Soutenance mémoire
La transcription des gènes chez les eucaryotes
L’expression des gènes est un processus fondamental du vivant. En effet, l’état physiologique d’une cellule ou d’un organisme dépend des gènes qui sont exprimés à un instant t. Afin de répondre aux contraintes de son environnement ou aux signaux physiologiques, les cellules doivent pouvoir moduler l’expression de leurs gènes. De plus, l’expression des gènes est un processus central dans la différenciation et la spécialisation des cellules. C’est un processus très dynamique et très hautement régulé. La transcription est la première étape de l’expression des gènes. Il s’agit d’un mécanisme très complexe faisant intervenir, chez les eucaryotes, un très grand nombre de protéines et donc possédant différents niveaux de régulation. Au centre de la fonction transcriptionnelle on retrouve les ARN polymérases (Pol), enzymes utilisant l’ADN comme substrat pour synthétiser les ARNs. Chez les eucaryotes, il existe 5 ARN polymérases qui transcrivent chacune une classe de gènes différente. Les ARN polymérase I et III transcrivent les ARNs de transfert (ARNt) et ribosomaux (ARNr), nécessaires à la traduction des protéines ainsi que des ARNs impliqués dans l’épissage des ARNs messagers (Werner, Thuriaux, and Soutourina 2009). Deux autres ARN polymérases, les ARN polymérases IV et V, ont été mises en évidence chez les plantes mais ne sont pas retrouvées chez les autres eucaryotes. Elles sont dispensables et leur rôle semble être limité à la transcription des petits ARNs impliqués dans le phénomène de silencing des gènes (Haag and Pikaard 2011). Pour finir, l’ARN polymérase II (Pol II) assure la transcription des ARNs messagers (ARNm) nécessaires à la synthèse des protéines et un grand nombre d’ARNs non-codants (ARNnc) dont la plupart ont des rôles régulateurs. Dans cette étude, nous nous intéressons uniquement à la transcription des gènes de classe II réalisée par la Pol II.
L’ARN polymérase II
Au cœur du dogme central de la biologie moléculaire se trouvent la transmission et l’expression de l’information génétique. Celle-ci se fait par le biais de l’ARN. La synthèse des ARNs est accomplie lors de la transcription par les ARN polymérases. La découverte de cette activité enzymatique remonte à 1959 par la mise en évidence de la synthèse d’ARN utilisant une matrice d’ADN (Weiss and Gladstone 1959). Les études biochimiques ultérieures concernant les enzymes responsables de cette activité chez les mammifères ont permis d’isoler trois ARN polymérases (Roeder and Rutter 1969). Leur nom a été donné en fonction de l’ordre de sortie de la colonne de chromatographie. Elles ont alors été appelées ARN polymérase (Pol) A, B et C (aujourd’hui I, II et III, respectivement). Il aura néanmoins fallu attendre les études menées par la suite par les laboratoires de P. Chambon et R. Roeder pour connaître la spécificité enzymatique de ces trois enzymes. Ces études basées sur la sensibilité inhibitrice sur ces enzymes d’un antibiotique, l’α-amanitine, ont permis de montrer leur spécificité (Gniazdowski et al. 1970; Kedinger et al. 1970; Weinmann and Roeder 1974). Ainsi, il a été montré que l’ARN polymérase II, sensible aux faibles concentrations d’ α-amanitine, est l’enzyme synthétisant les ARNm. Pol I et Pol III ont été associées à la transcription des ARNs ribosomiques et de transferts. La Pol II est un complexe enzymatique de 0.5 MDa comprenant 12 sous-unités chez la levure et l’Homme. Les 12 sous-unités sont nommées Rpb1-12, selon l’ordre décroissant de leur masse moléculaire (Young 1991).
