La superfamille Tc1-mariner

Listes des figures, tableaux et annexes
Listes des abréviations
Introduction bibliographique
I. Les éléments mobiles de classe II
1. Les transposons procaryotes (pour revue Merlin et Toussaint, 1999)
1.1 Les séquences d’insertions (IS)
1.2 Les séquences composites
1.3 Les séquences non composites
2. Les transposons eucaryotes
2.1 Sous-classe 1
2.2. Sous-classe 2
2.3. Les MITES (Miniature Inverted Repeat Transposable Element)
II. La superfamille Tc1-mariner
1. La famille TLE (Tc1-like element)
2. La famille MLE (mariner like element)
3. Caractéristiques structurales des transposons Tc1-mariner
3.1. Caractéristiques nucléiques
3.2. Caractéristiques protéiques
III. Mécanisme de transposition de type « couper-coller »
1. Les transposons Tc1-mariner actifs
2. Le mécanisme de transposition
2.1. Fixation à l’ADN
2.2. Formation du complexe synaptique
2.3. Excision du transposon
2.4. Intégration dans le site cible
3. Mécanisme de régulation de la transposition
3.1. Régulation de la transcription
3.2. Inhibition par surproduction de la transposase
3.3. Complémentation de type dominant-négatif
3.4. ITRs leurres
4. Facteurs influençant l’efficacité de transposition
4.1. Cations bivalents
4.2. Température
4.3. Taille du transposon
5. Influence des facteurs d’hôtes
IV. Intérêt de l’étude des MLEs et TLEs
1. Intérêt fondamental
1.1. Mode de propagation et évolution des éléments transposables
1.2. Impact des éléments transposables sur l’évolution des génomes
2. Intérêt des éléments transposables en biotechnologie
V. L’ élément mariner Pacmmar1
Résultats et discussion
I. Caractérisation de l’élément Pacmmar1
1. Résultats
1.1. Nombre de copies de l’élément Pacmmar1 dans le génome-hôte
1.2. Caractérisation des ITRs de l’élément Pacmmar1
1.3. Recherche d’éléments Pacmmar1 complets dans le génome-hôte
1.4. Analyse in silico des éléments Pacmmar1.1 et Pacmmar1.2
2. Discussion
II. Etude fonctionnelle de l’élément Pacmmar1
A. Etude fonctionnelle de l’élément Pacmmar1 in vitro
1. Résultats
1.1. Production de la transposase
1.2. Tests de transposition in vitro
1.3. Etude de la fixation des transposases à l’ADN
1.4. Etude de l’activité de clivage des transposases
1.4.3.3. Spécificité de clivage du transposon
1.4.3.4. Détermination du site de clivage
1.5. Activité d’insertion des transposases
2. Discussion
B. Activité des transposases en cellules eucaryotes
1. Résultats
1.1. Production des transposases
1.2. Tests de transposition in vivo
1.3. Détermination des sites d’excision
1.4. Etude de l’insertion du pseudo transposon
1.4.2. Détermination du nombre d’insertions par génome
1.5 Localisation cellulaire des transposases
2. Discussion
C. Etude de l’activité de la transposase sur support polymère conducteur
1. Principe de fonctionnement des supports biocapteurs
2. Etude de l’activité de la transposase sur support polymère
2.1. Principe
2.2. Résultats
2.3. Conclusion
Conclusion et perspectives
Matériels et méthodes
I. Matériels
1. Pachygrapsus marmoratus
2. Souches bactériennes et milieux de culture
3. Lignées cellulaires et traitement des cellules
4. Amorces et oligonucléotides
II. Méthodes
1. Techniques de base de biologie moléculaire
1.1 Extraction d’ADN génomique
1.2 Extraction de plasmide
1.3 Purification d’ADN par phénol/chloroforme
1.4 Amplification d’ADN par PCR (réaction de polymérisation en chaîne)
1.5 Clonage des fragments amplifiés par PCR
1.6 Production de bactéries chimiocompétentes
1.7 Transformation bactérienne
1.8 Séquençage
2- Caractérisation de l’élément Pacmmar1
2.1 Caractérisation des ITRs de Pacmmar1
2.2 Recherche de nouvelles copies de l’élément
2.3 Dot blot
3- Activité des transposases in vitro
3.1 Constructions des plasmides
3.2 Production des transposases
3.3 Test de transposition in vitro
3.4 Etude de l’activité de fixation par retard de migration sur gel
3.5 Etude de l’activité de coupure
3.6 Détermination des sites de coupure
3.7 Test d’insertion
4. Etude de la fonctionnalité in vivo
4.1 Constructions des plasmides
4.2 Test de transposition
4.3 Test d’excision
4.4 Localisation des sites d’insertion
4.5 Southern blot
4.6 Western blot
4.7 Localisation cellulaire par immunofluoresence
5- Méthodes Bio-informatiques
6- Etude de l’activité de la transposase sur support polymère conducteur
6.1 Ancrage de Pacmmar1 sur une matrice polymère
6.2 Etude de l’activité de la transposase
Références bibliographiques
Annexes