La théorie du vieillissement par le stress oxydant mitochondrial

Les théories évolutives du vieillissement : pourquoi vieillit-on?

  Le vieillissement est une déperdition graduelle de la capacité des organes à accomplir leurs fonctions physiologiques, et par conséquent, de la capacité de l’organisme entier à faire face à un stress physiologique. On distingue la sénescence comme étant la composante fondamentale du vieillissement par opposition aux pathologies et aux traumas avec lesquels elle peut toutefois entrer en interaction. La sénescence présente un phénotype universel chez les animaux supérieurs (métazoaires) i.e. elle est endogène, progressive, irréversible et délétère, et son occurrence est ubiquitaire dans les tissus somatiques. En absence de causes de mortalité brutale ou de pathologie, la sénescence devrait impartir une limite ultime à la longévité par le fait d’exacerber la fragilité physiologique. Il est raisonnable de suggéré que les individus qui établissement les records de longévité sont ceux qui ont réussi à éviter au mieux toutes pathologies. Leur durée de vie nous permet alors d’estimer avec une certaine précision la vitesse de la sénessence au sein de l’espèce.inta Le fait que la durée de vie diffère grandement entre les espèces, passant par exemple de moins de 30 jours chez les mouches à fruit (Drosophila melanogaster) à plus de 500 ans chez la palourde marine Arctica islandica (Butler et al. 2013; Ridgway & Richardson 2011), soulève tout d’abord une interrogation quant aux pressions évolutives qui agissent pour moduler la vitesse de sénescence. Trois théories évolutives du vieillissement sont actuellement considérées. La théorie de « l’accumulation de mutations au potentiel délétère tardif » propose que l’assouplissement de la pression de la sélection naturelle qui accompagne l’avancée en âge résulte dans l’accumulation des mutations néfastes sur des gènes qui jouent un rôle à un âge avancé. La théorie de la « pléiotropie antagoniste » suggère que des allèles qui causent le vieillissement sont sélectionnés dans la mesure où ils confèrent un avantage compétitif en bas âge qui surpasse les effets négatifs en âge avancé pour une niche écologique donnée. Par exemple, une espèce qui vit plus longtemps pourrait ajuster le fonctionnement des mitochondries afin de diminuer le taux de production des radicaux libres au dépend de la capacité de production d’ATP par unité de masse. Enfin, la théorie du « soma jettable » propose qu’il puisse être avantageux de prioriser l’utilisation de l’énergie disponible pour les fonctions physiologiques assurants le succès reproducteur (à court terme) au détriment de celles assurant la pérénité des tissus somatiques afin d’améliorer sa compétitivité relative au sein de la niche écologique. Par exemple, les petites chauves-souries brunes (Myotis lucifugus, longévité max. = 34), qui vivent plus longtemps que les souris communes (Mus musculus, longévité max. = 4 ans), devraient allouer relativement plus d’énergie à l’éliminations des aggrégats de protéines oxydées au seins des cellules et relativement moins à la croissance de leurs fœtus.Alors que la théorie de l’accumulation de mutations est dite non adaptative, celles de la pléiotropie et du soma jettable sont dites adaptatives. Bien que les deux types de théories ne soient pas mutuellement exclusifs, la théorie de l’accumulation de mutations demande à ce que la longévité existe déjà. Les théories adaptatives, elles, suggèrent un mécanisme à l’origine des différences de longévité qui serait en phase avec la nature de la niche écologique. Une récente tentative de modélisation suggère une plus forte importance relative des phénomènes adaptatifs dans la détermination de la durée de vie des espèces (Dańko et al. 2012). Une distinction très importante est que les théories adaptative prédisent des mécanismes beaucoup plus circonscrits auniveau physiologique et permettent de formuler des hypothèses précises pouvant être testées. Des compromis entre avantage à court terme et désavantage à long terme ainsi qu’entre les performances en jeune âge et la pérénité de l’organisme devraient se refléter dans des fonctions physiologiques précises susceptibles d’affecter les performances et la préservations de l’organisme. La recherche de ce type de modulateur de la longévité animale est à la base des théories physiologiques du vieillissement. L’objectif principal de cette thèse de doctorat est de tester les prédictions de l’une de ces théories, la « théorie du vieillissement par le stress oxydant mitochondrial ».

