM est principalement activé en réponse aux cassures doubles brins (Suzuki et al., 1999) et ATR généralement activé suite à un blocage de fourche (Dart et al., 2004; Zou and Elledge, 2003)), chez S. cerevisiae, Mec1 joue un rôle majeur dans la réponse aux dommages de l’ADN de manière générale (Finn et al., 2011), alors que Tel1 intervient principalement dans la maintenance des télomères (Greenwell et al., 1995). A noter que ATR chez les mammifères, et Mec1 chez S. cerevisiae sont des gènes essentiels pour la croissance cellulaire alors que ATM et Tel1 ne le sont pas (Kerzendorfer and O’Driscoll, 2009; Morrow et al., 1995). Cela suggère que leurs fonctions ne sont redondantes qu’en partie.
Les transducteurs du signal, modifient les histones H2A (chez la levure) ou le variant H2AX (chez les mammifères) se trouvant au niveau du dommage en les phosphorylant (on parle deH2A(X)) (Burma et al., 2001; Downs et al., 2000; Ward and Chen, 2001). Cette modification joue un rôle important dans la détection des dommages et procédés avals de la réponse aux dommages de l’ADN. Un remodelage de la chromatine a lieu, rendant la lésion plus accessible aux protéines senseurs (voir paragraphe 2.3) (Downs et al., 2000; Downs et al., 2007; Shroff et al., 2004).
Suite à leur activation, les PI3K-like kinases permettent l’activation des kinases effectrices agissant en aval de la voie de réponse (Branzei and Foiani, 2009; Finn et al., 2011). L’activation des protéines kinases effectrices par les PI3K-like kinases est régulée par une protéine médiatrice ; Rad9 chez la levure bourgeonnante, 53BP1, BRCA1 et MDC1 chez les mammifères. Ces protéines adaptatrices fonctionnent comme des adaptateurs moléculaires pour le recrutement des protéines aux sites de dommage et relaient la phosphorylation des cibles par les PI3K-like kinases (Finn et al., 2011).

Les kinases effectrices

Les effecteurs sont typiquement des Sérines/Thréonines kinases ; CHK1 et CHK2 chez les mammifères, Chk1 et Rad53 (voir paragraphe 2.4) chez S.cerevisiae. CHK1 et CHK2 possèdent toutes les deux des domaines kinases conservés, mais elles sont structurellement et fonctionnellement distinctes (Stracker et al., 2009).
L’activation de CHK1 et CHK2 se fait par des mécanismes distincts. L’activation de CHK1 se fait via ATR et la protéine adaptatrice Claspin (Mrc1 chez S. cerevisiae) (Branzei and Foiani, 2009; Finn et al., 2011), alors que celle de CHK2 se fait principalement via ATM ((Stracker et al., 2009). Chez S. cerevisiae c’est différent, l’activation de Rad53 se fait via Mec1 et la protéine adaptatrice Rad9 (voir paragraphe 2.4). Chez cette dernière, la protéine adaptatrice Rad9 permet aussi l’activation de Chk1, au même titre que Rad53 (Branzei and Foiani, 2009; Finn et al., 2011). Le même processus est utilisé chez les mammifères, où les homologues de scRad9 ; 53BP1, BRCA1 et MDC1 sont requis pour la phosphorylation et l’activation de la kinase effectrice CHK1 (Shibata et al., 2010; Stewart et al., 2003; Yarden et al., 2002).
Toujours chez les mammifères, 53BP1 joue le rôle d’un adaptateur moléculaire qui facilite la phosphorylation radiation-induite de certaines des cibles de ATM, à savoir la kinase effectrice CHK2, BRCA1 et SMC1 (une sous-unité de la cohésine) (Finn et al., 2011)
Mrc1 régule quant à lui l’activation de Rad53 en réponse aux stress réplicatifs en jouant le rôle d’un adaptateur entre Mec1 et Rad53 alors que chez les vertébrés, la claspin ne participe qu’à l’activation de CHK1 (Branzei and Foiani, 2009; Finn et al., 2011).
Contrairement à ce qui est observé chez S.cerevisiae où Rad53 (hCHK2) est la protéine kinase effectrice principale, chez les mammifères, c’est CHK1 qui joue ce rôle , CHK2 jouant plutôt un rôle dans le maintien de l’activation du checkpoint (Finn et al., 2011).

