Soutenance mémoire
Etude du potentiel reproducteur
Plusieurs paramètres du potentiel reproducteur ont été déterminés suite à l’application du captopril, à savoir :
– La duré de la période de pré-oviposition : déterminée par le nombre de jours séparant l’émergence et le début de la ponte.
– La duré de la période de l’oviposition correspond à la durée (en jours) de la période ponte.
– La fécondité des femelles exprime le nombre total d’œufs pondus par femelle durant toute la période d’oviposition.
– La viabilité des œufs est le nombre oeufs éclos parmi la totalité des œufs pondus par femelle.
Principe de l’électrophorèse
L’électrophorèse est une technique de séparation fondée sur le fait que les molécules portant des charges électriques différentes migrent à des vitesses différentes lorsqu’elles sont placées dans un champ électrique. La vitesse de migration dépend également du poids moléculaire, de la configuration, ainsi que des propriétés amphotères de la protéine (Lemoine, 1980; .Mauer, 1991). La séparation électrophorétique des protéines est réalisée selon la technique de Laemmli, (1970). Il s’agit d’une électrophorèse verticale sur gel de polyacrylamide (PAGE) à 30 %. Ce gel joue le rôle d’un tamis moléculaire additionné de sodium dodécyl sulfate (SDS) à 10%. Le SDS est un détergent anionique qui dénature les protéines et leur donne une charge négative ce qui donne une densité de charge équivalente par unité de longueur de polypeptide. Par conséquent, les protéines vont migrer dans le gel et la distance parcourue sera en corrélation avec leur poids moléculaire (Kaufman, 1995).
Principe du dosage des ecdystéroïdes
Les ecdystéroïdes ont été dosés selon la technique enzymo-immunologique (EIA) adaptée par Porcheron et al. (1989) (Fig. 5), puis modifiée par De Reggi et al. (1992). Cette technique repose sur la compétition entre le traceur enzymatique qui est la peroxydase couplé à la 2-succinyl 20 hydroxyecdysone et les ecdystéroïdes des extraits biologiques pour les sites limités d’un anticorps anti- ecdystéroïdes appelé anticorps primaire. Les complexes formés seront ensuite fixés par un second anti corps anti immunoglobuline de lapin (Jackson Immunoresearch) retenu sur une microplaque à 96 puits (NUCN Immunoplate F96 , Danemark). Après trois heures d’incubation, les éléments non retenus seront éliminés au cours d’un rinçage des plaques. Un réactif de révélation de la peroxydase, la tétramétylbenzidine (TMB) (Sigma, France) est utilisée. Celle-ci se fait sous agitation pendant 15-20 minutes et les densités optiques sont mesurées à l’aide d’un lecteur de plaque (Labsystem, Finlande) à 630 nm. La mesure de la quantité de la peroxydase fixé permet de déterminer la quantité des ecdystéroïdes contenue dans les échantillons biologiques a partir d’une courbe de référence réalisée avec des solutions standards d’ecdysone et de 20 hydroxyecdysone , le signal colorimétrique (exprimé par les absorbances) sera inversement proportionnel à la quantité des ecdystéroïdes contenus dans les échantillons
Effet sur le taux des ecdystéroïdes
Les ecdystéroïdes et l’hormone juvénile présentent des taux hémolymphatiques fluctuants tout au long du développement des insectes (Hagedorn,1985 ; Riddiford, 1985, 1994 ; Rees, 1995 ; Romana et al.,1995), les pics hormonaux sont associés a des évènement important dans le développement, notamment les mues (apolyse et synthèse de la cuticule), la métamorphose (Gäde et al ., 1997 ; Aribi et al.,1997) et la reproduction (Hagedorn, 1984 ; Cassier, 1996). Selon les espèces un ou deux pics sont détectés durant la métamorphose : Pieris brassicae (Lafont et al., 1974), Leptinotarsa decemlineata (Hsiao et al., 1975) et T. molitor (Delbecque et al., 1978) présentent un seul pic, tandis que Galleria mellonella (Bollenbacher et al., 1978) et cydia pomonella (Soltani, 1986) ont en deux pics. Les ecdystéroïdes exercent leurs effets sur les tissus cibles via l’interaction