Soutenance mémoire
STRUCTURE DE LA CAPSIDE
La capside de Poliovirus possède une symétrie icosaèdrique (formée de sousunités formant un réseau hexagonal composé de 20 faces et de 12 sommets et de 3 axes de symétrie par rotation). Elle est formée par 60 exemplaires de chacune des 4 protéines capsidales (VP1, VP2, VP3 et VP4). La structure tridimensionnelle de la capside a été mise en évidence par cristallographie aux rayons X avec une résolution de 29 nm [HOGLE et al., 1985]. Elle a montré que chaque VP est constituée de 2 hélices-α et 8 brins-β plissés anti-parallèlement (B à I) reliés entre eux par 4 boucles de connexion (B-C; H-I; D-E et G-F). L’ensemble forme la structure appelée barillet-β. Les brins-β forment le squelette de la capside tandis que la majorité des boucles et les extrémités C-terminales constituent les régions exposées à la surface de la capside où se trouvent les 3 sites antigéniques majeurs de neutralisation [site 1, 2, 3 (a, b, c)]. En s’associant avec VP4 (protéine interne), les extrémités Nterminales des protéines VP1, VP2 et VP3 forment un réseau à la surface interne de la capside [BLONDEL et al., 1993; RUECKERT, 1996]. Les boucles de connexion de la protéine VP1, dont principalement B-C, sont réparties autour des axes de symétrie 5 pour former un plateau autour duquel existe une profonde dépression de 2,5 nm appelée « canyon ». Ce « canyon » contient le site d’attachement au récepteur cellulaire. Les protéines VP2 et VP3 alternent autour des axes de symétrie 3 [BLONDEL et al., 1995]. Il faut noter que l’extrémité glycine N-terminale myristylée de VP4 se lie à un acide gras tétradécanoïque par une liaison covalente [CHOW et al., 1987]. Cette myristylation semble indispensable à l’assemblage des pentamères, à la stabilité de la capside [ANSARDI et al., 1992] ainsi qu’à l’infectivité du virus dans l’étape précoce de l’infection [KRAUSSLICH et al., 1990]. Donc à part la protection du génome, la capside assure deux fonctions biologiques majeures :
– le support des sites antigéniques reconnus par les anticorps neutralisants;
– le support des sites d’attachement au récepteur cellulaire.
PROPRIETES PHYSICO-CHIMIQUES
Le Poliovirus a une densité de 1,34 g/cm3 en gradient de chlorure de césium et il est stable à pH compris entre 3 à 9 [BLONDEL et al., 1995]. Il a une masse moléculaire de 8,43.106 Da avec 31,6% d’ARN et 68,4% de protéine [RUECKERT, 1996]. L’absence d’enveloppe le rend résistant aux agents physico-chimiques (alcool 70%, lysol 5%), aux ammoniums quaternaires 1%, ou aux solvants des lipides tels que l’éther ou le désoxycholate de sodium. Mais il est inactivé rapidement par la chaleur au-delà de 45°C, les U.V., les désinfectants et les antiseptiques majeurs (polyvidone iodée ; hypochlorite de sodium ; aldehydes ; formol 0,3% ; à l’acide chlorhydrique 0,1%). Il peut survivre à une température de -20°C et même à -70°C pendant 8 ans.
MUTATIONS PONCTUELLES
Au cours de la synthèse de l’ARN viral, l’absence de l’activité de relecture ou « proof-reading » de l’enzyme 3Dpol (ARN polymérase) [WIMMER et al., 1993] engendre un taux de mutations assez élevé. Il est de l’ordre de 10-3 à 10-4 substitution par site nucléotidique et par réplication [une ou deux substitutions nucléotidiques par génome et par semaine, soit 1 à 2% (150 nt) du génome entier par an]. Ces mutations codantes et silencieuses concernent le génome entier [NOTTAY et al., 1981 ; DRAKE, 1993 ; KEW et al., 1995]. Une mutation peut être soit une délétion (retrait), soit une insertion (ajout), soit une substitution (remplacement). Pour ce dernier cas, elle peut être une transition (Ts) [une mutation entre 2 pyrimidines (T<->C) ou 2 purines (A<->G)] ou une transversion (Tv) [une mutation entre 1 base pyrimidine et 1 base purine {A ou G}<->{T ou C}].