Rad53 une kinase clé

Les protéines impliquées dans la réponse aux dommages de l’ADN sont très conservées chez les eucaryotes (Tableau I2) et la plupart des recherches initiales sur cette voie a été menée chez la levure bourgeonnante Saccharomyces cerevisiae et la levure fissipare Schizosaccharomyces pombe (Branzei and Foiani, 2009).
Chez la levure Saccharomyces cerevisiae, la protéine kinase effectrice Rad53 joue un rôle central dans ces voies. Cette protéine est essentielle pour la survie de la cellule et il est communément admis que son rôle essentiel réside dans la maintenance de l’intégrité du génome qui se trouve être strictement dépendant de la maintenance d’un niveau adéquat de dNTPs dans la cellule (voir partie 3) (Branzei and Foiani, 2009; Fiorani et al., 2008).
Rad53 est composée de deux domaines FHA (Forkhead-Associated) ainsi que d’un domaine kinase (Figure I4). Les domaines FHA permettent la liaison protéine-protéine, plus précisément aux phosphopéptides pour Rad53 en tous cas (Durocher et al 1999). Son activation se fait notamment par le biais de Mec1 qui la phosphoryle. Rad53 s’associe à la protéine adaptatrice Rad9 afin d’être activé par Mec1.
Figure I 4 : Représentation schématique de Rad53 et localisation des sites de phosphorylation identifiés dans les études de Sweeney et al. et de Smolka et al. Adapté de Pellicioli et al. 2005
En bleu foncé sont schématisés les sites SQ/TQ. En vert : signal de localisation nucléaire. En rouge à l’intérieur du
domaine kinase : segment d’activation.
Un premier modèle d’activation de Rad53 par le biais de Rad9 a été proposé en 2001 (Figure I5.A). Ce modèle, nommé « solid state catalyst » (Gilbert et al., 2001) proposait qu’un complexe Rad9 hyperphosphorylé par Mec1 permettait le recrutement de Rad53 le concentrant localement ce qui faciliterait son autophosphorylation en trans. Ce dernier se trouvant sous sa forme hyperphosphorylée se décrocherait alors du complexe Rad9 pour agir sur ses différentes cibles.
Un deuxième modèle dit « adaptor based » proposé en 2005 (Figure I5.B) (Sweeney et al., 2005) dit que l’hyperphosphorylation de Rad9 par Mec1 permet le recrutement de Rad53, rapprochant physiquement Rad53 de Mec1 qui pourra alors la phosphoryler. De cette manière, Rad53 serait donc capable de s’autophosphoryler pour atteindre un état hyperphosphorylé et ainsi actif.
Le dernier modèle a été proposé également en 2005 (Figure I5.C) (Pellicioli and Foiani, 2005). Ce modèle « d’adaptor catalyst » est un mélange des deux autres modèles cités ci-dessus. Dans ce cas, il est proposé qu’une fois recruté au niveau des lésions de l’ADN, Rad9 est hyperphosphorylé par Mec1, cette hyperphosphorylation de Rad9 agit comme un adaptateur moléculaire facilitant l’amplification du signal : la phosphorylation de plusieurs sites SQ/TQ2 sur Rad9 permet l’accrochage de Rad53 qui se fixe au niveau de ces sites de phosphorylation via ces deux domaines FHA (Durocher et al., 1999; Finn et al., 2011). Ainsi Rad53 se rapproche physiquement de Mec1 facilitant la phosphorylation de Rad53 par Mec1. Rad9 en s’oligomérisant agit également en permettant le rapprochement de plusieurs molécules de Rad53 ce qui engendre leur autophosphorylation en trans (Finn et al., 2011).
2 Le site SQ/TQ est un site constitué d’une sérine ou une thréonine suivie d’une glutamine et qui est la cible de phosphorylations.
L’oligomérisation de Rad9 n’apparaît pas comme étant indispensable pour l’activation initiale de Rad53, cependant elle est requise pour maintenir l’activation de Rad53 et l’arrêt du cycle cellulaire induit par les réponses aux dommages de l’ADN (Usui et al., 2009).
En analysant Rad53 en réponse aux dommages de l’ADN par spectrométrie de masse, Sweeney et al. (Sweeney et al., 2005) ainsi que Smolka et al. (Smolka et al., 2005) ont chacun identifié différents sites de phosphorylation (Figure I4), au final ce ne sont pas moins de trente-deux sites phosphorylés qui ont été révélés (Clemenson and Marsolier-Kergoat, 2009). Parmi ces sites, certains sont phosphorylés par Rad53 lui-même. A noter que sept d’entre eux sont constitutivement phosphorylés en absence de tout dommage de l’ADN (Clemenson and Marsolier-Kergoat, 2009).
Une hypothèse intéressante a été proposée par Pellicioli et Foiani, suggérant qu’en fonction de la nature de la lésion dans l’ADN, la phosphorylation en trans de Rad53 par Mec1 est non seulement requise pour l’activation de Rad53, mais également permettrait de diriger Rad53 vers les cibles cellulaires appropriées, en créant une phospho-interface spécialisée de Rad53 (Fiorani et al., 2008; Pellicioli and Foiani, 2005).