La théorie du vieillissement par le stress oxydant mitochondrial

  Bien qu’un grand nombre de théories sur les mécanismes physiologiques du vieillissement soit proposé, il est étonnant de constater qu’aucune de celles-ci ne soit proche de faire l’unanimité. La théorie du vieillissement par le stress oxydant mitochondrial est celle qui trouve le plus d’appuie dans les études comparatives et expérimental. Elle souffre néanmoins de contre exemples importants, si bien que plusieurs chercheurs n’y réfèrent qu’en tant qu’hypothèse (Buffenstein et al. 2008;Sanz et al. 2006). La théorie du vieillissement par le stress oxydant trouve son origine chez Harman (1956) qui y référait alors en tant que « théorie radicalaire du vieillissement ». La succession de noms utilisés par la suite évoque les nombreux développements qui ont caractérisé cet ensemble d’explications. Dans la forme originale de la théorie, Harman propose simplement que la présence du dioxygène en milieu biologique conduise à la génération non catalysée (spontanée) de radicaux libres délétères qui attaquent et dégradent les macromolécules structurales et fonctionnelles telles que les protéines, les lipides et l’ADN. Bien que cette approche puisse déjà bien rendre compte du caractère endogène, progressif et délétère de la sénescence, les détails des processus par lesquels les radicaux libres provoquent l’oxydation des molécules du vivant ainsi que les défenses de l’organisme ont depuis largement complexifié notre vision. Ainsi, un grand nombre d’enzymes et de molécules antioxydantes a été mis en évidence, suggérant que, dans une certaine mesure, les effets néfastes des radicaux libres peuvent et doivent être tempérés. Des systèmes de réparation des macromolécules oxydés (ADN, protéines) ont également été mis en évidence, révélant une deuxième ligne d’intervention. De plus, on a découvert que les radicaux libres peuvent donner naissance à un grand nombre d’espèces moléculaires réactives non radicalaires. Ces espèces secondaires, peuvent elles aussi endommager les macromolécules biologiques ou encore reformer des radicaux libres ultérieurement plus loin dans l’environnement cellulaire (Halliwell & Gutteridge 1999). Pour ces raisons, le terme espèces réactives de l’oxygène (ERO) a ainsi été introduit pour inclure à la fois les radicaux libres au sens strict et leurs dérivés réactifs. Pour tenircompte du rôle de chacun de ces intervenants dans la balance entre les mécanismes pro et anti-oxydants, nous parlons aujourd’hui de stress oxydant plutôt que simplement de production de radicaux libres. La théorie (hypothèse) a donc changé de nom pour devenir la « théorie du vieillissement par le stress oxydant ». Selon cette vision, les espèces animales ayant la plus grande longévité seraient caractérisées par un niveau de stress oxydant de base moins élevé. La contribution majeure des mitochondries comme source principale d’ERO, et plus tard en tant que cible principale de l’attaque par les ERO a finalement conduit à l’expression plus précise de « théorie du vieillissement par le stress oxydant mitochondrial ». Selon cette théorie, l’accumulation des dommages au niveau moléculaire ferait péricliter le fonctionnement cellulaire et causerait la sénescence des tissus. Cette thérorie est beaucoup plus complexe étant donné la diversité des intervenants susceptibles de faire varier le taux d’accumulation de ces dommages. Les trois premiers chapitres de cette thèse représentent un test de cette hypothèse par une approche comparative interspécifique où la prédiction est une corrélation inverse entre la longévité et la production des ERO d’origine mitochondriale.

Mécanismes pro- vs antioxydants

   La mitochondrie est la source de plus de 95% des ERO produites au niveau cellulaire en condition physiologique. L’ensemble des ERO d’origine mitochondriale est dérivé de l’anion superoxyde (O2•ˉ), lequel est produit par le système de transport des électrons (STE) de la membrane interne des mitochondries. La vaste majorité des anions superoxydes sont dismutés en peroxyde d’hydrogène (H2O2) par l’enzyme superoxyde dismutase (SOD) (Fig. 1). Dans la majorité des cas, le H2O2 est neutralisé en eau par les défenses antioxidantes. Comme le montre la figure 0.1, un certain pourcentage suit toutefois la séquence de Haber-Weiss pour former le radical hydroxyle (OH•). Cette conversion est beaucoup plus rapide en présence d’ions métalliques qui permettent la réaction de Fenton. Au sens strict, les radicaux libres sont les espèces moléculaires qui possèdent un électron non apparié sur le dernier orbital de la molécule, lequel confère un caractère hautement réactif. Sur la figure 0.1, ces espèces moléculaires sont représentées avec un point noir qui indique la présence de l’électron non apparié.