Composition de l’ARN polymérase II et conservation chez les eucaryotes
Conservation des ARN polymérases
Dans le monde du vivant, la transmission de l’information génétique passe par l’ARN. Il apparait dès lors que la conservation du mécanisme de la transcription au cours de l’évolution implique une conservation des enzymes accomplissant cette fonction. Ainsi, dans les trois domaines du vivant que sont les bactéries, les archées et les eucaryotes, il existe des ARN polymérases. Contrairement aux eucaryotes, les archées et les bactéries ne possèdent qu’une seule ARN polymérase pour la transcription de l’ensemble de leurs gènes. Il semble que l’ancêtre commun aux bactéries, archées et eucaryotes possédait une ARN polymérase très proche de celle des bactéries actuelles à savoir une enzyme composée de 5 sous-unités αI, αII, β, β’ et ω. Au cours de l’évolution des sous unités supplémentaires sont apparues ainsi que des protéines partenaires appelées facteurs de transcription, apportant un niveau de complexité supplémentaire et permettant une régulation plus complexe (Werner and Grohmann 2011). Cependant, ces enzymes présentent toutes un cœur structural commun. Ce cœur structural est à la base de l’activité enzymatique et est responsable des mécanismes moléculaires très proches au sein de toutes ces ARN polymérases.
Les ARN polymérases d’archées et les trois ARN polymérases eucaryotes contiennent des homologues des sous-unités de la polymérase bactérienne, composant leur cœur catalytique. Ainsi, les sous-unités Rpb1, Rpb2, Rpb3 et Rpb6 et leurs homologues chez les archées (Rpo1, 2, 3 et 6) comportent des similarités de séquences avec les sous-unités β’, β, α, et ω (Tan et al. 2000; Minakhin et al. 2001). La sous-unité Rpb11 possède également un domaine de similitude avec α (Ulmasov, Larkin, and Guilfoyle 1996). En plus de cette homologie de séquence, il apparait que les sous-unités Rpb1 et Rpb2 ont des fonctions similaires à celles de β’et β, toutes deux responsables de la plus grande part de l’activité catalytique de l’enzyme. Rpb1 tout comme β’ a la capacité de se lier à l’ADN alors que Rpb2 lie le substrat nucléotidique de la même manière que β (Hampsey 1998). Enfin, Rpb3 présente aussi des similitudes fonctionnelles avec la sous-unité α bactérienne. En effet des mutants de Rpb3 ou α aboutissent à des défauts d’assemblage des deux ARN polymérases (Hampsey 1998).
Ainsi, les deux plus grandes sous-unités des chacune de ces ARN polymérases (β, β’, Rpo1 et Rpo2, et Rpb1 et Rpb2) contiennent toutes un motif structural appelé tonneau-β-double-psi formant le site actif de ces enzymes (Werner and Grohmann 2011). Toutes ces ARN polymérases contiennent une plateforme d’assemblage (Werner and Weinzierl, 2002). Chez les archées et les eucaryotes, cette plateforme est composée d’un complexe stable formé des deux hétérodimères Rpb10-Rpb12 (Rpo10-Rpo12 chez les archées) et Rpb3-Rpb11 (Rpo3-Rpo11 chez les archées). Le sous-complexe Rpb3-Rpb11 semble d’ailleurs être homologue à celui formé par les sous-unités α chez les bactéries. Les sous-unités supplémentaires présentes chez les eucaryotes et archées ont permis l’apparition de nouveaux éléments structuraux. On retrouve, par exemple, un complexe Rpb4-7 (Rpo4-7) appelé domaine tige, ou stalk, situé en périphérie de l’enzyme et capable de se dissocier du complexe principal (Grohmann and Werner 2011). Les deux sous-unités Rpb5 et Rpb8 (Rpo5 et Rpo8) sont quant à elles impliquées dans la séparation des brins de l’ADN transcrit et dans l’initiation précoce (Grünberg et al. 2010; Kang et al. 2006).
Outre ces similitudes, il existe des sous-unités spécifiques à chaque règne du vivant. En effet, la sous-unité Rpo13 des archées n’est retrouvée que chez ces dernières et n’a pas d’équivalent chez les eucaryotes. Sa fonction reste à l’heure actuelle obscure mais elle pourrait avoir un rôle dans l’initiation de la transcription similaire à celui de certains facteurs généraux de la transcription eucaryotes (Korkhin et al. 2009). La sous-unité Rpb9 et ses paralogues des Pol I et Pol III (Rpc11 et Rpc12, respectivement) sont exclusives aux eucaryotes. Elle est impliquée dans le contact entre la polymérase et le GTF TFIIF, nécessaire à la détermination du site d’initiation de la transcription (Ziegler et al. 2003).
