Soutenance mémoire
La tuberculose (TB) est une maladie infectieuse transmissible causée par des mycobactéries du complexe Mycobacterium tuberculosis. Elle constitue l’une des maladies infectieuses les plus meurtrières causant environ 1,4 millions de décès chaque année. En 2011, 8,7 millions de nouveaux cas ont été observés (WHO 2012). Les habitants des pays en voie de développement sont les plus touchés. Les personnes présentant une co-infection avec le VIH ou celles qui ont leur système immunitaire affaibli présentent un risque élevé de développer la tuberculose active. La tuberculose est une cause majeure de décès chez les personnes vivant avec le VIH.
La tuberculose se manifeste sous différentes formes cliniques. La forme pulmonaire, qui est la forme contagieuse, est la plus fréquente. Suite à l’exposition à un cas de tuberculose, les sujets exposés peuvent être infectés ou non en fonction de la durée, de l’intensité de l’exposition, de la charge bacillaire des expectorations de la personne malade et de la potentialité de l’immunité innée à éliminer les bacilles. Seuls 5 à 10% des individus infectés développeront la maladie au cours de leur vie, généralement après une période de latence qui peut varier de quelques semaines à plusieurs décennies. L’activation de la maladie peut-être attribuée à des facteurs de l’hôte ou des facteurs environnementaux tels que la pauvreté, la malnutrition, le stress …. Des facteurs bactériens, comme la variabilité génétique des souches de M. tuberculosis pourraient aussi être impliqués. Les connaissances sur la génétique des mycobactéries ont beaucoup progressé grâce au décryptage de la séquence du génome de la souche de référence M. tuberculosis H37Rv. De ce fait, et contrairement à ce que l’on pensait avant les années 1980, M. tuberculosis se trouve parmi les bactéries les mieux caractérisées sur le plan génétique avec une grande diversité. En effet, les souches constituant le complexe M. tuberculosis peuvent être identifiées et classifiées en famille de souches et/ou en lignées évolutives sur la base des différences génétiques et génomiques comme les polymorphismes de séquence ou les polymorphismes de marqueurs génétiques.
LA TUBERCULOSE
HISTORIQUE
La tuberculose a été décrite depuis le temps d’Hippocrate, environ 460 avant J.C., sous le terme de « phtisie », un terme grec signifiant le dépérissement. Hippocrate en dresse les symptômes, tels que l’amaigrissement progressif, la langueur, la toux et la présence de sang dans les crachats. Il décrit aussi les autres formes de tuberculose, comme la forme osseuse et la forme ganglionnaire. La transmissibilité de la tuberculose a été démontrée en 1866 par Villemin qui, par méthode expérimentale, a prouvé l’inoculabilité de produits tuberculeux à l’animal et donc la contagion de la tuberculose. En 1882, Robert Koch, un microbiologiste allemand a découvert la bactérie responsable de la tuberculose, le bacille tuberculeux ou bacille de Koch (BK). En 1890, le test à la tuberculine permettant de diagnostiquer la maladie a été mis au point par Koch. En 1921, Albert Calmette et Camille Guérin ont mis au point le vaccin protégeant contre ce germe, le BCG (bacille Calmette-Guérin). L’année 1944 marque le début de la chimiothérapie de la tuberculose grâce à la découverte de la streptomycine par un microbiologiste américain, Selman Abraham Waksman. Mais le traitement connaît des progrès révolutionnaires avec l’apparition de l’acide paraminosalicylique en 1948, l’isoniazide en 1952, le pyrazinamide en 1954, l’éthambutol en 1962 et la rifampicine en 1968. Enfin, le séquençage complet du génome de Mycobacterium tuberculosis fut réalisé en 1998.
PHYSIOPATHOLOGIE DE LA TUBERCULOSE
Transmission
La tuberculose se transmet généralement par voie aérienne, par l’inhalation de gouttelettes émises par un individu atteint d’une tuberculose active lorsqu’il tousse, parle ou éternue. Ces gouttelettes en suspension dans l’air sont chargées de quelques bactéries.