Mesurer la production d’ERO par les mitochondries isolées.

  Tester adéquatement la relation ERO-longévité ne demande pas seulement d’éviter certaines conditions de métabolisme mitochondrial non-physiologiques, mais également de tenir compte des particularités du STE du modèle biogérontologiques utilisé. La figure 0.8 présente un schéma de la membrane interne de la mitochondrie comprenant les composantes du STE retrouvées chez les modèles classiques tel que le rat et l’AOX, qui est propre au bivalves. Les complexes I à IV du système de transport des électrons ainsi que le complexe V forment ensemble le cœur du STE; ils sont respectivement responsables de la production d’un gradient de protons transmembranaire et de la formation d’ATP. L’anion superoxyde (O2˙ˉ) est majoritairement produit au niveau des complexes I et III du système de transport des électrons (STE) comme réaction secondaire du processus de la phosphorylation oxydative. Il découle de la réduction électronique incomplète de l’oxygène i.e. les sites réducteurs de l’oxygène des complexes I et III ne donnent qu’un seul électron à la fois contrairement au site réducteur du complexe IV qui les donne deux par deux pour réduire l’oxygène moléculaire en eau à la fin du cheminement des électrons. La nature du site réducteur de l’oxygène au niveau du complexe I a été l’objet d’un grand nombre d’investigations. En condition physiologique, il est maintenant suggéré que la réduction s’effectue au centre fer soufre (FeS) N2 situé dans le bras intra membranaire du complexe I (Kushnareva et al. 2002; Lenaz & Genova 2010; voir aussi figure 0.8). L’anion superoxyde est alors libéré du côté matriciel (St-Pierre, Buckingham et al. 2002; Muller, Liu et al. 2004). Au niveau du complexe III, deux sites (O et i) ont été mis en évidence qui impliqueraient chacun les anions semi-quinone comme réducteur direct de l’oxygène (revu dans Lenaz & Genova, 2010; voir aussi figure 0.8). Le centre O libère l’anion superoxyde du côté inter membranaire (St-Pierre, Buckingham et al. 2002; Miwa, StPierre et al. 2003), tandis que le centre i le libère du côté matriciel. La proportion de chacun ayant été revue récemment (Treberg et al. 2010). La production d’ERO par le complexe II a aussi été revue récemment, et il semblerait que ce complexe puisse aussi contribuer de façon non négligeable à la production totale d’anion superoxyde par le STE (Quinlan et al. 2012).La production de l’anion superoxyde par des mitochondries isolées et intègres ne peut pas être mesurée directement puisqu’il s’agit d’un radical libre instable rapidement converti en peroxyde d’hydrogène (H2O2) par la superoxyde dismutase matricielle (MnSOD). Traditionnellement, la mesure se fait donc de façon indirecte par la quantification du H2O2. Le principe repose sur le fait que les anions superoxydes libérés du côté matriciel sont rapidement convertis en H2O2 par la MnSOD naturellement présente alors que ceux libérés du côté intermembranaire le sont par la Cu/ZnSOD ajoutée en excès au milieu de dosage. Le H2O2 étant beaucoup plus stable et pouvant traverser la membrane interne de la mitochondrie, il est possible de le doser à l’aide d’une sonde fluorophore présente en excès dans le milieu de dosage. Le principe repose sur l’augmentation de la fluorescence suivant l’oxydation de la sonde par le H2O2, une réaction catalysée par une peroxydase ajouté. Dans les années ’80 et 90’, l’acide homovanillique était la sonde traditionnellement utilisée. Il est aujourd’hui remplacé par l’Amplex® red (ou l’Amplex ultra Red) qui présente l’avantage d’une plus grande sensibilité (Votyakova & Reynolds 2004; Mansouri et al. 2006), permettant la mesure des très faibles taux de production du H2O2 caractéristiques de la respiration mitochondriale sans inhibiteurs particulièrement chez les espèces à très faible taux métabolique telles que les invertébrés marins.

