Soutenance mémoire
L’ADN, ses lésions et sa réparation
La molécule support de l’information génétique
En 1865, lorsque le moine et botaniste Gregor J. Mendel publie le résultat de ses expériences de croisements de petits pois (Jay 2001), réalisées dans le jardin du monastère de Brünn, et conclut qu’il existe une notion de caractères héréditaires partiellement transmissibles d’une génération à l’autre, il ne se doute pas que l’acide désoxyribonucléique (ADN) est le support de cette hérédité. L’ADN est découvert peu d’années plus tard : en 1869, le physicien/biologiste suisse Friedrich Miescher, travaillant sur la composition chimique des leucocytes, remarque la présence d’un précipité blanc d’une substance inconnue (riche en phosphore, ni protéique ni lipidique) qu’il appelle alors nucléine puisqu’isolée à partir du noyau des cellules sanguines en question (Dahm 2008). Les découvertes autour de la structure de l’ADN se succèdent au cours de la première partie du XXème siècle, mais c’est seulement en 1944 qu’Avery, MacLeod et Mc Carty (Avery et al. 1944) suggèrent que l’ADN est le support de l’hérédité, hypothèse confirmée en 1952 par Hershey et Chase (Hershey et al. 1952). S’appuyant sur les analyses aux rayons X de Franklin (Franklin et al. 1953) et Wilkins (Wilkins et al. 1953), Watson et Crick résolvent la structure de l’ADN . Ils proposent un modèle en double hélice, où des liaisons hydrogènes relient les deux brins d’ADN, de manière spécifique entre une adénine et une thymine ou une guanine et une cytosine (Watson et al. 1953). En 1958 Meselson et Stahl démontrent le mode semiconservatif de la réplication de l’ADN (Meselson et al. 1958). Les découvertes autour de l’ADN ont constitué et constituent toujours des avancées considérables pour la science. L’ADN, assisté de l’épigénome, contient toutes les informations nécessaires à une cellule pour son développement et son fonctionnement.
la synthèse des protéines, qui participent à tous les processus biologiques, et la transmission fidèle de l’information génétique. La propagation de la vie dépend de l’intégrité chimique du polymère héréditaire qu’est l’ADN. Cependant, ce dernier est une molécule réactive et peut être endommagé par de nombreux agents. D’origine exogène ou endogène, ces agents conduisent à l’apparition de lésions dans le génome qui peuvent avoir des conséquences sévères au niveau cellulaire. On estime qu’il se produit environ 10 000 lésions par cellule et par jour (Friedberg et al. 2006). Les modifications de l’ADN peuvent engendrer des mutations qui altèrent la séquence de nucléotides et conduisent à l’apparition de cancers chez les mammifères. D’autres lésions interfèrent avec les processus cellulaires tels que la réplication et la transcription et s’avèrent délétères pour la cellule (Scharer 2003).
Les attaques subies par la molécule d’ADN et les dommages occasionnés
Les sources endogènes et lésions associées
Produits du métabolisme cellulaire normal
Le métabolisme cellulaire lui-même est susceptible d’endommager l’ADN. Ici réside ce que l’on nomme parfois le paradoxe de la vie en aérobie (Davies 1995). En effet, si tout eucaryote à l’exception des plantes a besoin de l’oxygène pour vivre, ce dernier peut également constituer un danger pour son hôte. Certains travaux estiment que l’ADN subirait plus de 1000 attaques oxydatives par cellule et par jour (Bernstein et al. 1989). Ce danger, que l’on qualifie de stress oxydant, est du à un déséquilibre entre la production et la destruction des espèces réactives de l’oxygène (ROS, reactive oxygen species), intermédiaires réactionnels de la phosphorylation oxydative ou chaine respiratoire. Cette dernière est le siège de la production d’énergie et d’eau par la cellule, à partir de l’oxygène respiré, via 5 complexes successifs de protéines membranaires localisés dans la membrane mitochondriale interne (Shoffner 1997). Plus particulièrement, au cours de la réaction catalysée par la cytochrome oxydase du complexe IV, l’oxygène subit une réduction tétravalente aboutissant à la production d’eau :
O2 + 4 e⁻ + 4 H⁺ → 2 H2O
Dotée du plus faible potentiel d’ionisation parmi les constituants de l’ADN, la Guanine est la cible privilégiée des ROS (mis à part •OH qui s’attaque à toutes les bases sans distinction). La 8oxoG résulte non seulement de l’action d’•OH sur une guanine mais aussi d’autres mécanismes de formation, comme les réactions d’oxydations à un électron ou les attaques par l’oxygène singulet, autre ROS. La 8oxoG est de ce fait généralement considérée comme la lésion oxydative prédominante (Cadet et al. 2010).
Outre les cassures de brin, les sites abasiques et de nombreuses bases oxydées, un autre groupe de lésions, considérées comme des lésions plus volumineuses, peut également être induit par les ROS. En effet, une base purique peut établir une liaison covalente soit avec le désoxyribose au sein d’un même nucléotide soit avec une pyrimidine adjacente pour donner respectivement naissance à une cyclopurine ou un pontage intra-brin de deux nucléotides voisins (Chatgilialoglu et al. 2011). Finalement, •OH et les réactions d’oxydations à un électron sont capables d’induire la formation de deux modifications adjacentes, mais indépendantes, non reliées par une liaison covalente, dites lésions tandem dont la présence a pu être établie au sein de l’ADN isolé (Bergeron et al. 2010). Par ailleurs au sein d’oligonucléotides, la formation de 8oxoG impliquée dans une lésion tandem au voisinage d’un résidu formylamine a été établie et représente 10% du taux de 8oxoG produite (Douki et al. 2002).