Infection tuberculeuse
Infection tuberculeuse latente
L’infection tuberculose latente correspond au premier contact de l’organisme avec M. tuberculosis. Après cette primo-infection, le bacille peut rester longtemps dans l’organisme à l’état latent et attendre un affaiblissement des défenses immunitaires de l’hôte pour se multiplier. Ainsi, un foyer infectieux se développe au niveau du poumon provoquant une lésion ou « chancre d’inoculation » qui est caractéristique de l’infection latente. L’organisme de la personne infectée réagit par le développement d’une réponse immunitaire cellulaire et la formation d’un granulome (Kaufmann 2002; Peyron, Vaubourgeix et al. 2008). Dans 90% des cas, la maladie ne se développe pas. Le granulome se calcifie et la personne infectée ne présente aucun symptôme et n’est pas contagieuse. Ceci est le résultat d’un équilibre entre le système immunitaire et les bactéries.
Tuberculose active
La tuberculose active ne se développe que chez environ 5 à 10% des personnes infectées par M. tuberculosis (Kaufmann 2002), soit immédiatement après la primo infection, soit après plusieurs années suite à la réactivation de l’ « infection tuberculeuse latente » quand le système immunitaire de la personne infectée est défaillant. Dans ce cas, la lésion précédemment formée se nécrose et les bacilles tuberculeux quiescents sont libérés (Smith 2003), pouvant, plus rarement, créer de nouveaux foyers infectieux extrapulmonaires (osseuse, méningée, digestive..) via les systèmes lymphatique et sanguin (15% des cas). La tuberculose pulmonaire est la forme la plus contagieuse et la plus commune de la tuberculose (85% des cas). La forme extrapulmonaire est plus fréquemment observée chez les patients infectés par le VIH (VIH séro-positifs)(Golden and Vikram 2005). Les nourrissons et les jeunes enfants présentent un risque plus élevé de développer des formes graves souvent mortelles telles que la méningite tuberculeuse.
REACTION IMMUNITAIRE DE L’HOTE FACE A L’INFECTION PAR M. tuberculosis
Réponse immunitaire innée
Dans l’alvéole pulmonaire, M. tuberculosis est reconnu et phagocyté par les cellules phagocytaires telles que les macrophages alvéolaires et les cellules dendritiques. La reconnaissance a lieu grâce à différents récepteurs tels que les PRR ou « Pattern recognition receptors » reconnaissant des motifs antigéniques spécifiques de M. tuberculosis. L’activation de ces cellules provoque la phagocytose de la bactérie et induit une réponse inflammatoire localisée, caractérisée par la production de cytokines inflammatoires comme, le TNFα (« Tumor necrosis factor alpha), l’IL-6, l’IL 1b, recrutant par vagues successives les cellules du systèmes immunitaires telles que les neutrophiles, les cellules NK (« Natural killer »), et les cellules T CD4+ et CD8+ vers le site infectieux. Chaque cellule, à son tour sécrète des cytokines différentes qui amplifient le recrutement cellulaire vers le foyer infectieux et permettent la restructuration de celui-ci.
Réponse immunitaire adaptative cellulaire (RIAC)
Dans la majorité des cas, la réponse innée à elle seule ne suffit pas à contrôler l’infection. Une immunité cellulaire T spécifique se développe suite à la réaction inflammatoire locale. Les lymphocytes T CD4+, T CD8+ et T γδ jouent un rôle important dans la protection contre M. tuberculosis. Les cellules dendritiques infectées vont activer les lymphocytes T CD4+ et T CD8+ en leur présentant les antigènes mycobactériens par l’intermédiaire des molécules du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) de classe II et I, respectivement. Les lymphocytes T ainsi activés vont alors migrer vers le foyer infectieux. Il arrive que la réponse cellulaire ne parvienne pas à éliminer les mycobacteries. Les cellules T activées continuent à s’accumuler et à secréter de façon chronique des cytokines conduisant à la formation de granulome, une structure caractéristique et efficace stoppant la prolifération des mycobactéries et empêchant leur dissémination. Le granulome est caractérisé par la présence des cellules géantes multinucléées résultant de la différenciation et fusion des macrophages activés, des macrophages infectés contenant le M.tuberculosis et des lymphocytes.