aux multiples effets

L’activation de cette voie de transduction du signal aboutit alors à de multiples effets (Figure I3) permettant de réparer la lésion avant que la cellule ne passe à la phase du cycle cellulaire suivante.

La régulation du cycle cellulaire

Lorsqu’un dommage est difficile à réparer, la machinerie de réponse aux dommages de l’ADN ralenti la progression du cycle cellulaire pour laisser plus de temps à la cellule pour réparer la lésion (Bartek et al., 2007).
Rad53 a diverses cibles dans le cycle cellulaire, dont notamment le complexe Cdc7-Dbf4 (Dohrmann et al., 1999). CDC7 code une kinase sérine/thréonine essentielle pour l’initiation de la phase S chez S.cerevisiae (Dohrmann et al., 1999; Donaldson et al., 1998), son activité kinase est requise pour l’initiation de la réplication (Dohrmann et al., 1999; Donaldson et al., 1998; Hollingsworth et al., 1992; Jackson et al., 1993). Cdc7 interagit physiquement avec la protéine Dbf4, qui voit son expression varier au cours du cycle cellulaire, et l’association de ces deux protéines est requise pour activer l’activité kinase de Cdc7 (Dohrmann et al., 1999; Jackson et al., 1993). Rad53 est capable d’interagir physiquement avec Dbf4 et d’en moduler son expression à la fois transcriptionnellement et au niveau protéique (Dohrmann et al., 1999). Rad53 activé en réponse à un blocage de fourche phosphoryle Dbf4 ce qui conduit à sa libération du complexe de reconnaissance des origines de réplication (ORC) (Duncker et al., 2002). Par conséquent, il inhiberait l’activation des origines tardives (Duncker et al., 2002).
Rad53 a, également, pour cible la protéine Swi6, l’un des composants du facteur de transcription SBF (Swi4/6-dependant cell cycle box binding factor) qui inhibe la transcription des cyclines G1/S (Cln1 et Cln2) (Sidorova and Breeden, 1997). L’activation de Rad53 et Chk1 inhibe l’entrée en anaphase en inhibant notamment la dégradation de Pds1 (Finn et al., 2011).
Lors d’un stress réplicatif, la progression dans la phase S ralentit en partie grâce à la phosphorylation de RPA et l’inhibition de la polymérase-primase (Finn et al., 2011). Rad53 inhibe indirectement la phosphorylation de cette polymérase empêchant l’initiation de la synthèse d’ADN en aval de la lésion (Finn et al., 2011).
Chez S. cerevisiae, Rad53 phosphoryle également la protéine Sld3 rendant impossible son interaction avec les protéines de réplication Dpb11 et Cdc45 qui sont toutes les deux requises pour l’initiation de la réplication de l’ADN, ainsi l’activation des origines tardives sera empêchée (Finn et al., 2011; Lopez-Mosqueda et al., 2010). Le même phénomène est observable chez les mammifères, en réponse à un stress réplicatif, la voie ATM/ATR-CHK1/CHK2 prévient l’initiation de la réplication en inhibant le chargement du facteur d’initiation de la réplication Cdc45 au niveau des origines de réplication (Andreassen et al., 2006; Finn et al., 2011).
De même, l’activation de CHK2 chez les mammifères entraîne la phosphorylation de la phosphatase Cdc25A, la dirigeant vers sa dégradation par le protéasome (Andreassen et al., 2006; Finn et al., 2011; Kerzendorfer and O’Driscoll, 2009). La dégradation de Cdc25A empêche la déphosphorylation et donc l’activation du complexe CDK2-cycline E qui est requis pour l’entrée en phase S. L’activation de CHK2 conduit également à une stabilisation du suppresseur de tumeur p53 qui active l’induction de la transcription de l’inhibiteur de CDK ; p21, qui lui-même inhibe l’activité du complexe CDK2-cycline E (Finn et al., 2011; Kerzendorfer and O’Driscoll, 2009).
Chez la levure fissipare Schizosaccharomyces pombe, Chk1 inhibe l’activité de la CDK Cdc2 en ciblant la kinase Wee1 et la phosphatase Cdc25. La phosphorylation de Wee1 stabilise la protéine assurant la phosphorylation de Cdc2, alors que la phosphorylation de Cdc25 favorise son association avec la protéine Rad24 qui séquestre alors Cdc25 dans le cytoplasme empêchant ce dernier de déphosphoryler Cdc2 (Finn et al., 2011).

