L’ADN et les cassures double brin 

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Formation accidentelle des CDB

Les cassures double brin sont l’accumulation de deux cassures simple brin (rupture de la liaison phosphodiester entre deux nucléotides) sur les deux brins opposés d’un même chromosome , sur un espace restreint (de 0 à 250 paires de bases in vitro )), autorisant la rupture de la continuité de celui ci. Les facteurs impliqués dans la générati on de ces CDB sont nombreux et pour la plupart des agents connus pour leur toxicité et leur implication dans l’apparition de cancers. On trouve ainsi des agents d’origine exogène tels que les rayonnements ionisants ainsi que des facteurs endogènes tels que les espèces réactives de l’oxygène ou d es activités enzymatiques agissant sur l’ADN (ligases, polymérases, topoisomérases, …) interrompues en cours de cycle catalytique . L’ensemble de ces facteurs exogènes conduit en général à la formation d’environ 10 à 50 CDB par cellule et par jour (Haber, 1999; Vilenchik and Knudson, 2003). Il est cependant notable que ces lésions ne représentent qu’une petite partie de l’ensemble des lésions que peut subir l’ADN (on estime à environ 75 000 lésions de l’ADN par cellule et par jour (Lindahl and Nyberg, 1972)), qui peuvent pour certaines condu ire dans un second temps à des CDB comme les sites abasiques