Un autre processus biologique, la peroxydation lipidique, elle-même engendrée par l’augmentation du stress oxydant, entraine la production d’aldéhydes secondaires comme le 4-hydroxy-2-nonenal (4-HNE) et l’acroléine. Ces derniers forment des adduits volumineux au niveau de la molécule d’ADN (Wang et al. 2005). Enfin, certains cofacteurs de réactions enzymatiques, comme la S-adenosylmethionine (SAM), peuvent méthyler l’ADN de façon non contrôlée et former la 7 méthyladénine, la 7-méthylguanine ou encore la O 6-méthyl-guanine (Scharer 2003).
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Table des matières
INTRODUCTION
Chapitre I : Etude Bibliographique
I. L’ADN, ses lésions et sa réparation
A. La molécule support de l’information génétique
B. Les attaques subies par la molécule d’ADN et les dommages occasionnés
1. Les sources endogènes et lésions associées
2. Les sources exogènes et lésions associées
3. Conséquences des lésions de l’ADN
C. Les voies de réparation
1. La réparation par excision de base (BER)
2. La réparation par excision de nucléotides (NER)
3. La réparation des cassures double brin
4. La réparation des mésappariements (MMR)
5. La réparation par réversion directe (DDR)
6. Les pathologies associées à une déficience des systèmes de réparation de l’ADN
II. La maladie d’Alzheimer
A. L’organe touché par la maladie d’Alzheimer
1. Le cerveau : organisation et fonctions
2. Les cellules du cerveau
B. La maladie d’Alzheimer : signes cliniques et prévalence
C. Diagnostic de la maladie d’Alzheimer
D. Etiologie de la maladie d’Alzheimer
1. Découverte de la maladie et première mise en évidence de lésions cérébrales spécifiques
2. Physiopathologie de la maladie d’Alzheimer
3. Le rôle du stress oxydant dans la pathogénèse de la maladie d’Alzheimer
4. Lien entre dommages à l’ADN et apoptose dans les neurones
III. Déficience des systèmes de réparation et maladie d’Alzheimer
Objectifs
Chapitre II : Résultats
I. La lignée APP751, représentative de la maladie d’Alzheimer ?
A. Introduction
B. Résultats
1. Cinétique de production d’Aβ40 et Aβ42 par la lignée APP751
2. Evaluation de la cytotoxicité engendrée par un stress oxydant ou métallique
3. Mesure du niveau de ROS au sein des deux lignées
4. Quantification de la délétion commune de l’ADN mitochondrial des lignées mock
et APP751
5. Détection des lésions oxydatives au niveau de l’ADN nucléaire des deux lignées
C. Conclusion
II. La sécrétion du peptide Aβ entraine une dérégulation du BER
A. Introduction
B. Résultats
1. Effets du peptide Aβ sur l’expression des gènes du BER
2. Analyse de l’expression des protéines du BER
3. Evaluation de la capacité d’excision de la 8oxoG dans un substrat d’ADN génomique
4. Mesure de la capacité d’excision de petites bases endommagées par l’utilisation d’un test multiplexé : la biopuce oligonucléotidique
C. Conclusion
III. Surexpression du NER chez la lignée APP751 après un stress oxydant
A. Introduction
B. Résultats
1. Evolution de la viabilité et du potentiel clonogénique engendrés par les UVC au sein des deux lignées
2. Comparaison des profils d’expression des gènes du NER à l’état basal entre la lignée APP751 et la lignée mock
3. Comparaison des profils d’expression des gènes du NER à l’issue d’un stress oxydant ou d’un stress UVC
4. Mesure de l’activité d’excision des photoproduits par les extraits protéiques des lignées mock et APP751
5. Cinétique de réparation des photoproduits
C. Conclusion
IV. Etat des autres systèmes de réparation en présence d’Aβ
A. Introduction
B. Résultats
1. Modulation des gènes de l’HR et du NHEJ
2. Modulation des gènes du MMR
C. Conclusion
Chapitre III : Discussion générale
Conclusions et perspectives
Chapitre IV : Matériel et Méthodes
I. Culture cellulaire
A. Produits et matériel
B. Culture des lignées de neuroblastome humain
C. Congélation de cellules
D. Quantification des isoformes d’Aβ sécrétées dans le milieu de culture
E. Test de cytotoxicité après traitement par H2O2 ou CuSO4
F. Tests de cytotoxicité et de clonogénicité après expositions aux UVC
G. Préparation de cellules traitées sous la forme de culots secs ou conservés dans du milieu de congélation
II. Evaluation du stress oxydant et des dommages à l’ADN
A. Mesure des ROS par cytométrie en flux
B. Evaluation des dommages à l’ADN nucléaire par la technique des comètes
C. Evaluation des dommages à l’ADN par spectrométrie de masse
1. Extraction et digestion de l’ADN
2. Hydrolyse de l’ADN
D. Quantification de la délétion commune dans l’ADN mitochondrial
1. Préparation du lysat
2. Amplification des ADN nucléaire, mitochondrial total et mitochondrial délété par qPCR en temps réel
CONCLUSION