Mécanismes modulateurs de la production des ERO : vertébrés vs bivalves

   Les mécanismes proposés pour expliquer les différences de taux de production d’ERO entre les espèces sont limités. La diminution de la proportion entre les complexes générateurs de l’anion superoxyde par rapport au cytochrome C oxidase (complexe IV) pourrait amoindrir le niveau de réduction électronique des sites de réduction de l’oxygène. Ainsi, Sohal (1993) avait proposé que les espèces animales de plus grande durée de vie aient une proportion plus élevée de complexes IV. Une diminution de la proportion du complexe I devrait conduire au même résultat en limitant l’entrée des électrons pour une capacité de circulation inchangée. Cette adaptation a souvent été rapportée pour expliquer la moindre production d’ERO par les espèces de plus grande longévité (St-Pierre et al. 2002; Pamplona et al. 2005; Lambert et al. 2010). Il est intéressant que la restriction calorique soit connue pour diminuer la proportion des complexes I puisque cette intervention diminue également la production d’ERO par les mitochondries isolées et prolonge la durée de vie (Naudi et al. 2007; Caro et al. 2008). Les connaissances fondamentales sur la production d’ERO ont été acquises par l’observation des mitochondries isolées de mammifères. La présence d’oxydase alternative (AOX) chez certaines espèces d’invertébrés est susceptible d’affecter cette dynamique. Les AOX sont des composantes du système de transport des électrons, codées par l’ADNn, présentes chez les plantes, quelques algues, les protozoaires, plusieurs champignons, et plusieurs animaux invertébrés (Tschischka et al. 2000; Uribe & Khachatourians 2008; Lenaz & Genova 2010). Elles prennent leurs électrons à partir du pool d’ubiquinone et réduisent l’oxygène moléculaire en eau (cheminement jaune sur figure 0.8) sans activité de pompage de protons. Puisque les électrons sont acheminés à l’oxygène avant le complexe III et IV, le cheminement par l’AOX ne pompe de protons qu’au niveau du complexe I et aucun proton n’est pompé lorsque les électrons sont en provenance du complexe II. Chez plusieurs invertébrés marins, dont certains bivalves, il a été démontré que les AOX ont une affinité moindre pour l’oxygène par rapport à celle du complexe IV (Tschischka et al. 2000). La voie des AOX serait ainsi recrutée de façon proportionnelle à la PO2 intracellulaire. La sensibilité des AOX à la disponibilité de l’oxygène moléculaire dissout serait un mécanisme de régulation passif permettant à plusieurs invertébrés marins de se comporter en oxyconformateurs i.e. leur métabolisme augmente avec l’augmentation de la teneur en oxygène dissout du milieu. Il a été proposé que par cemécanisme, les AOX protégeraient la cellule contre la production excessive des ERO qui accompagne l’hyperoxie lorsque l’eau est froide et saturée en oxygène (Abele et al. 2007). Les auteurs proposent également que les AOX puissent protéger contre la production excessive d’ERO en condition défavorable de ratio élevé d’ATP/ADP qui accompagne la dépression métabolique saisonnière ou comportementale. La présence des AOX est traditionnellement mise en évidence lorsque la consommation d’oxygène persiste en présence d’inhibiteurs du complexe IV tels que l’azoture de sodium (NaN3) ou le cyanure de potassium (KCN). L’AOX est aussi spécifiquement inhibée par l’acide salicylhydroxamique (SHAM). L’utilisation du SHAM conduit par contre à une inhibition concomitante partielle (20%) du complexe IV, et inversement, le KCN inhibe aussi partiellement l’AOX (Tschischka et al. 2000). Étant donné les implications proposées de l’AOX dans le contrôle de la génération d’ERO, la régulation de cette enzyme pourrait être impliquée dans l’accroissement de la longévité chez les palourdes marines. Le recrutement de cette voie permettrait d’abaisser la production des ERO aux dépends d’une diminution du couplage entre la consommation d’oxygène et la production de l’ATP. Il est donc possible que des différences de taux de production de ROS entre espèces de bivalves de longévités différentes s’expliquent par une différente activité de l’AOX et non par les mécanismes observés chez les mammifères.