Les cassures induites par les rayonnements ionisants

Les organismes sont constamment soumis à des agressions par les rayonnements ionisants.
Ces rayonnements sont d’ origine soit naturelle (Ra yons X, UV provenant du soleil , ou rayonnements radioactifs terrestres) ou humaine (la radiothérapie est le cas le plus fréquent, mais on trouve aussi les cas d’accident nucléaire tels que Tchernobyl ou Fukushima L es rayonnements ionisants ont l a propriété de pouvoir interagir avec les molécules du vivant. On peut différencier les rayonnements électromagnétiques ( UV, rayonnement X ou γ) des rayonnements particulaires (particule α, β+ et β –) qui n’auront pas les même cibl es de dégradation, mais qui auront tous pour conséquence d’induire la rupture de liaisons covalentes. Toutes les molécules d’une cellule peuvent être altérées par l’action des RI, cependant l’ADN est la cible la plus sensible. Du fait de peuvent être altérées par l’action des RI, cependant l’ADN est la cible la plus sensible. Du fait de son unicité, de son métabolisme, et de soson unicité, de son métabolisme, et de son importance métabolique, une rupture de liaison sera n importance métabolique, une rupture de liaison sera compromettante pour le maintien de la vie cellulaire et de l’intégritécompromettante pour le maintien de la vie cellulaire et de l’intégrité du génomedu génome..
Du fait de la complexité de structure des molécules d’ADN, on distingue plusieurs types de lésionlésion radioradio–induites (clainduites (classées selon ssées selon leur leur fréquence d’apparition) que l’on qualifiera de lésionfréquence d’apparition) que l’on qualifiera de lésionss d’origine exogène :d’origine exogène :
• Les cassures simpleLes cassures simple–brinbrin (1000/Gy/cellule)(1000/Gy/cellule)
• Les Les modifications de bases (non déterminé)modifications de bases (non déterminé)
• L’oxydation des désoxyribosesL’oxydation des désoxyriboses (2000/Gy/cellule)(2000/Gy/cellule)
• Les pontages covalents inter Les pontages covalents inter ou intra brinou intra brin (30/Gy/cellule (30/Gy/cellule)
• Les cassures doubleLes cassures double–brin (40/Gy/cellule)brin (40/Gy/cellule)
Les CDBLes CDB peuvent être formées de manière directe avec l’action des RI sur les liaisons covalentes peuvent être formées de manière directe avec l’action des RI sur les liaisons covalentes de l’ADN. Le passage d’un premier rayonnement génèrera une première cassure simple brinde l’ADN. Le passage d’un premier rayonnement génèrera une première cassure simple brin. L. Lors ors du passage d’une seconde particule irradiée, sur le brin opposédu passage d’une seconde particule irradiée, sur le brin opposé, l’appar, l’apparition d’une seconde cassure ition d’une seconde cassure simple brin pourra conduire à la formation d’une CDB simple brin pourra conduire à la formation d’une CDB (Siddiqi and Bothe, 1987)(Siddiqi and Bothe, 1987). .
La seconde manière de former des CDB est dite indirecte. Elle fait appel à l’intervention d’une étape de transfert étape de transfert de l’énergie des RI par une molécule intermédiaire. La plus fréquente de ces de l’énergie des RI par une molécule intermédiaire. La plus fréquente de ces molécules de transfert est l’eau. Par l’abondance et la composition chimique de ce solvant, les molécules de transfert est l’eau. Par l’abondance et la composition chimique de ce solvant, les interactions interactions eeauau–RI sont très nombreuses et conduisent à la formation de dérivés teRI sont très nombreuses et conduisent à la formation de dérivés tels que les ions ls que les ions superoxydes et les dérivés radicalaires de l’eau (Fig I.2) (d’après «superoxydes et les dérivés radicalaires de l’eau (Fig I.2) (d’après « Ionizing radiation and lifeIonizing radiation and life », », Arena, 1971). Ces dérivés sont appelés espèces réactives de l’oxygèneArena, 1971). Ces dérivés sont appelés espèces réactives de l’oxygène3. Ces ERO peuvent être . Ces ERO peuvent être formées partout dans la cellule, et formées partout dans la cellule, et elles elles diffdiffusent rapidement. Si l’une d’entre usent rapidement. Si l’une d’entre elleselles se retrouve à se retrouve à côté d’une molécule d’ADN, elle côté d’une molécule d’ADN, elle peutpeut altérer sa structure chimique grâce à ses propriétés altérer sa structure chimique grâce à ses propriétés d’oxydod’oxydo–réduction. Suivant le degré d’oxydation de la molécule d’ADN suite à cette rencontre, on réduction. Suivant le degré d’oxydation de la molécule d’ADN suite à cette rencontre, on aura une ruptuaura une rupture directe d’une liaison covalente et formation d’une CSB re directe d’une liaison covalente et formation d’une CSB (Friedberg et al., 1987)(Friedberg et al., 1987).. OOn pn peut aussieut aussi avoir uavoir uniquement une oxydatiniquement une oxydation des baseson des bases. Cette dernière sera prise en charge par . Cette dernière sera prise en charge par la voie de réparation par excision de basela voie de réparation par excision de base4 BER. BER. La voie BER peut La voie BER peut génèrer des CSB génèrer des CSB notamment notamment lorsqu’un grand nombre de dommages oxydatifs est présent dans la cellule. Dans les étapelorsqu’un grand nombre de dommages oxydatifs est présent dans la cellule. Dans les étapes s intermédiaires de cette voie BER, il y a formation de CSB ou de sites abasiques susceptibles de intermédiaires de cette voie BER, il y a formation de CSB ou de sites abasiques susceptibles de donner naissance à des CSB donner naissance à des CSB (Boiteux et al., 2017)(Boiteux et al., 2017). Si ces CSB sont à proximité, les dommages . Si ces CSB sont à proximité, les dommages oxydatifs peuvent ainsi donner lieu à des CDBoxydatifs peuvent ainsi donner lieu à des CDB(Seeberg et al., 1995; Vispé et al., 2000)(Seeberg et al., 1995; Vispé et al., 2000)..
Figure I.2 :: Mécanisme de formation des ERO par interaction de molécule d’eau avec des RI. LMécanisme de formation des ERO par interaction de molécule d’eau avec des RI. Les espèces dont le es espèces dont le nom est en rouge sont les espèces «nom est en rouge sont les espèces « stablesstables » (τ» (τ1/21/2= 10= 10–66s) qui peuvent interagir avec les molécules d’ADN. s) qui peuvent interagir avec les molécules d’ADN. Les deux Les deux espèces majoritaires produites sont cependant les radicaux hydroxyl (HO°) et les ions superoxydes (Oespèces majoritaires produites sont cependant les radicaux hydroxyl (HO°) et les ions superoxydes (O22°°–//HOHO22°°)) (encadrés en vert sur la figure)(encadrés en vert sur la figure)..
Les lésions es lésions radioradio–induites induites exogènes exogènes conduiconduisentsent à la génération d’une grande diversité d’extrémité à la génération d’une grande diversité d’extrémité d’ADN, nécessitant une forte adaptabilité des systèmes de réparation d’ADN, nécessitant une forte adaptabilité des systèmes de réparation pour pallier pour pallier à à celacela (on (on dénombre au moindénombre au moins une dizaine de modifications courantes (Cf §s une dizaine de modifications courantes (Cf §Variété des extrémités d’ADN Variété des extrémités d’ADN présentes lors de la formation de CDB accidentellesprésentes lors de la formation de CDB accidentelles)). )). Dans les chapitres suivants, nous verronDans les chapitres suivants, nous verronss que certaines CDB sont issues de processus cellulaires spécifiques et que les molécuque certaines CDB sont issues de processus cellulaires spécifiques et que les molécules d’ADN les d’ADN peuvent être peuvent être endommagées suite à une interruption accidentelle d’une étape duendommagées suite à une interruption accidentelle d’une étape du métabolismemétabolisme de de l’ADN (réplication, ligation compaction/décompaction, …)l’ADN (réplication, ligation compaction/décompaction, …)