La régulation de la transcription de certains gènes

Les protéines kinases effectrices ciblent aussi la transcription de certains gènes.
Par ailleurs de nombreuses analyses transcriptomiques ont été réalisé chez S.cerevisiae afin d’identifier de nouveaux composants des voies répondant à divers dommages de l’ADN ; les radiations ionisantes, les radiations UV, les agents alkylants (principalement le MMS), la camptothécine (un inhibiteur de la topoisomérase I), la bléomycine, et le cisplatine (Davidson and Brown, 2009).
Un premier crible chimio-génomique (criblage d’une librairie de fusion lacZ en présence d’UV, 4NQO, methotrexate ou radiations gamma) a été réalisé par Szostak (Fu et al., 2008; Ruby et al., 1983; Ruby and Szostak, 1985) et a permis d’isoler six gènes « damage-inducible » (DIN). Un second crible réalisé en 1984 par McClanahan et McEntee a permis lui d’isoler quatre gènes « DNA Damage Responsive » (DDR), mais il a également permis d’isoler des gènes dont l’expression diminuait en réponse aux dommages de l’ADN (Fu et al., 2008; McClanahan and McEntee, 1984). A eux deux, ces cribles ont identifié dix nouveaux gènes induits par les dommages de l’ADN (DIN/DDR) et quatre gènes sous exprimés (Fu et al., 2008; McClanahan and McEntee, 1984).
La première réelle analyse transcriptomique a été réalisée en 1999 par Jelinsky et Samson (Fu et al., 2008; Jelinsky and Samson, 1999). Cette dernière a été effectuée en présence de l’agent alkylant MMS à 0,1% durant une heure (Jelinsky and Samson, 1999). Dans ces conditions, pas moins de 325 gènes (dont RNR1, RNR2, RNR3, RNR4 (voir partie 3)) étaient induits par le traitement au MMS et 76 avaient leur expression diminuée (Fu et al., 2008; Jelinsky and Samson, 1999). Dans une autre de leurs études transcriptomiques, toujours en réponse aux dommages de l’ADN, Jelinsky et al. ont identifié Rpn4 comme un régulateur transcriptionnel putatif d’un grand nombre de gènes (Fu et al., 2008). Rpn4 est une protéine associée au protéasome et est connu pour réguler 26 des gènes du protéasome. Cette découverte pointe la possibilité que la voie ubiquitine-protéasome puisse jouer un rôle dans la réponse transcriptionnelle aux dommages de l’ADN. Cependant des études de l’équipe de Brown montreront par la suite que cette induction n’est pas spécifique des dommages de l’ADN, signe d’une réponse plutôt globale aux stress (Gasch et al., 2001).
Néanmoins un problème majeur se pose dans ces analyses transcriptomiques, les agents génotoxiques utilisés engendrent l’activation de voies annexes qui ne sont pas spécifiques des réponses aux dommages de l’ADN. Pour pallier ce problème l’équipe de Brown a comparé les « transcriptomes » obtenus en réponse aux dommages de l’ADN (MMS et radiations ionisantes) avec ceux obtenus en présence de stress environnementaux (choc thermique, stress oxydatif, stress réducteur, choc osmotique, carence en acides aminés) (Gasch et al., 2001). Au total ce sont 95 puces à ADN qui ont été analysées. Il est ressorti de ces études qu’un seul groupe de gènes était spécifique aux traitements MMS et aux radiations ionisantes (Gasch et al., 2001). Ce groupe de gènes comprend les gènes de réparation RAD51 et RAD54, les sous-unités de la Ribonucléotide Réductase RNR2 et RNR4, la kinase DUN1 et les gènes YER004W (FMP52) et YBR070C (ALG14) (Gasch et al., 2001).