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Table des matières
Introduction
Chapitre I : La transcription des gènes chez les eucaryotes
I. L’ARN polymérase II
1) Composition de l’ARN polymérase II et conservation chez les eucaryotes
a) Conservation des ARN polymérases
b) Composition des ARN polymérases eucaryotes
2) Structure de l’ARN polymérase II et fonction de ses sous-unités
a) Structure tridimensionnelle de la Pol II
b) Fonction des différentes sous-unités de la Pol II
3) Le Domaine Carboxy-Terminal de l’ARN polymérase II
II. La transcription par l’ARN polymérase II
1) Structure des gènes de classe II
a) La boîte TATA
b) L’élément de reconnaissance de TFIIB (BRE)
c) La séquence initiatrice (Inr)
d) L’élément promoteur aval (DPE)
2) Les facteurs généraux de la transcription
a) TFIID
b) TFIIA
c) TFIIB
d) TFIIF
e) TFIIE
f) TFIIH
3) L’initiation de la transcription
a) La mise en place du complexe de pré-initiation
b) La transition entre l’initiation et l’élongation
4) L’élongation de la transcription par la Pol II
a) La pause à proximité du promoteur
b) L’élongation productive
5) La terminaison de la transcription et sa ré-initiation
a) La terminaison
b) La ré-initiation de la transcription
6) La dynamique de la transcription
III. La transcription pervasive
IV. La transcription dans le contexte chromatinien
1) Structure de la chromatine
2) La modification des histones
3) Les variants d’histones
4) Le remodelage de la chromatine
V. La régulation de la transcription par l’ARN polymérase II
1) Les éléments de régulation des promoteurs
2) Les facteurs de transcription
a) Les activateurs de la transcription
b) Les répresseurs de la transcription
3) Les co-activateurs
a) Les complexes agissant sur la mise en place du PIC
b) Les remodeleurs de la chromatine
Chapitre II : Le Médiateur de la transcription par l’ARN polymérase II
I. Le Médiateur de Saccharomyces cerevisiae
1) Découverte du Médiateur
2) Composition et organisation du Médiateur
3) Structure du Médiateur
II. Le Médiateur chez les mammifères
1) Découverte du Médiateur des mammifères
2) Composition du Médiateur des mammifères
3) Conservation du Médiateur au cours de l’évolution
III. Rôle du Médiateur dans la régulation de l’expression des gènes
1) Interaction entre le Médiateur et les activateurs spécifiques
2) Interaction entre le Médiateur et la Pol II
3) Interactions entre le Médiateur et les facteurs généraux de la transcription
a) Médiateur et TFIID
b) Médiateur et TFIIA
c) Médiateur et TFIIB
d) Médiateur et TFIIF
e) Médiateur et TFIIE
f) Médiateur et TFIIH
4) Interaction du Médiateur avec les co-activateurs
5) Interaction du Médiateur avec d’autres protéines impliquées dans la transcription
a) Interaction entre le Médiateur et la cohésine
b) Interaction entre le Médiateur et TFIIS
6) Rôle du Médiateur dans l’assemblage du PIC in vivo
7) Le Médiateur en tant que facteur général de la transcription
IV. La régulation négative de la transcription par le Médiateur
V. Rôles du Médiateur au-delà de l’initiation de la transcription
1) Rôle du Médiateur dans les étapes de la transcription post-assemblage du PIC
2) Rôle du Médiateur dans la ré-initiation de la transcription
3) Rôle du Médiateur dans le maintien des télomères
4) Rôle du Médiateur dans la réparation de l’ADN
VI. Rôles du Médiateur dans des processus du développement
VII. Pathologies associées au Médiateur
1) Maladies du développement
2) Implication du Médiateur dans les cancers humains
Résultats et discussion
Partie I : Etude intégrative du rôle de la sous-unité Med10 dans l’initiation de la transcription
I. Contexte de travail
II. Article
Partie II : Etude du rôle de la sous-unité essentielle Med7
I. Contexte de travail
II. Résultats
1) Collection de mutants thermosensibles de Med7
2) Interactions entre Med7 et ses partenaires au sein du Médiateur
3) Analyse de l’intégrité du Médiateur dans les contextes mutants
4) Effet des mutations de Med7 sur l’occupation des composants du PIC
Conclusion
