LA SENSIBILITE IN VITRO DES COCCI A GRAM POSITIF AUX ANTIBIOTIQUES

TAXONOMIE ET CLASSIFICATION

         Les staphylocoques appartiennent à la famille des micrococcaceae qui comprend quatre genres qui diffèrent par la composition en base de leur ADN G+ C (mol%)
– Micrococcus
– Staphylococcus
– Stomatococcus
– Planococcus
Les espèces appartenant à ces genres possèdent une catalase et se développent en aérobie. Les cocci à Gram positif en amas qui se développent uniquement en aérobiose sont dénommés Peptococcus [ 42
• Le genre Micrococcus : Comprend les microcoques qui sont également des hôtes normaux de la peau et des muqueuses de l’homme et par conséquent souvent présents dans les prélèvements. Ce sont presque toujours des contaminants qu’il importe de distinguer des staphylocoques.
• Le genre Staphylococcus : Plus de 30 espèces de staphylocoques ont été identifiées dont la plupart sont trouvées seulement chez les mammifères inférieurs [ 48] Leur classification a subi depuis 30 ans d’incessants changements aboutissants à une meilleure précision grâce à la prise en compte non seulement des classiques caractères morphologiques, physiologiques et métaboliques mais aussi de certains caractères génétiques, antigéniques et écologiques. Il existe malheureusement non pas une seule mais plusieurs classifications, qu’il est cependant utile de connaître en pratique [23].
– classification de Baird-Parker : Elle ne reconnaît que trois espèces bien déterminées : S.aureus, S.epidermidis et S.saprophyticus. Mais beaucoup de souches de staphylocoques demeurent inclassables. Les espèces S.epidermidis et S.saprophyticus comprennent chacune 4 biotypes. classification de Kloss et Schleifer Ces auteurs distinguent dix espèces dans le genre Staphylococcus. Certaines d’entre elles sont bien individualisées ; d’autres sont regroupées sur la base de caractères communs. Malgré cette division du genre, la pratique montre qu’il reste 15% de souches inclassables.
– subdivision des souches de staphylococcus aureus en fonction  de l’origine animale.
Espèce ubiquitaire, S.aureus s’est cependant adapté à diverses niches écologiques et des biotypes ont été décrits chez les différentes espèces animales. Récemment Hajek et Marsalek ont proposé une subdivision en 4 biotypes A, B, C etD. Les biotypes E et F initialement décrits ont été regroupés dans une espèce : S. intermedius. Deux autres espèces ont été récemment identifiées : S.hyicus et S.sciuri. Mais récemment la famille des Micrococacceae a été démantelée et l’espèce S.aureus n’est plus regroupée avec d’autres genres bactériens. En 1998, 41 taxons incluant 35 espèces et 7 sous espèces ont été décrits [23] S.aureus exprime des caractères qui le différencient des autres staphylocoques : il possède notamment une coagulase et est souvent pathogène. On l’oppose classiquement aux autres staphylocoques non producteurs de coagulase et plus rarement responsables d’infections.
• Le genre Stomatococcus : Comprend Stomatococcus nucilaginosus qui fait partie de la flore buccale.
•Le genre Planococcus : Comprend des bactéries du milieu marin