Dun1 est une cible majeure de Rad53. Cette kinase est requise pour l’induction transcriptionnelle de nombreux gènes inductibles par les dommages de l’ADN, comme par exemple les sous-unités de la ribonucléotide réductase (RNR) (voir partie 3) (Branzei and Foiani, 2009; Ciccia and Elledge, 2010; Finn et al., 2011; Fu et al., 2008). La ribonucléotide réductase est l’enzyme qui catalyse l’étape limitante de synthèse des nucléotides, plus de détails sur ce complexe seront donnés dans la partie 3. Par ailleurs, il a été montré que la délétion de DUN1 affectait la transcription de plus de 1000 gènes en réponse au MMS (Fu et al., 2008) et que cette réponse était sensiblement comparable à celle observée dans les cellules mutées pour MEC1, suggérant que les effets principaux de Mec1 sur l’expression du génome passent par Dun1 (Gasch et al., 2001)
Dernièrement, une analyse transcriptomique du laboratoire de Hoshi en 2010 a révélé que seulement cinq gènes étaient induits en réponse à différents types d’irradiations (radiations ionisantes à haute énergie de transfert linéaire (LET-IR), radiations gamma) ; HUG1 (voir chapitre II), YNL194C, RNR4, RNR2 et FMP16, et un seul gène était sous exprimé de manière reproductible ; SFG1 (Mizukami-Murata et al., 2010).
A la vue des résultats obtenus dans les différentes expérimentations d’analyse transcriptomique, nous remarquons que les principaux gènes induits en réponse aux dommages de l’ADN sont ceux codant les différentes sous-unités de la RNR (voir partie 3).

L’activation de la réparation

Il existe divers voies de réparation qui prennent en charge les lésions de l’ADN. Le mésappariement des bases est réparé par mismatch repair (MMR), les petites altérations des bases de l’ADN sont réparées par excision des bases (BER). Les lésions un peu plus complexes de l’ADN telles que les dimères de pyrimidine, les liaisons intra-brin sont réparées par excision des nucléotides (NER) (Ciccia and Elledge, 2010; Warmerdam and Kanaar, 2010). En ce qui concerne les cassures de l’ADN, les cassures simples brins sont réparées par un système nommé SSBR (Single Strand Break Repair), alors que les cassures doubles brins sont réparées soit par recombinaison non homologue (NHEJ) ou recombinaison homologue (HR) (Ciccia and Elledge, 2010). A noter que la recombinaison homologue est activée spécifiquement au cours de la phase S contrairement au NHEJ qui est plutôt favorisé au cours de la phase G1 chez les mammifères (Andreassen et al., 2006; Lazzaro et al., 2009).
L’interconnexion entre la voie de réponse aux dommages de l’ADN et la réparation est supportée par le fait que de nombreux facteurs de réparation subissent des modifications post-traductionnelles de manière dépendante des checkpoints. Par exemple la voie de réponse aux dommages de l’ADN régule la maturation des cassures double brins, ce qui est une étape cruciale dans le processus de recombinaison homologue (Lazzaro et al., 2009). Les kinases des voies de réponses aux dommages de l’ADN interviennent également à des étapes plus tardives en phosphorylant et en régulant les facteurs de recombinaison Srs2, Rad55 et Slx4 (Lazzaro et al., 2009).