avec les récepteurs nucléaires EcR qui forme un hétérodimère avec la protéine ultraspirale USP (Yao et al., 1992; Bonneton et al ., 2003; Henrich, 2005). Durant la phase ascendante du pic, la fixation de la molécule 20E sur le complexe EcR-USP entraîne l’expression d’une cascade de gènes appelés ˝up regulated genes˝ il s’agit de BR-C (Broad complexe), E74, E75 (Kokoza et al., 2001 ; Chen et al., 2004 ; Zhu et al., 2007) qui codent pour la division des cellules épidermiques, la sécrétion du fluide exuvial, la digestion cuticulaire, la synthèse de la cuticule et l’épicuticule, la synthèse de l’hormone d’éclosion au niveau des cellules neurosecrétrices ventro-médiales ainsi que son stockage dans les nerfs proctodéales. La phase descendante du pic de la 20E et en conséquence de la faible concentration ou l’absence de l’hormone, une autre série de gènes ״down regulated gènes״ s’exprime permettant ainsi, la libération de l’hormone d’éclosion et la sclérotisation (Retnakakaran et al., 2003). L’analyse quantitative des ecdystéroïdes au cours du stade nymphale dans le corps entier des chrysalides d’Ephesthia kuehniella révèle la présence de deux augmentations dans les taux des ecdystéroїdes, l’une au troisième jour et l’autre au cinquième jour de la vie nymphale (Yezli-Touiker & Soltani-Mazouni, 2011). Le pic à 5 jours est responsable du développement imaginal puisqu’ il coïncide avec la synthèse de la cuticule pré-éxuviale adulte qui débute au quatrième jour et se poursuit jusqu’à la veille de l’exuviation adulte (Maamcha, 1997, Yezli-Touiker & Soltani-Mazouni, 2011), ce pic est retrouvé également chez les mâles d’E. kuehniella (El Ouar et al., 2010). Il est également l’équivalent du pic unique retrouvé chez T.molitor (Aribi et al ., 2001; Soltani et al.,2002) et Zophabas atratus (Aribi et al. ,1999). Pour le pic du troisième jour, il est retrouvé chez la plupart des insectes (Zimowska et al., 1991). Ainsi le pic à 3 jours parait d’origine ovarienne, alors que celui du 5eme jour est d’origine prothoracique. lépidoptère, comme Bombyx mori (Swevers & Latrou, 1999), C. pomonella (Soltani et al., 1989). Il est lié au processus de la reproduction. En effet, il coïncide avec le début de la vitellogénèse. Le traitement in vivo des chrysalides d’Ephesthia kuehniella avec le captopril modifie le profil hormonal des ecdystéroïdes en augmentant les valeurs hormonales dés le premier jour du stade nymphal. Le captopril, augment les taux des ecdystéroïdes via la stimulation du cerveau qui secréter la PTTH qui à son tour stimule la synthèse des ecdystéroïdes (Tunaz & Ugan, 2004), ou via la stimulation directe des glandes prothoraciques (Rees, 1985 ; Gäde, 1997 ; Niwa, 2010 ; Rewitz, 2013). Kirane-Amrani & Soltani-Mazouni (2012) ont rapporté que l’énalapril, le lisinopril et le captopril administrés par application topique à des chrysalides d’E.kuehniella nouvellement exuviées réduits de manière significative les contenus des ecdystéroïdes dans les extraits du corps entier au 3ème jour. Les mêmes résultats ont été trouvés chez E. kuehniella traitée avec le holofenozide (RH-0345) mais avec une avancée du pic qui s’étale entre deux et quatre jours (El ouar, 2005), des résultats similaires ont été trouvés avec la même molécule le halofenozide (RH-0345), qui entraîne des augmentations dans le contenu des ecdystéroïdes chez les nymphes de T. moitor (Aribi ,2001 ; Soltani, 1999, 2002 ; Berghiche, 2007) en gardant la position du pic qui n’a pas été affectée. D’autres études montrent que le traitement des chrysalides d’E kuehniella avec le pyriproxyfène augment les valeurs hormonales avec une avancée du pic (El ouar, 2005). Le halofenozide testé sur des chrysalides femelles d’E kuehniella entraîne une modification du profil hormonal comparé aux témoins, les contenus hormonaux augmentent dés les six premiers jours de la vie nymphale et une diminution est observée au septième jour (Taibi, 2007).