Caractères biochimiques

         L’étude des différents caractères biochimiques et métaboliques des souches de staphylocoques a permis le développement de galeries d’identification rapides et efficaces, permettant de définir les différents profils biochimiques de souches appartenant à une même espèce [28].
Caractères généraux Les staphylocoques possèdent une catalase à l’exception de S. aureus sous espèce anaérobius que l’on retrouve exclusivement chez les moutons [28, 30] et qui est une souche anaérobie stricte. Ce sont des germes dépourvus d’oxydase en dehors de S. lentus, S. sciuri et S. caseolyticus [28, 24].
Production d’Uréase [29] Les bactéries hydrolysent toute l’urée mais seules celles ayant une uréase constitutive, c’est à dire dont la synthèse est indépendante de la présence du substrat, vont arriver à alcaliniser le milieu, entraînant le virage de l’indicateur coloré L’uréase est également une enzyme inductible. La recherche de l’uréase repose sur la libération d’ions ammonium qui alcalinisent le milieu, entraînant le virage du rouge de phénol du jaune au rouge cerise.
Production d’acétoïne [29] Les micro:-organismes produisent lors de leur métabolisme, de nombreux produits de dégradation qui comme dans le cas ci-présent peuvent être recherchés. L’acétoïne en langage courant, ou hydroxy-3-butanone ou encore dans la nomenclature ancienne acétyl-méthyl-carbinol (AMC) est un produit de dégradation du glucose au cours de la fermentation 2-3 butyléne glycolique en passant par l’acétolactate et le diacétyl. Elle peut également être obtenue par condensation de deux molécules de pyruvate. Il existe entre autres, la méthode conventionnelle de Voges-Proskauer miniaturisée ou non, incorporée aux méthodes biochimiques d’identification des staphylocoques disponibles dans le commerce.
Production de décarboxylases [29] La production de l’omithine décarboxylase (ODC) concerne essentiellement l’espèce S. lugdunensis et secondairement certaines souches de S. epidermidis dont l’enzyme a cependant une activité retardée. Les décarboxylases sont des enzymes qui sont actives à pH acide ; le milieu d’étude sera donc acidifié par la fermentation du glucose puis réalcalinisé par l’action des décarboxylases sur le substrat qui est un acide aminé. Les décarboxylases scindent les acides aminés avec formation de l’amine correspondante et libération de dioxyde de carbone selon la réaction suivante : Les enzymes recherchées le plus souvent sont : l’ornithine décarboxylase (ODC)
– l’arginine dihydrolase (ADH)
– la lysine décarboxylase (LDC)
Production de la bêta-galactosidase [29] La f3-galactosidase est une enzyme bactérienne inductible, existant à un ni veau de base dans le milieu intracellulaire, capable de scinder la molécule de lactose en sucres simples que sont le glucose et le galactose après avoir traversé la paroi cellulaire sous l’action de la béta-galactosidase perméase. Le terme ONPG hydrolase est plus à propos que celui de b~ta-galactosidase dans la mesure où il précise que le substrat utilisé est l ‘ONPG et non le lactose. En effet; il existe des germes qui reconnaissent l ‘ONPG du coté du nitro-2-phénol et non de celui du b~ta-galactotosidase . Ces germes ont donc une activité ONPG hydrolase tout en ne fermentant pas le lactose. Le test à l’ONPG est une technique relativement simple, basée sur l’action directe de l’enzyme sur une molécule chromogène pouvant être l’ortho- nitrophényl-bêta-Dgalactopyranoside, ou le 2-naphtol-béta-D-galactopyranoside. Ceux-ci sont utilisés comme substrats et libèrent respectivement l’orthonitrophénol jaune et le bêta-naphtol qui se combine au sel de Fast blue B en solution dans le 2-méthoxyéthanol pour donner une coloration rouge pourpre.
Réduction des Nitrates La réduction des nitrates et des nitrites constitue un des caractères taxonomiques importants chez les staphylocoques lors de leur identification. Ce test permet d’étudier la réaction de réduction des nitrates en nitrites sous l’action du nitrate réductase produite par certains staphylocoques. La réaction sera mise en évidence par l’addition d’acide sulfanilique et d’alphanaphtylamine qui révèlent la présence de l’ammoniaque libérée
Utilisation des hydrates de carbone Les glucides sont utilisés de trois manières différentes par les staphylocoques : soit après conversion par l’action d’isomérases, soit après hydrolyse en sucres simples ou directement, s’ils sont fournis sous une forme simple (glucose, fructose) [33]. L’assimilation étudiée surtout par la voie ferrnentaire mais également par la voie oxydative se traduit presque toujours par l’accumulation de dérivés acides quelle que soit la voie de dégradation.

Absence de catalase

      Elle permet d’établir un diagnostic différentiel entre Streptococcus d’une part et Staphylococcus et Micrococcus d’autre part. L’absence de catalase constitue alors un caractère clef d’orientation vers les streptocoques.

Définition d’un antibiotique

        Les antibiotiques sont des substances chimiques ou hémi synthétiques élaborées par des micro-organismes et qui ont le pouvoir de s’opposer à la multiplication de bactéries en les détruisant ou en inhibant leur multiplication. Pour être efficace, l’antibiotique doit satisfaire aux trois conditions suivantes :
– pénétration à l’intérieur de la bactérie ;
– intervention au niveau d’une cible à l’intérieur de cette bactérie;
– l’antibiotique ne doit pas être inactivé par des enzymes pouvant être synthétisées par cette bactérie.
L’action de l’antibiotique sur la bactérie se traduit par:
• des modifications de la croissance: dans ce cas l’antibiotique est bactériostatique.
• des modifications de la capacité de survie : dans ce cas l’ antibiotique est bactéricide.