Formation de CDB suite à dFormation de CDB suite à des activités Topoisomérases avortéeses activités Topoisomérases avortées

La topologie

La topologie de l’ADN estde l’ADN est un paramètreun paramètre finement régulé. Dans une cellule quiescente, l’ADN finement régulé. Dans une cellule quiescente, l’ADN nucléaire nucléaire estest en partie en partie enroulé autour de complexes d’histoneenroulé autour de complexes d’histoness (hétérochromatine). L(hétérochromatine). Lors des ors des différents processus cellulaires tels que la transcription et plus globalement le métabolisme de différents processus cellulaires tels que la transcription et plus globalement le métabolisme de l’l’ADN des contraintes topologiques apparaiADN des contraintes topologiques apparaissentssent. Si ces contraintes ne sont pas relâchées, la . Si ces contraintes ne sont pas relâchées, la poursuite du cycle cellulaire sera impossible. Des enzymes spécifiquespoursuite du cycle cellulaire sera impossible. Des enzymes spécifiques, les topoisomérases, les topoisomérases permettpermetteent de relaxer cette contraintent de relaxer cette contrainte. Cette action se déroule en trois . Cette action se déroule en trois temps.temps. En premier, les En premier, les topoisomérasestopoisomérases créecréentnt une coupure transitoire de la molécule d’ADNune coupure transitoire de la molécule d’ADN, puis il y a , puis il y a relaxation relaxation topologique des brins (par action physique simple ou utilisation d’énergie sous forme d’ATP), topologique des brins (par action physique simple ou utilisation d’énergie sous forme d’ATP), et et enfin ellesenfin elles relirelientent les deux brins d’ADNles deux brins d’ADN (Figure I.3)(Figure I.3). On distingue plusieurs classes de . On distingue plusieurs classes de topoisomérases selon leur substrat. Les topoisomérases de classe I sont des enzymes topoisomérases selon leur substrat. Les topoisomérases de classe I sont des enzymes monomériques qui ne créent qu’une coupure simple brin, et les topoisomérases de classe II, monomériques qui ne créent qu’une coupure simple brin, et les topoisomérases de classe II, homodimériques, génèhomodimériques, génèrentrent une couune coupure doublepure double–brin. Ces deux classes d’enzymes contiennent brin. Ces deux classes d’enzymes contiennent plusieurs représentants qui diffè
plusieurs représentants qui diffèrentrent de par leur de par leur cyclecycle catalytique. Ainsi lors de l’action de ces catalytique. Ainsi lors de l’action de ces enzymes, des intermédiaires covalents de type phosphotyrosylenzymes, des intermédiaires covalents de type phosphotyrosyl–ADN ADN sontsont créés impliquant des créés impliquant des extrémitéextrémités 3’ ou 5’ de l’ADN. C’est lors de la formation de ces intermédiaires qu’un s 3’ ou 5’ de l’ADN. C’est lors de la formation de ces intermédiaires qu’un dysfonctionnement dysfonctionnement peutpeut conduire à une lésion de type adduit covalent peptideconduire à une lésion de type adduit covalent peptide–ADN.ADN.
Pour réaliser cette action de relaxation de l’ADN, les topoisomérases de classe I (TOP1) possèdentpossèdent une tyrosine catalytique qui une tyrosine catalytique qui effectueeffectue une attaque nucléophile sur un phosphate de une attaque nucléophile sur un phosphate de l’ADN et crée une coupure simple brin avec création d’un lien covalent entre l’enzyme et le l’ADN et crée une coupure simple brin avec création d’un lien covalent entre l’enzyme et le substrat substrat (Roca, 1995)(Roca, 1995). Ceci pe. Ceci permet de maintenir les deux extrémités d’ADN à proximité lors de rmet de maintenir les deux extrémités d’ADN à proximité lors de tout le processus catalytique. Une fois que la tension de l’ADN est relaxée, la topoisomérase tout le processus catalytique. Une fois que la tension de l’ADN est relaxée, la topoisomérase relierelie les deux brins coupés pour reformer un brin d’ADN complet. les deux brins coupés pour reformer un brin d’ADN complet.