POLIOMYELITE ANTERIEURE AIGUE
La poliomyélite (en grec, polios : gris et myelos : moelle) est la manifestation clinique d’une infection engendrée par un Poliovirus. Elle est caractérisée par des paralysies consécutives à l’atteinte de la substance grise de la moelle épinière. La période d’incubation de ce virus est en général de 7 à 14 jours, mais elle peut aller de 3 à 35 jours. Après l’ingestion, le virus se multiplie dans les tissus lymphoïdes de l’oropharynx (amygdale) et dans les muqueuses intestinales (plaques de Peyer). A partir de ces endroits, il peut être excrété dans les selles, ou rejoindre la circulation sanguine provoquant une virémie transitoire qui, dans la majorité de cas (95-99%) est asymptomatique ou accompagnée des signes cliniques non spécifiques. Mais dans une minorité de cas (0,5%), ce virus présent dans le sang peut re-infecter les ganglions lymphatiques régionaux, cervicaux et mésentériques et être à l’origine d’une seconde virémie plus intense que la première avec une infection du système nerveux central (SNC). Le virus pénètre dans le SNC soit en franchissant directement la barrière hémato-encéphalique (BHE), soit via les cellules monocytaires, soit en se propageant le long des fibres nerveuses. Les cellules cibles préférentielles de ce virus dans le SNC sont les neurones moteurs des cornes antérieures des régions cervicale et lombaire de la moelle épinière mais il peut infecter aussi les neurones de la formation réticulaire et certains noyaux moteurs au niveau du tronc cérébral. L’infection neuronale se traduit cliniquement par une paralysie flasque permanente, caractéristique de la maladie, touchant fréquemment les membres. Les paralysies les plus sévères touchant plusieurs membres et le tronc sont parfois mortelles (10% de cas de poliomyélite paralytique) parce qu’elles peuvent s’accompagner de troubles respiratoires dus à l’infection des neurones moteurs de la moelle épinière ou au dysfonctionnement des centre respiratoires [DELPEYROUX et al., 1998; BLONDEL et al., 2000]. La prophylaxie de la poliomyélite est réalisée par l’emploi de deux types de vaccins trivalents dans lesquels existent les 3 sérotypes des PVs. Ces vaccins sont : le Vaccin Polio Injectable inactivé (VPI) contenant des virus tués au formol et le Vaccin Polio Oral (VPO) qui contient des virus vivants atténués sélectionnés après plusieurs passages successifs in vitro et in vivo sur des tissus de singe. Ce dernier et ,mis au point par Koprowski en 1952, est thermosensible [ANDREWES et al., 1978]. Ces deux vaccins présentent chacun des avantages et des inconvénients. Par rapport au VPI, le VPO peut induire une immunité durable aussi bien humorale (sérique) que locale (intestinale) parce que ses virus sont capables de se multiplier dans l’intestin. Cette immunité intestinale inhibe la multiplication et l’excrétion des virions dans l’environnement. Il contribue ainsi à limiter la circulation des PVs en réduisant le nombre d’excréteurs potentiels. Un sujet vacciné par le VPO peut en « vacciner » un autre par l’intermédiaire de contact (passage interhumain). Le VPO peut aussi être administré par un personnel peu qualifié et il a un prix de revient plus faible [MELNICK, 1996; DELPEYROUX et al., 1998; BLONDEL et al., 2000]. L’ensemble de ces raisons a amené l’OMS à utiliser le VPO comme vaccin de choix pour le programme d’immunisation mondial qui consiste à vacciner tous les enfants de moins de 5 ans. Depuis le début de la campagne d’éradication, le nombre de cas de la poliomyélite dans le monde a beaucoup régressé : estimé à 350 000 cas en 1988, il a régressé à quelques centaines de cas au premier trimestre 2002 [DELPEYROUX, 2002]. Mais l’inconvénient majeur du VPO est l’instabilité génétique et phénotypique des souches vaccinales qui peut engendrer de nouveaux cas de poliomyélite : la « poliomyélite paralytique associée à la vaccination » (PPAV). Cette nouvelle maladie estimée à 1 cas pour 700 000 primo-doses [DELPEYROUX, 2002] est due à la réversion de l’atténuation de la virulence des virus vaccinaux ou aux phénomènes de recombinaisons génomiques. Ces 2 mécanismes biologiques rendent plus difficile l’éradication de la poliomyélite par l’emploi de VPO car ils peuvent favoriser la formation d’autres virus : « vaccine-derived poliovirus » (VDPV) [CDC, 2001(a) et (b)] et « vaccine-derived recombinant » (VdRec) [CUERVO et al., 2001]. Ces 2 nouveaux virus peuvent être éliminés en limitant leur circulation dans la nature en augmentant le taux de couverture vaccinale.