Table des matières

CHAPITRE I : INTRODUCTION GENERALE 
PARTIE 1 : PRELUDE 
1. L’ADN : SUPPORT DE L’INFORMATION GENETIQUE
2. LE CYCLE CELLULAIRE
PARTIE 2 : LA REPONSE AUX DOMMAGES DE L’ADN 
1. LE POINT DE DEPART : LES DOMMAGES DE L’ADN
2. UNE VOIE DE TRANSDUCTION DU SIGNAL
2.1. LA RECONNAISSANCE DU DOMMAGE
2.2. LA TRANSDUCTION DU SIGNAL
2.3. LES KINASES EFFECTRICES
2.4. RAD53 UNE KINASE CLE
3. … AUX MULTIPLES EFFETS
3.1. LA REGULATION DU CYCLE CELLULAIRE
3.2. LA REGULATION DE LA TRANSCRIPTION DE CERTAINS GENES
3.3. L’ACTIVATION DE LA REPARATION
3.4. LA MORT CELLULAIRE
4. L’INACTIVATION DES CHECKPOINTS
5. LES PATHOLOGIES LIEES A UN DEFAUT DE LA REPONSE AUX DOMMAGES DE L’ADN
PARTIE 3 : LA REGULATION DU POOL DE NUCLEOTIDES 
1. UNE REGULATION CRITIQUE
2. LA RIBONUCLEOTIDE REDUCTASE
2.1. UN COMPLEXE CONSERVE AU COURS DE L’EVOLUTION
2.2. TROIS CLASSES DE RNR
2.2.1. UN MODE DE FONCTIONNEMENT COMMUN
2.2.2. LEURS PARTICULARITES
2.2.3. APARTE SUR LES RNRS DE CLASSE I
3. LE CAS PARTICULIER DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE
4. UNE ENZYME HYPER REGULEE
4.1. ALLOSTERIQUEMENT
4.2. TRANSCRIPTIONNELLEMENT
4.2.1. AU COURS DU CYCLE CELLULAIRE
4.2.2. EN REPONSE AUX DOMMAGES DE L’ADN
4.3. ET AUTREMENT
4.3.1. REGULATION DE LA STABILITE DES SOUS-UNITES
4.3.2. REGULATION DE LA COMPARTIMENTATION SUB-CELLULAIRE DES SOUS-UNITES
4.3.3. INHIBITION PAR DES INHIBITEURS PROTEIQUES
4.3.4. INHIBITION PAR DES INHIBITEURS NON PROTEIQUES
PARTIE 4 : LES PROTEINES INTRINSEQUEMENT DESORDONNEES 
1. LE PARADIGME STRUCTURE-FONCTION
2. LA DECOUVERTE DES IDPS
2.1. LES PREMIERES EXCEPTIONS
2.2. DEFINITION D’UNE IDP
3. LES CARACTERISTIQUES DES IDPS
3.1. UNE SEQUENCE PRIMAIRE PARTICULIERE
3.2. DES PROPRIETES PHYSICO-CHIMIQUES SURPRENANTES
3.3. QUEL(S) AVANTAGE(S) A ETRE DESORDONNE ?
4. DES PROTEINES AU COEUR DES RESEAUX FONCTIONNELS
CHAPITRE II : A LA RECHERCHE DE NOUVEAUX ACTEURS DE LA REPONSE AUX DOMMAGES DE L’ADN 
PARTIE 1 : L’ALLELE RAD53-DL 
1. UN ALLELE MIMETIQUE
2. DES SUPPRESSEURS MULTICOPIES
3. DES INTERACTANTS GENETIQUES
4. ANALYSE TRANSCRIPTOMIQUE
PARTIE 2 : HUG1 
1. DE NORF A ORF
2. CINQ GÈNES UNE FAMILLE
2.1. SML1 (SUPPRESSOR OF MEC1 LETALITY)