Les topoisomérases de classe II

Les topoisomérases de classe II (TOP2) réalisent une coupure double(TOP2) réalisent une coupure double–brin de l’ADN de la même brin de l’ADN de la même manière que peut le faire une enzyme de restriction de classe 2, c’estmanière que peut le faire une enzyme de restriction de classe 2, c’est–àà–dire sur le site de fixation dire sur le site de fixation de de l’l’enzyme à l’ADN avec un décalage de quelques bases entre les deux point de coupure enzyme à l’ADN avec un décalage de quelques bases entre les deux point de coupure ((fréqufréquemment un décalage deemment un décalage de 44 nucléotides est observénucléotides est observé). Cette coupure est ). Cette coupure est réalisée par réalisée par une une réaction de transréaction de trans–esterification esterification catalysée par l’actioncatalysée par l’action d’une tyrosine dans le site actif ded’une tyrosine dans le site actif de chaquechaque monomère monomère (Roca, 1995)(Roca, 1995). Une fois que la CDB . Une fois que la CDB est forméeest formée, les brins d’ADN , les brins d’ADN sont croiséssont croisés en en passant par lpassant par la coupure a coupure créécrééee par l’enzymepar l’enzyme (Fig I.3)(Fig I.3)..
Figure I.3 :: Mécanisme d’action des topoisomérases de classe 2. Le cycle catalytique se déroule en 5 étapes dont une Mécanisme d’action des topoisomérases de classe 2. Le cycle catalytique se déroule en 5 étapes dont une fait appel à la création d’une CDB pour permettre le passage fait appel à la création d’une CDB pour permettre le passage de la seconde hélice d’ADN de la seconde hélice d’ADN dans la poche de transfert dans la poche de transfert aussi appelé segment aussi appelé segment TT. . L’interruption du cycle catalytique de la TOP2 peut induire une CDBL’interruption du cycle catalytique de la TOP2 peut induire une CDB au sein du génomeau sein du génome..
Les deux classes d’enzyme TOP1 et TOP2 sont essentielles pour le maintien de l’intégrité du génome lors de la réplication et de la transcription.génome lors de la réplication et de la transcription. Les cellules tumoraLes cellules tumorales sont plus sensibles que les sont plus sensibles que les cellules saines à une inhibition de la les cellules saines à une inhibition de la réplicationréplication. Des traitements anti. Des traitements anti–cancéreux ont été cancéreux ont été développés avec pour cibles TOP1 et TOP2. développés avec pour cibles TOP1 et TOP2. On On peutpeut citer la camptothecin qui est un inhibiteur citer la camptothecin qui est un inhibiteur de la TOP1, qui stabilise la forme de la TOP1, qui stabilise la forme TOP1TOP1–ADN covalemment liée et empêche l’étape de reADN covalemment liée et empêche l’étape de religation qui suit la relaxation topologique.

Un autre exemple

Un autre exemple est le est le teniposideteniposide, un, un inhibiteur de TOP 2 couramment utilisé dans les inhibiteur de TOP 2 couramment utilisé dans les traitements des leucémies infantiles et certaine tumeurs cérébrales.traitements des leucémies infantiles et certaine tumeurs cérébrales.
Ces droguesCes drogues conduiconduisentsent à un blocage à un blocage de la topoisomérase sur l’ADN et donc au blocage de la topoisomérase sur l’ADN et donc au blocage des des fourches de réplicationfourches de réplication. La finalité de ces traitements est la conduite de la cellule à l’apoptose.. La finalité de ces traitements est la conduite de la cellule à l’apoptose.

Variété des extrémités d’ADN présentes lors de la formation deVariété des extrémités d’ADN présentes lors de la formation de CDB CDB accidentellesaccidentelles