Effet sur la sécrétion cuticulaire
Les insectes possèdent un exosquelette inextensible pour croître, ils doivent se débarrasser périodiquement de leur ancienne cuticule et en secrété une autre cuticule, c’est le phénomène de la mue. La mue se produit en deux étapes principales : l’apolyse et l’ecdysis. A l’apolyse, l’épiderme se sépare de la cuticule du stade précédent. Entre l’apolyse et l’ecdysis, l’insecte « nouveau » est à l’état pharate, caché sous sa vieille cuticule. C’est cette étape, parfois difficile à observer, qui sert à identifier le début et la fin de chaque stade. L’ecdysis est l’étape où l’insecte se débarrasse de son ancienne cuticule, ou exuvie (Fig. 20). Ce sont les cellules épidermiques qui produisent consécutivement de minces couches cuticulaires et de nombreuses lamelles particulières pour former l’exosquelette de l’insecte (Riddifort, 1985). La cuticule constitue une acquisition fondamentale dans l’évolution des arthropodes. Cette cuticule est composée d’une couche fine externe ou epicuticule, riche en lipides cuticulaire (Vincent & Wegst 2004) qui assure aux insectes une protection contre la déshydratation, une régulation de la permutabilité cuticulaire et une régulation contre les micro-organismes et les champignons entomopathogènes (De Renobales et al., 1991), et une couche interne la procuticule (exocuticule et endocuticule ) plus épaisse composée de protéines et de chitine. Rare sont les études qui ont abordé l’effet des inhibiteur de l’enzyme de conversion de l’angiotensine sur la sécrétion cuticulaire chez les insectes, les résultats de nos observation au microscope photonique, portant sur l’épaisseur de la cuticule nymphale et nouvelle cuticule au cours du stade nymphal chez E. kuehniella, montrent que le captopril augmente significativement l’épaisseur de la cuticule totale à l’apolyse (troisième jour), au premier et au cinquième jour du traitement. Ces résultats sont en accord avec ceux rapportés avec d’autres molécules (Smagghe et al., 1999, Smagghe 1999a). L’épaisseur induite par un agoniste des ecdystéroïdes le halofenozide in vitro en milieu hormonal (addition 20E) est significativement supérieure, les mensurations des cuticules sécrétées par le tégument sternal abdominal nymphal de T. molitor indiquent que l’épaisseur de la nouvelle cuticule traitée avec le halofenozide augmente au cours des différents temps (Soltani et al., 2002 ). Contrairement à nos résultats, le flucycoxuron administré à des chrysalides d’E.kuehniella perturbe la sécrétion cuticulaire, réduit l’épaisseur de la cuticule et retarde légèrement l’apolyse, (Bendjedou et al., 1998).
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Table des matières
1. INTRODUCTION GENERALE
2. MATERIEL ET METHODE
2.1. Présentation du matériel biologique et élevage
2.1.1. Présentation de l’insecte
2.1.2. Cycle biologique
2.2. Présentation et application du traitement
2.3. Etude morphométrique
2.4. Microscopie électronique à transmission
2.5. Potentiel reproducteur
2.6. Extraction et dosage des métabolites
2.7. Extraction et dosage des acides nucléiques
2.8. Technique électrophorétique
2.9. Dosage immuno-enzymatique des ecdystéroïdes
2.10. Analyse statistique des données
CHAPITRE 1 : Impact sur le développement
1. INTRODUCTION
2. RESULTATS
2.1. Effet du captopril sur le profil des ecdystéroїdes
2.2. Effet du captopril sur le taux des acides nucléiques
2.2.1. Effet du captopril sur le taux d’ADN
2.2.2. Effet du captopril sur le taux d’ARN
2.3. Effet du captopril sur le profil électrophorétique des protéines du tégument
2.2. Effet du captopril sur la sécrétion cuticulaire durant la métamorphose
3. DISCUSSION
3.1. Effet du captopril sur le profil des ecdystéroїdes
3.2. Effet sur le taux des acides nucléiques tégumentaires
3.3. Effet sur le profil électrophorétique des protéines tégumentaires
3.4. Effet sur la sécrétion cuticulaire
CHAPITRE 2 : Impact sur la reproduction
1. INTRODUCTION
2. RESULTATS
2.1. Effet du captopril sur la morphométrie de l’ovaire
2.2. Effet du captopril sur l’épaisseur du chorion
2.3. Effet du captopril sur les taux des ecdystéroïdes ovariens
2.4. Effet du captopril sur la composition biochimique des ovaires
2.4.1. Effet du captopril sur le taux des acides nucléiques ovariens
2.4.1.1. Effet du captopril sur le taux d’ADN
2.4.1.2. Effet du captopril sur le taux d’ARN
2.4.2. Effet du captopril sur le taux des protéines ovariennes
2.4.3. Effet du captopril sur la qualité des protéines ovariennes
2 4.4. Effet du captopril sur le taux des glucides ovariens
2.4.5. Effet du captopril sur le taux des lipides ovariens
2.5. Effet du captopril sur le potentiel reproducteur
3. DISCUSSION
3.1. Effet sur la morphométrie des ovaires
3. 2. Effet sur le chorion
3. 3. Effet sur le taux des ecdystéroїdes ovariens
3.4. Effet sur la composition biochimique des ovaires
3.5. Effet du captopril sur le potentiel reproducteur
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
RESUMES
Français
Anglais
Arabe
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXE : PRODUCTION SCIENTIFIQUE (publication et communication)
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