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Table des matières
INTRODUCTION
I -Historique
II- Justifications et objectifs des recherches entreprises
II-1- Justifications
II-2- Objectifs des recherches
GENERALITES
I- Poliovirus
I-1- Définition et classification
I-2- Caractéristiques du virus
I-2-1- Caractères structuraux
I-2-1-1- Structure du génome
I-2-1-2- Structure de la capside
I-2-1-3- Déterminants moléculaires de l’atténuation des souches de Vaccin Polio Oral (VPO)
I-2-2- Propriétés physico-chimiques
I-2-3- Bases génétiques de la variabilité de poliovirus
I-2-3-1 – Mutations ponctuelles
I-2-3-2 – Recombinaison génomique
I-3- Multiplication virale
I-3-1- Phase précoce : adsorption – pénétration et décapsidation
I-3-2- Synthèse virale : traduction et réplication
I-3-3- Phase tardive : assemblage et libération des virions
I-4- Diagnostic virologique
I-4-1- Isolement sur cultures cellulaires
I-4-2- Identification du virus
II- Poliomyélite antérieure aiguë
MATERIEL ET METHODES
I- Matériel
I-1 Virus étudiés
I-2- Choix des régions génomiques étudiées
II- Méthodes
II-1- Extraction de l’ARN génomique
II-1-1- Principe
II-1-2- Technique de l’extraction
II-2- Amplification génique par technique « Reverse Transcription – Polymerase Chain Reaction » ou RT-PCR
II-2-1- Principe
II-2-2- Amorces utilisées
II-2-3- Optimisation de la concentration de RT et deMgCl2
II-2-4- Technique RT-PCR
II-3- Visualisation et vérification des fragments amplifiés sur un minigel d’agarose
II-3-1- Principe de l’électrophorèse
II-3-2- Technique de l’électrophorèse
II-4- Digestion enzymatique des amplicons par la technique RFLP – « Restriction Fragment Length Polymorphism assay »
II-4-1- Principe
II-4-2- Visualisation des fragments générés
II-4-3- Analyses des profils RFLP dans les 3 régions du génome
II-5- Amplification de la région VP3-2A et purification des amplicons
II-5-1- Amplification de la région VP3-2A
II-5-2- Purification des amplicons
RESULTATS
I- Optimisation de la technique RT-PCR
II- Visualisation et vérification des amplicons
III- Fragments générés après digestion enzymatique
III-1- Avec les souches isolées pendant les enquêtes JNV97 et ACIP95-96
III-1-1- Digestions de la région VP3-VP1 (972 pb – 1901-2872 nt)
III-1-1-1- Enzyme HinfI
III-1-1-2- Enzyme DpnII
III-1-1-3- Enzyme DdeI
III-1-1-4- Enzyme RsaI
III-1-2- Digestions de la région VP1-2A (779 pb – 2861-3639 nt)
III-1-2-1- Enzyme HinfI
III-1-2-2- Enzyme DpnII
III-1-2-3- Enzyme DdeI
III-1-2-4- Enzyme Rsal
III-1-3- Représentation de l’arbre phylogénétique
III-2- Avec les souches isolées dans le cadre de la surveillance des cas de PFA (Tableau3)
III-2-1- Digestions de la région VP3-VP1 (969 pb – 1915-2883 nt)
III-2-2- Digestions de la région VP1-2A (779 pb – 2872-3647 nt)
III-2-3- Digestions de la région 3Dpol-3’ntr (929 pb – 6535-7439 nt)
DISCUSSIONS
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