Table des matières

LISTE DES FIGURES
LISTE DES TABLEAUX
LISTE DES ABBRÉVIATIONS
RÉSUMÉ
INTRODUCTION GÉNÉRALE
Les théories évolutives du vieillissement : pourquoi vieillit-on?
La théorie du vieillissement par le stress oxydant mitochondrial
Mécanismes pro- vs antioxydants
Les études comparatives sur les quatre niveaux de modulation du stress oxydant
L’ADN mitochondrial comme cible des ERO
Les problématiques liées à l’approche comparative en physiologie du vieillissement
Les bivalves comme modèle biogérontologique
Mesurer la production d’ERO par les mitochondries isolées
Mécanismes modulateurs de la production des ERO : vertébrés vs bivalves
Mesurer l’indice de peroxydation membranaire
Remodelage lipidique membranaire induit par le froid
Objectifs généraux et spécifiques
CHAPITRE I LOW HYDROGEN PEROXIDE PRODUCTION IN MITOCHONDRIA OF THE LONG-LIVED ARCTICA ISLANDICA: UNDERLYING MECHANISMS FOR SLOW AGING
1.1 Résumé
1.2 Abstract
1.3 Introduction
1.4 Experimental procedures
1.4.1 Bivalve collection and care
1.4.2 Isolation of mitochondria
1.4.3 Mitochondrial hydrogen peroxide production
1.4.4 Oxygen consumption
1.4.5 Enzymatic activity
1.4.6 Statistical analysis
1.5 Results 
1.5.1 Size, age, and normalization
1.5.2 H2O2 production rate of isolated mitochondria
1.5.3 Oxygen consumption and enzymatic activity
1.5.4 Activity of the alternative oxidase
1.6 Discussion
1.6.1 Hydrogen peroxide production
1.6.2 Mechanism for reduced hydrogen peroxide production rate
1.6.3 Conclusion and perspectives
1.7 Acknowledgement
CHAPITRE II THE EXTREME LONGEVITY OF ARCTICA ISLANDICA IS ASSOCIATED WITH INCREASED PEROXIDATION RESISTANCE IN MITOCHONDRIAL MEMBRANES
2.1 Résumé 
2.2 Abstract
2.3 Introduction
2.4 Experimental procedures
2.5 Results 
2.5.1 Preliminary results and general lipid composition
2.5.2 Longevity and peroxidation sensitive fatty acids
2.5.3 Non-methylene interrupted fatty acids
2.5.4 Plasmalogens
2.6 Discussion
2.6.1 Pattern of lipid remodelling with increasing longevity in bivalves
2.6.2 Mitochondrial membrane vs. Other cell membranes
2.6.3 Bivalves vs. Mammals
2.6.4 Conclusion and perspectives
2.7 Acknowledgements
CHAPITRE III AGE, DIET AND SEASON DO NOT AFFECT LONGEVITY RELATED DIFFERENCES IN PEROXIDATION INDEX BETWEEN S. SOLIDISSIMA AND A. ISLANDICA
3.1 Résumé
3.2 Abstract
3.3 Introduction
3.4 Method
3.4.1 Animal care and schedule of dissection
3.4.2 Biological fractions isolation
3.4.3 Lipid analysis
3.4.4 Age determination
3.4.5 Statistics
3.5 Results
3.6 Discussion
3.7 Acknowledgements
CHAPITRE IV COLD-INDUCED MEMBRANE LIPID REMODELLING IS NOT EXPRESSED DURING QUIESCENCE IN THE BIVALVE MERCENARIA MERCENARIA 
4.1 Résumé
4.2 Abstract
4.3 Introduction
4.4 Material and methods
4.4.1 Animals
4.4.2 Mitochondrial isolation
4.4.3 Lipoxidation
4.4.4 Lipid analysis
4.4.5 Statistical analysis
4.5 Results 
4.6 Discussion
4.6.1 FA remodelling during quiescence in M. mercenaria
4.6.2 HVA or HUFA increase?
4.7 Acknowledgements
CONCLUSION GÉNÉRALE
La relation inverse ERO-longévité
La relation inverse IP-longévité
L’état actuel de la théorie du vieillissement par le stress oxydant mitochondrial
Évidences de compromis évolutifs : support à la pléiotropie antagoniste
La quiescence facultative induite par le froid chez M. mercenaria
Perspectives
Perspectives pour la mise en évidence d’une relation inverse ERO longévité
Perspective pour la poursuite de la recherche sur la relation inverse entre la susceptibilité à l’oxydation des membranes et la longévité
Synergie entre production des ERO et IP
ANNEXE A SUPPORTING INFORMATION – CHAPTER I
ANNEXE B SUPPORTING INFORMATION – CHAPITRE II
ANNEXE C SUPPORTING INFORMATION – CHAPITRE III
RÉFÉRENCES

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