2.2. SPD1 (S-PHASE DELAYED)
2.3. DIF1 (DAMAGE-REGULATED IMPORT FACILITATOR)
3. HYPOTHESES DE LA FONCTION DE HUG1
CHAPITRE III : DE LA GENETIQUE A LA BIOPHYSIQUE DE HUG1 
PARTIE 1 : LES REGULATIONS DE HUG1 
1. QUEL(S) PHENOTYPE(S) POUR HUG1 ?
2. UNE REGULATION EN REPONSE AUX DOMMAGES DE L’ADN
2.1. AU NIVEAU TRANSCRIPTIONNEL
2.2. AU NIVEAU POST-TRANSCRIPTIONNEL
2.3. AU NIVEAU SUBCELLULAIRE
3. UNE REGULATION AU COURS DU CYCLE CELLULAIRE
PARTIE 2 : HUG1 EST UNE PROTEINE INTRINSEQUEMENT DESORDONNEE 
1. PREDICTION DE STRUCTURE ET DE DESORDRE
2. ANALYSES PAR CHROMATOGRAPHIE D’EXCLUSION
3. ANALYSES PAR DICHROÏSME CIRCULAIRE
3.1. PRINCIPE ET APPLICATIONS
3.2. UN SPECTRE DE PROTEINE DESORDONNEE
3.3. UN PROFIL TYPIQUE D’UNE IDP
4. CONFIRMATION PAR RESONANCE MAGNETIQUE NUCLEAIRE
4.1. PRINCIPE ET APPLICATIONS
4.2. UNE PROTEINE TOTALEMENT DESORDONNEE
PARTIE 3 : A LA RECHERCHE DE PARTENAIRES PHYSIQUES 
5. ELABORATION D’UN CRIBLE DOUBLE HYBRIDE A GRANDE ECHELLE
5.1. PRINCIPE GENERAL
5.2. MISE AU POINT DU CRIBLE
5.3. REALISATION DU CRIBLE UTILISANT GAL4DBD-HUG1 COMME APPAT
6. PETIT APARTE SUR DNA2
6.1. INTRODUCTION
6.2. ETUDE DE L’INTERACTION ENTRE HUG1 ET DNA2
CHAPITRE IV : ETUDE DE L’INTERACTION ENTRE HUG1 ET LA RNR 
PARTIE 1 : UNE INTERACTION PHYSIQUE AVEC LA RIBONUCLEOTIDE REDUCTASE 
1. ET LA RIBONUCLEOTIDE REDUCTASE ?
2. ETUDES DE L’INTERACTION PHYSIQUE ENTRE HUG1 ET RNR2
2.1. MISE EN EVIDENCE DE L’INTERACTION IN VIVO PAR IMMUNOPRECIPITATION
2.2. TESTS MISE EN EVIDENCE DE L’INTERACTION IN VITRO
2.2.1. PAR GST-PULL DOWN
2.2.2. PAR SURFACE PLASMONIQUE DE RESONANCE
2.2.3. PAR RESONANCE MAGNETIQUE NUCLEAIRE (RMN)
PARTIE 2 : CARACTERISATION DE LA SURFACE D’INTERACTION 
1. PAR DOUBLE HYBRIDE
2. PAR RESONANCE MAGNETIQUE NUCLEAIRE
PARTIE 3 : ETUDES BIOPHYSIQUE DU MUTANT HUG1GY 
1. ANALYSE DU PROFIL DE CHROMATOGRAPHIE D’EXCLUSION
2. PAS DE MODIFICATION DU SPECTRE DE DICHROÏSME CIRCULAIRE
PARTIE 4 : COMPARAISON DES FONCTIONS DE DIF1 ET HUG1 
1. DEUX DOMAINES HUG
2. RELOCALISATION DE LA PETITE SOUS-UNITE
3. DECOUVERTE D’UN NOUVEAU PHENOTYPE POUR LA DELETION DE HUG1
CHAPITRE V : CONCLUSIONS ET DISCUSSIONS 
PARTIE 1 : HUG1 EST UN NOUVEAU REGULATEUR DE LA RNR 