L’ADN est soumis à de nombreux stress pouvant altérer sa structure chimique.5. L’ensemble de . L’ensemble de ces lésions sont prises en charge par différentes voies de réparation qui passent par une étape où ces lésions sont prises en charge par différentes voies de réparation qui passent par une étape où il y a apparition d’une CSB qu’il faudra répil y a apparition d’une CSB qu’il faudra réparer grâce à une étape de ligation (Fig I.4).arer grâce à une étape de ligation (Fig I.4).
Figure I.4 :: Enzymes impliquées dans la maturation des extrémités 3’ et 5’ des cassures simpleEnzymes impliquées dans la maturation des extrémités 3’ et 5’ des cassures simple–brin (CSB) et doublebrin (CSB) et double–brin (CDB). La figure et la légende montre les principales fonctions chimiques et intermébrin (CDB). La figure et la légende montre les principales fonctions chimiques et intermédiaires rencontrés lors de la diaires rencontrés lors de la génération de CSB et CDB. Le nom des enzymes impliquées est encadré.génération de CSB et CDB. Le nom des enzymes impliquées est encadré. Nous noterons que l’ensemble de ces voie Nous noterons que l’ensemble de ces voie partagent la caractéristique de passer par une étape où il apparait une cassure simple brin partagent la caractéristique de passer par une étape où il apparait une cassure simple brin quiqui peut donnerpeut donner une une CDBCDB en cas d’apparation d’une seconde CSB à proximitéen cas d’apparation d’une seconde CSB à proximité. . LL’ensemble de ces mécanisme’ensemble de ces mécanismess fonctionnent sur un fonctionnent sur un schémaschéma commun qui est de commun qui est de préparerpréparer les les deux extrémitésdeux extrémités de la CDB pour qu’elle soit un substrat de la ligasede la CDB pour qu’elle soit un substrat de la ligase, à savoir, à savoir pour pour qu’elle présentequ’elle présente un 3’un 3’–OH et un 5’OH et un 5’–Phosphate. Phosphate. LaLa dernière étape commune dernière étape commune àà toutes ces voietoutes ces voiess estest l’étape de ligation l’étape de ligation par une par une ADNADN ligase.ligase. (Andres et al., 2015)(Andres et al., 2015)
On dénombre environ 30 000environ 30 000 oxydations de bases d’ADN oxydations de bases d’ADN par cellule et par joupar cellule et par jour r (Ames et al., (Ames et al., 1993)1993). La prise en charge de ces lésions par la voie de réparation BER . La prise en charge de ces lésions par la voie de réparation BER (Boiteux et al., 2017)(Boiteux et al., 2017) peut 5 Confère partie 1.1.1.1Confère partie 1.1.1.1 conduire à la formation d’une CSB qui conduire à la formation d’une CSB qui,, si elle ssi elle se trouve à proximité d’une autre lésion e trouve à proximité d’une autre lésion peut créer peut créer uneune CDB. Ce mécanisme d’apparition des CSB lors de la voie BER fait suite à l’action de deux CDB. Ce mécanisme d’apparition des CSB lors de la voie BER fait suite à l’action de deux familles d’familles d’enzymes. Premièrement, des DNA glycosylases ôteenzymes. Premièrement, des DNA glycosylases ôtentnt la base lésée et la base lésée et créént soitcréént soit un site un site abasiqueabasique6 soitsoit une incision transitoire pour les glycosylases/lyasesune incision transitoire pour les glycosylases/lyases. . Les sites abasiques créés sontLes sites abasiques créés sont pris en charge par des AP endonucléases (telle que APE1 pris en charge par des AP endonucléases (telle que APE1 (Dyrkheeva et al., 2016)(Dyrkheeva et al., 2016))) qui incisequi incisentnt la la liaison phospholiaison phospho–diester reliant le désoxyribosediester reliant le désoxyribose–phosphate au reste de la molécule d’ADNphosphate au reste de la molécule d’ADN et et laissent une CSB avec une extrémité 3’laissent une CSB avec une extrémité 3’–OH et une autre 5’OH et une autre 5’–dRP (deoxy ribosephosphate)dRP (deoxy ribosephosphate). . L’L’ADN ADN polymérase Pol β comblepolymérase Pol β comble ensuiteensuite la brèche créée la brèche créée et génère des extrémités 3’et génère des extrémités 3’–OH et 5’OH et 5’–P. LP. La ligase a ligase III III relierelie alors alors les deux les deux brinsbrins d’ADN.d’ADN.
D’autres mécanismes conduisent à l’apparition de CSB’autres mécanismes conduisent à l’apparition de CSB (Figure I.4)(Figure I.4). Nous pouvons noter . Nous pouvons noter l’introduction de ribonucléotides par les ADN polymérases processives de la réplil’introduction de ribonucléotides par les ADN polymérases processives de la réplication, l’action cation, l’action de la primase lors de la synthèse de l’amorce rNTP pour la réplication du brin tardif ou alors de la primase lors de la synthèse de l’amorce rNTP pour la réplication du brin tardif ou alors l’action de polymérases peu spécifiquel’action de polymérases peu spécifiquess de la famille des PolX de la famille des PolX (Nick McElhinny and Ramsden, (Nick McElhinny and Ramsden, 2003)2003), qui seront pris, qui seront priseses en charge par la voie de réparation des ribonucléotidesen charge par la voie de réparation des ribonucléotides7. Cette voie fait . Cette voie fait intervenir la RNAseH2 qui déteintervenir la RNAseH2 qui détecte les insertions stabilisées d’ARN dans les molécules d’ADNcte les insertions stabilisées d’ARN dans les molécules d’ADN et et les excise en hydrolysant la liaison phospholes excise en hydrolysant la liaison phospho–ester en 3’ester en 3’–OH. OH. LLes ADN polymérasees ADN polymérasess ε ou δ ε ou δ synthétissynthétisent alorsent alors unun fragment chevauchant d’ADN (fragment chevauchant d’ADN (flap flap en anglais)en anglais). Ce flap . Ce flap estest finalement clivé finalement clivé par l’par l’action de la protéine FEN1 (Flap endonuclease 1), puis la lésion action de la protéine FEN1 (Flap endonuclease 1), puis la lésion estest réparée par une dernière réparée par une dernière étape de ligation. L’importance de cette voie de réparation est confirmée par la étape de ligation. L’importance de cette voie de réparation est confirmée par la létalitélétalité embryonnaire des souris RNAseH2 embryonnaire des souris RNAseH2 –//–. . (Nick McElhinn(Nick McElhinny et al., 2010; Reijns et al., 2012)y et al., 2010; Reijns et al., 2012)..