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Table des matières
I. INTRODUCTION
II.GENERALITES
A. LA TUBERCULOSE
A.1. Historique
A.2. Physiopathologie de la tuberculose
A.2.1. Transmission
A.2.2. Infection tuberculeuse
A.2.2.a. Infection tuberculeuse latente
A.2.2.b. Tuberculose active
A.3. Réaction immunitaire de l’hôte face à l’infection par M. tuberculosis
A.3.1. Réponse immunitaire innée
A.3.2. Réponse immunitaire adaptative cellulaire (RIAC)
A.3.2..a. Réponse Th1
A.3.2..b. Réponse Th2
A.3.2..c. Réponse Th17
A.4. Diagnostic
A.4.1. Diagnostic clinique
A.4.2. Examens complémentaires
A.5. Traitement
A.6. Epidémiologie de la tuberculose à Madagascar
B. LES MYCOBACTERIES
B.1. Taxonomie
B.2. L’espèce Mycobacterium tuberculosis
B.2.1. Caractéristiques bactériologiques
B.2.2. Caractères moléculaires du bacille
B.2.2.a. Le génome de M. tuberculosis
B.2.2.b. Les marqueurs génétiques ou moléculaires
i. Polymorphic GC-rich repeat sequence (PGRS)
ii. La séquence d’insertion IS6110
iii. La région DR (« Direct Repeat »)
iv. MIRU-VNTR («Mycobacterial Interspersed Repetitive Units-Variable Number of Tandem Repeats typing»)
v. SNPs (« Single Nucleotide Polymorphism »)
B.2.2.c. Méthodes de génotypage de M. tuberculosis
i. IS6110-RFLP
ii. Spoligotyping
iii. Analyse des MIRU-VNTR
iv. Typage des SNPs
B.2.3. Classification des souches M. tuberculosis
C. VIRULENCE, PATHOGENICITE ET DIVERSITE GENETIQUE
C.1. Diversité génétique et forme clinique
C.2. Diversité génétique et histopathologie clinique
C.3. Etude de la virulence sur des modèles expérimentaux
C.3.1. Etude de la virulence des souches sur les modèles cellulaires
C.3.2. Etude de la virulence sur les modèles animaux
D. POLYMORPHISME GENETIQUE DES SOUCHES M. TUBERCULOSIS A MADAGASCAR
III. MATERIELS ET METHODES
A. MATERIELS
A.1. Matériels biologiques
A.2. Matériels utilisés
A.2.1. Pour l’extraction et la quantification de l’ADN
A.2.2. Pour le génotypage
A.3. Réactifs et tampons
A.3.1. Réactifs Pour l’extraction d’ADN
A.3.2. Réactifs pour la quantification d’ADN
A.3.3. Pour le génotypage
B. METHODES
B.1. Extraction de l’ADN des souches M. tuberculosis
B.1.1. Principe
B.1.2. Méthode
B.2. Quantification de l’ADN
B.2.1. Electrophorèse en gel d’agarose
B.2.1.a. Principe
B.2.1.b. Préparation du minigel d’agarose 0,8%
B.2.1.c. Dépôt des ADN à doser
B.2.1.d. Migration
B.2.1.e. Quantification de l’ADN extrait
B.2.2. Dosage avec le Spectrophotomètre Nanodrop
B.3. Génotypage
B.3.1. Principe
B.3.2. Précautions de travail
B.3.3. Les sondes et amorces utilisées
B.3.4. Préparation du « mix » ou mélange réactionnel
B.3.5. Ajout de l’ADN
B.3.6. Amplification
B.3.7. Lecture des résultats
B.4. Analyse des résultats
B.4.1. Classification des souches
B.4.2. Analyses statistiques
B.4.2.a. Association entre le génotype des souches bactériennes et la réponse en IFN-γ de l’hôte
B.4.2.b. Association entre le génotype des souches bactériennes et la réponse immunitaire du type Th1, Th2, Th17 de l’hôte
IV. RESULTATS
A. CLASSIFICATION
A.1. Description des spoligotypes des souches analysées
A.2. Génotypage des SNPs
A.2.1. Description du résultat
A.2.2. Corrélation entre les génotypes SNPs et les spoligotypes
B. ETUDE DE LA REPONSE IMMUNE EN FONCTION DU GENOTYPE DES SOUCHES
B.1. Etude de la réponse en IFN-γ selon les lignées des souches
B.2. Etude de la réponse immune de types Th1, Th2 et Th17 selon les lignées de souches
B.2.1. Réponse du type Th1
B.2.2. Réponse Th2
B.2.3. Réponse Th17
V. DISCUSSION
VI. CONCLUSION