Table des matières

INTRODUCTION
PREMIERE PARTIE: RAPPEL BIBLIOGRAPHIQUE
1 Les Staphylocoques
I-1 Définition
I-2 Historique
I-3 Classification
I-4 Habitat
I-5 Caractères bactériologique
I-5-1 Caractères morphologiques
I-5-2 Caractères culturaux
I-5-3 Caractères biochimiques
I-5-3-1 caractères généraux
I-5-3-2 Production d’uréase
I-5-3-3 Production d’acétoine
I-5-3-4 Production de décarboxylase
1-5-3-5 Production de la~ galactosidase
1-5-3-6 Réduction des nitrates
l-5-3-7Utilisation des hydrates de carbone
II Les Streptocoques et Entérocoques
11-1 Définition
11-2 Historique
11-3 Classification
11-4 Habitat
11-5 Caractères bactériologiques
II-5-1 Caractères morphologiques
II-5-2 Caractères culturaux
II-5-2-1 Culture sur milieux usuels
11-5-2-2 Culture sur milieux enrichis
11-5-3 Caractères biochimiques
11-5-3-1 Absence de catalase
II-5-3-2 Sensibilité à la bacitracine
11-5-3-3 Le groupage antigénique
III La croissance bactérienne
III-1 Définition
llI-2 Courbe et phases de croissance
llI-3 Facteurs influençant la croissance bactérienne
III-4 Techniques de mesure de la croissance
III-5 Conditions physico-chimiques de croissance des Staphylocoques et des Staphylocoques et des Streptocoques
IV Les antibiotiques et l’étude de la sensibilité aux antibiotiques
IV-1 Les antibiotiques
IV-1-1 Définition
IV -1-2 Mécanisme d’action
IV-1-3 Classification
IV-2 Méthodes d’étude de la sensibilité aux antibiotiques
IV-2-1 Méthode de diffusion: Antibiogramme standard
IV-2-2 E-test® ( epsilonmeter-test) : Méthode des bandes
IV-2-3 La micro méthode d’étude in vitro de la sensibilité : ABG staph et ABG strepto
V Procédures de validation et définition de quelques paramètres de validation
V-1 Linéarité ou domaine d’analyse
V-2 Limite de détection
V-3 Précisions
V-4 Droite de régression
V-5 Specificité
V-6 Sensibilité
V-7 Exactitude et justesse
DEUXIEME PARTIE : TRAVAIL PERSONNEL METHODOLOGIE
I- Matériel et Milieux 
I-1 Matériel
I-1-1 Cadre d’étude
I-1-2 Souches bactériennes
I-1-3 Matériel pour l’indentification
I-1-4 Matériel pour l’étude de la croissance
I-1-5 Matériel pour l’étude de la sensibilité
I-1-6 Matériel pour la conservation des souches
I-2 Milieux
I-3 Contrôle de qualité des tests effectués
I-3-1 Contrôle de stérilité des milieux d’enrichissement et d’isolement
I-3-2 Contrôle de stérilité et d’efficacité des microplaques
I-3-3 Contrôle des appareils
I-3-4 Contrôle des paramètres dynamiques
II- Méthodes 
II-1 Identification
11-1-1 Identification des souches de Staphylocoques
II-1-2 Identification des souches de Streptocoques
II-2 Détermination de l’inoculum par l’étude de la croissance
II-3 Etude de la sensibilité avec les microplaques
II-4 Etude comparative avec l’antibiogramme standard et la méthode de diffusion en milieu gélosé
RESULTATS ET COMMENTAIRES
I- Etude de la sensibilité en fonction de l’inoculum et du temps d’incubation de la microplaque
I-1 Staphylococcus aureus
I-2 Staphylococcus epidermidis
I-3 Streptococcus pyogenes
I-4 Entérococcus faecalis
II- Validation
II-1 Traçage de la droite de regression
II-1-1 Staphylococcus aureus
II-1 -2 Staphylococcus epidermidis
II-1-3 Streptococcus pyogenes
II-1-4 Enterococcus faecalis
DISCUSSION
1- Les souches bactériennes
2- Effet inoculum par l’ étude de la croissance par la méthode du dénombrement
3- Etude de la sensibilité avec les microplaques CSB-Sensibilité
3-1 Inoculum bactérien
3-2 Les antibiotiques
3-3 Temps d’incubation des microplaques CSB-Sensibilité
4- Validation
CONCLUSION
REFERENCES BIBLIQUES

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