Les cassures programméesLes cassures programmées de l’ADNde l’ADN

Dans la première partie, nous avons décrit la formation des décrit la formation des CDB CDB qui qui apparaissaient de manière apparaissaient de manière spontanée spontanée ou accidentelleou accidentelle. Nous allons voir dans cette partie. Nous allons voir dans cette partie, la formation de CDB, la formation de CDB qui qui apparaissent de manière programméeapparaissent de manière programmée. On prendra l’exemple de la recombinaison V(D)J. On prendra l’exemple de la recombinaison V(D)J, de la , de la commutation de classe isotypique commutation de classe isotypique qui se déroule dans les lignées lymphocytaires, et de la méiosequi se déroule dans les lignées lymphocytaires, et de la méiose..

Formation de CDB lors de laFormation de CDB lors de la recombinaison V(D)J lymphocytairecombinaison V(D)J lymphocytairere

La recombinaison V(D)J est un phénomène qui se déroule dans les lymphocytes B (issus de la la moelle osseuse, responsables moelle osseuse, responsables de la réponse immunitaire humorale), et les lymphocytes T (issus du de la réponse immunitaire humorale), et les lymphocytes T (issus du thymus, responsablethymus, responsabless de la réponse immunitaire cytotoxique) lors de leur maturation et de leur de la réponse immunitaire cytotoxique) lors de leur maturation et de leur spécialisation. Cette recombinaison permet le réarrangement de segspécialisation. Cette recombinaison permet le réarrangement de segmentsments des gènes V (pour des gènes V (pour variable), D (pour Diverse) et J (pour Jonction, Joining en anglais)variable), D (pour Diverse) et J (pour Jonction, Joining en anglais). La recombinaison V(D). La recombinaison V(D)J J contribuecontribue à la création de la diversité génétique des populations de lymphocytes. Ce phénomène à la création de la diversité génétique des populations de lymphocytes. Ce phénomène permet permet de combiner unde combiner un segment V (sur 50 variantsegment V (sur 50 variantss par par exempleexemple pour les chaines lourdes des pour les chaines lourdes des iimmunoglobulines (Ig)), mmunoglobulines (Ig)), unun segment D (sur 20 variantsegment D (sur 20 variantss pour les chapour les chaines lourdes des Ig) et un ines lourdes des Ig) et un segment J (sur 6 variantsegment J (sur 6 variantss pour les chaines lourdes des Ig)pour les chaines lourdes des Ig), la finalité étant la création d’un type de , la finalité étant la création d’un type de récepteur IgG parmi les 6000 possibles. Ce processus permetrécepteur IgG parmi les 6000 possibles. Ce processus permet de créer une de créer une grande diversitégrande diversité, de , de récepteurs T à la surface récepteurs T à la surface des lymphocytes T, et d’anticorps synthétisés par les lymphocytes B. des lymphocytes T, et d’anticorps synthétisés par les lymphocytes B. Ceci dans le but de répondre au mieux à une agression antigénique du non soiCeci dans le but de répondre au mieux à une agression antigénique du non soi (Fig I.5.B)(Fig I.5.B)..
Ces anticorps sont des complexes protéiques composés de deux chaines lourdes, et de deux chaines chaines légères. L’assemblage de ces protéines formera un anticorps mature présentant au niveau légères. L’assemblage de ces protéines formera un anticorps mature présentant au niveau des parties Ndes parties N–terminales une terminales une régionrégion variable (aussi appelée fragment variable Fv) et au niveau des variable (aussi appelée fragment variable Fv) et au niveau des partie Cpartie C–terminales une structure constante (aussi appelée fragment cterminales une structure constante (aussi appelée fragment cristallisable Fc) (Fig I.5.A). ristallisable Fc) (Fig I.5.A). Les chaines lourdes sont codées par un seul gène localisé sur le chromosome 22 alors que les Les chaines lourdes sont codées par un seul gène localisé sur le chromosome 22 alors que les chaines légères peuvent être codées par deux gènes différents, kappa et lambda, localisés respectivement sur les chromosomes 2 et 22respectivement sur les chromosomes 2 et 22..