1. HUG1 EST UNE PROTEINE INTRINSEQUEMENT DESORDONNEE
2. … QUI INTERAGIT PHYSIQUEMENT ET GENETIQUEMENT AVEC LA RNR
PARTIE 2 : PROPOSITION D’UN MODELE DE FONCTIONNEMENT DE HUG1 
PARTIE 3 : DE NOUVELLES PERSPECTIVES DANS LA REGULATION DES REPONSES AUX DOMMAGES DE L’ADN 
MATERIELS ET METHODES 
SOUCHES ET PLASMIDES 
1. MANIPULATION DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE
2. SOUCHES BACTERIENNES
3. PLASMIDES
ANALYSES PHENOTYPIQUES 
EXTRACTION DES ACIDES NUCLEIQUES 
1. EXTRACTIONS D’ADN
1.1. EXTRACTION D’ADN PLASMIDIQUE ET GENOMIQUE A PARTIR DE CULTURE DE LEVURE
1.2. EXTRACTION D’ADN PLASMIDIQUE A PARTIR DE CULTURES DE E.COLI
2. EXTRACTION D’ARN A PARTIR DE CULTURES DE LEVURE
TRANSCRIPTION INVERSE-PCR QUANTITATIVE
1. TRANSCRIPTION INVERSE
2. PCR QUANTITATIVE
EXTRACTIONS PROTEIQUES DENATURANTES A PARTIR DE CULTURE DE LEVURE  WESTERN BLOT 
1. GEL POLYACRYLAMIDE
2. TRANSFERT SUR MEMBRANE
3. REVELATION
DOUBLE HYBRIDE 
1. CRIBLE A GRANDE ECHELLE
2. IDENTIFICATION DES CLONES
3. EXTRACTION DES « PLASMIDES PROIES »
4. TESTS DIRIGES
ETUDES DU CYCLE CELLULAIRE 
1. SYNCHRONISATION A L’a-FACTOR
2. SYNCHRONISATION AU NOCODAZOLE
3. ANALYSES PAR FACS (FLUORESCENCE ACTIVATED CELL SORTING)  IMMUNOFLUORESCENCE 
PRODUCTION ET PURIFICATION PROTEIQUE 
1. HUG1
1.1. PRODUCTION DE HUG1 RECOMBINANTE NON MARQUEE DANS E. COLI
1.2. PRODUCTION DE HUG1 RECOMBINANTE MARQUEE DANS E. COLI
1.3. PURIFICATION DE HUG1
2. RNR2 ET RNR2-RNR4
2.1. PRODUCTION DE RNR2 OU RNR2-RNR4 DANS E. COLI
2.2. PURIFICATION DE RNR2
2.3. PURIFICATION DE RNR2-RNR4
PRODUCTION D’ANTICORPS POLYCLONAUX 
ANALYSES BIOPHYSIQUES DE HUG1 
1. DICHROÏSME CIRCULAIRE
2. ANALYSE PAR FILTRATION SUR GEL
3. RESONANCE MAGNETIQUE NUCLEAIRE
3.1. ACQUISITION DES SPECTRES
3.2. ATTRIBUTION DES PICS
3.3. CALCUL DES INDICES DE DEPLACEMENT CHIMIQUE
ETUDES DE L’INTERACTION HUG1-RNR 
1. GST PULL-DOWN
1.1. COOEXPRESSISON DE HUG1 ET RNR2
1.2. CO-LYSE DE HUG1 ET RNR2 OU RNR2-RNR4
2. ANALYSE PAR RESONANCE PLASMONIQUE DE SURFACE (BIACORE®)
2.1. AVEC IMMOBILISATION D’ANTICORPS ANTI-GST
2.2. AVEC IMMOBILISATION DE RNR2-RNR4
3. RMN : TITRATION PAR RNR2-RNR4
RÉFÉRENCES 
REMERCIEMENTS.

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