Les régions variables de ces chaines légères et lourdes sont composées d’un unique assemblage de segments V et J pour les chaines légères, et V, D et J pour les chaines lourdes. C’est le segments V et J pour les chaines légères, et V, D et J pour les chaines lourdes. C’est le réarrangement des chaines V, D, et J (Fig I.5.B) qui réarrangement des chaines V, D, et J (Fig I.5.B) qui contribuera à contribuera à donnerdonner sa spécificité à sa spécificité à l’anticorps.l’anticorps. La spécificité et l’affinité de l’anticorps est augmenté dans un second temps par un La spécificité et l’affinité de l’anticorps est augmenté dans un second temps par un processus d’hypermutation somatique processus d’hypermutation somatique
Ce réarrangement est un phénomène très contrôlé car il implique la création d’une CDB sur un sitesite spécifique, puis une religation des brins réarrangés. Pour ce faire, les séquences V, D et J sont spécifique, puis une religation des brins réarrangés. Pour ce faire, les séquences V, D et J sont encadrées par des séquences RSS (pour Recombination Signal Sequence) qui encadrées par des séquences RSS (pour Recombination Signal Sequence) qui sontsont spécifiquement spécifiquement reconnues par reconnues par l’l’ndonucléases RAG1/2 (recombination activating gendonucléases RAG1/2 (recombination activating gene 1 and 2)ne 1 and 2). RAG1. RAG1 effectueeffectue une coupure simple brin grâce à une coupure simple brin grâce à son son activité activité endoendonucléase nucléase (Fugmann et al., 2000a)(Fugmann et al., 2000a). Le complexe . Le complexe nucléonucléo–protéique protéique estest stabilisé suite à cette hstabilisé suite à cette hydrolyse afin que les extrémitéydrolyse afin que les extrémités d’ADN ne ses d’ADN ne se retrouvent pas libres dans le nucléoplasme retrouvent pas libres dans le nucléoplasme (Fugmann et al., 2000b)(Fugmann et al., 2000b). . On appelle complexe On appelle complexe synaptique ou synapse, le complexe RAG1/RAG2 lié de façon stable à la CDB. synaptique ou synapse, le complexe RAG1/RAG2 lié de façon stable à la CDB. L’extrémité 3’L’extrémité 3’–OOH ainsi générée réalisH ainsi générée réalise ensuitee ensuite une attaque nucléophile sur la liaison phosphodiester du brin une attaque nucléophile sur la liaison phosphodiester du brin opposé conduisant à la rupture de cette liaison, et à la création d’une structure en épingle à opposé conduisant à la rupture de cette liaison, et à la création d’une structure en épingle à cheveux (Fig I.5.C) cheveux (Fig I.5.C) (Lu et al., 2006; Schatz and Swanson, 2011)(Lu et al., 2006; Schatz and Swanson, 2011). Cette étape étant faite sur deux . Cette étape étant faite sur deux séquences RSS à la fois, un fragment d’ADN séquences RSS à la fois, un fragment d’ADN estest excisé, circularisé et constiexcisé, circularisé et constituetue le signal de le signal de jonction. jonction.

La structure en épingle à cheveux

La structure en épingle à cheveux est ensuiteest ensuite reconnreconnue par lue par le complexee complexe DNADNA–PKPKcscs–KuKu etet la la nucléase Artémisnucléase Artémis. Artemis. Artemis possède possède une une activitéactivité endonucléase qui permetendonucléase qui permet d’ouvrir la structure en d’ouvrir la structure en épingle à cheveux épingle à cheveux (Ma et al., 2005)(Ma et al., 2005). Cette étape. Cette étape crécrééeée des extrémités d’ADN possédant 4 des extrémités d’ADN possédant 4 nucléotides sortant en 3’.nucléotides sortant en 3’. Deux des extrémités générés lors des deux CDBs sont reliés et Deux des extrémités générés lors des deux CDBs sont reliés et permettent de créér permettent de créér un nouveau cadre deun nouveau cadre de lecture ouvert conduisant à l’expression d’un anticorps lecture ouvert conduisant à l’expression d’un anticorps spécifiquespécifique. Cette réparation constitue le signal codant. Cette réparation constitue le signal codant..

Table des matières

1 Introduction 
1.1 L’ADN et les cassures double brin
1.1.1 Formation accidentelle des CDB
1.1.2 Les cassures programmées de l’ADN
1.1.3 Formation de CDB à des fins thérapeutiques
1.2 Les voies de réparation des cassures double brin
1.2.1 La réparation des CDB par recombinaison homologu e
1.2.2 Réparation des CDB par ligation directe non homologues
1.3 Les facteurs de la voie c NHEJ
1.3.1 Le complexe de reconnaissance des CDB
1.3.2 Les protéines de maturation des extrémités
1.3.3 Le complexe de ligation
1.4 Objectif du projet de thèse
2 Matériel et méthode 
2.1 Protéines et peptides des facteurs de la voie NHEJ étudiés dans cette thèse
2.1.1 Paramètres biochimiques des facteurs du NHEJ
2.1.2 Analyse de la conservation de séquence des protéines
2.2 Production des échantillons
2.2.1 Production de protéines humaines de la voie NHEJ en cellules d’insecte
2.2.2 Expression des protéines
2.2.3 Production des peptides des différents KBM
2.2.4 Production des oligonucléotides
2.3 Purification des facteurs exprimés
2.3.1 Purification de Ku70/80 et Ku70 Δ C/Ku80 Δ C, XL4 et XLF contenant des étiquettes  histidines
2.3.2 Purification de XLF sans étiquette
2.4 Caractérisation des échantillons protéiques
2.4.1 Analyse de la stoechiométrie des complexes par gel SDS PAGE
2.4.2 Analyse par chromatographie d’exclusion de tailles
2.4.3 Analyse par Dichroïsme circulaire
2.4.4 Analyse par SEC MALS
2.5 Mesures biophysiques des interactions
2.5.1 Caractérisation des interactions par microcalorimétrie
2.5.2 Caractérisation des interactions par thermophorèse à micro échelle
2.5.3 Caractérisation des interactions par résonnance plasmonique de surface
2.6 Caractérisation structurale des complexes étudiés
2.6.1 Détermination de la conformation globale par SAXS
2.6.2 Cristallisation des complexes Cristallisation des complexes protéineprotéine–peptidepeptide- ADNADN
2.6.3 Collecte des données de diffraction et intégrationCollecte des données de diffraction et intégration
2.6.4 Phasage et affinement du model cristallinPhasage et affinement du model cristallin
3 Résultats
3.1 Expression et purification des facteurs du NHEJExpression et purification des facteurs du NHEJ
3.1.1 Expression des protéines en cellules d’insecteExpression des protéines en cellules d’insecte
3.1.2 Purification du complexe de KuPurification du complexe de Ku
3.1.3 Purification de XLF et de ses mutantsPurification de XLF et de ses mutants
3.1.4 Purification du complexe XRCC4Purification du complexe XRCC4–LigIVLigIV
3.1.5 CoCo–production de Ku et XLFproduction de Ku et XLF
3.2 Analyse des complexes purifiésAnalyse des complexes purifiés
3.2.1 Analyse du repliement par Dichroïsme CirculaireAnalyse du repliement par Dichroïsme Circulaire
3.2.2 Analyse par chromatographie d’exclusion de tailleAnalyse par chromatographie d’exclusion de taille
3.2.3 Analyse des complexes purifiés parAnalyse des complexes purifiés par SECSEC–MALSMALS
3.3 Analyse des interactions du NHEJAnalyse des interactions du NHEJ
3.3.1 Analyse de l’interaction KuAnalyse de l’interaction Ku–ADNADN
3.3.2 Analyse de l’interaction KuAnalyse de l’interaction Ku–XL4XL4
3.3.3 Analyse de l’interaction KuAnalyse de l’interaction Ku–peptides KBMpeptides KBM
3.3.4 Analyse de l’interaction KuAnalyse de l’interaction Ku–XLFXLF
3.3.5 Caractérisation de l’interactiCaractérisation de l’interaction Kuon Ku–autres KBMautres KBM
3.4 Analyse structurale des complexes KuAnalyse structurale des complexes Ku–KBMKBM
3.4.1 Essais de cristallisation des complexes entiersEssais de cristallisation des complexes entiers
3.4.2 Etude cristallographique du complexe KuEtude cristallographique du complexe Ku hDNAhDNA–pAPLFpAPLF
3.4.3 Etude cristallographique du compleEtude cristallographique du complexe Kuxe Ku-hDNAhDNA–pXLFpXLF
4 Conclusions et perspectives
4.1 Purification des facteurs protéiques de la voie cPurification des facteurs protéiques de la voie c–NHEJ en cellules d’insecteNHEJ en cellules d’insecte
4.2 Etudes des interactions impliquant desEtudes des interactions impliquant des facteurs du NHEJfacteurs du NHEJ
4.3 Caractérisation structurale des complexes KuCaractérisation structurale des complexes Ku–hDNAhDNA–KBMKBM
4.4 Conclusion généraleConclusion générale

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