LA REPONSE CELLULAIRE DIRIGEE CONTRE Plasmodium falciparum

Le paludisme

                 Le paludisme est une erythrocytopathie provoquée par des hématozoaires du genre Plasmodium Il est transmis à l’homme par la piqûre infectée (contenant des sporozoïtes) de certaines espèces d’anophèles femelles lors du «repas sanguin». Quatre espèces d’anophèles sont connues à Madagascar comme étant des vecteurs potentiels du paludisme: Anopheles gambiae (vecteur majeur sur les côtes), Anopheles funestus (vecteur majeur des zones de rizières), Anopheles mascarensis (sud est de Madagascar), Anopheles arabiensis. Parmi les 4 espèces plasmodiales (P. ovale, P. malariae, P. vivax, P. falciparum) infectant l’homme, P. falciparum est la plus fréquente en Afrique et l’évolution clinique chez l’homme peut être mortelle. Le cycle de Plasmodium falciparum comporte deux phases (figure 1):
– Phase asexuée ou schizogonie chez l’homme ;
– Phase sexuée ou sporogonie chez l’anophèle.
Phase sexuée ou sporogonie chez l’anophèle Lors du repas sanguin sur un paludéen, l’anophèle femelle absorbe des trophozoïtes, des schizontes, des rosaces et potentiellement des gamétocytes. Les éléments asexués sont digérés et seuls les gamétocytes restent dans l’estomac pour initier la fécondation. Après la fécondation, on obtient un œuf mobile appelé «ookinète». Ce dernier subit une méiose et des séries de mitoses donnant l’ oocyste à l’intérieur duquel s’individualise les sporozoïtes. Libérés par éclatement de l’oocyste, les sporozoïtes migrent dans les glandes salivaires de l’anophèle. Ceux ci sont les formes infectantes prêtes à être injectées à l’homme lors d’un prochain repas sanguin. La durée du cycle sporogonique est de 12 jours pour P. falciparum en Afrique tropicale et le cycle s’arrête lorsque la température moyenne est inférieure à 18° C.
Phase de multiplication asexuée chez l’homme Chez l’homme cette multiplication est encore subdivisée en 2 parties:
– Une phase d’invasion pré-érythrocytaire ou hépatique durant laquelle on ne détecte aucun signe clinique;
– Une phase érythrocytaire caractérisée par l’initiation à la pathogénie.
Phase pré-érythrocytaire : Lors du repas sanguin, l’anophèle femelle infesté injecte la salive contenant des centaines de sporozoïtes dans le torrent circulatoire. Ces sporozoïtes gagnent rapidement le foie (30 minutes après inoculation) où ils sont appelés cryptozoïtes pour effectuer le cycle pre-erythrocytaire. Cette phase consiste en un grossissement des cryptozoïtes suivi d’une série de divisions nucléaires. Pour Plasmodium falciparum, en une semaine environ sont constitués des schizontes matures ou corps bleus contenant quelques milliers de noyaux, déformant l’hépatocyte de l’hôte et repoussant son noyau en périphérie. L’éclatement des corps bleus libère de nombreux mérozoïtes, qui vont continuer leur développement dans le milieu sanguin.
Phase érythrocytaire : Chaque merozoïte entre par endocytose dans une hématie et s’y transforme en stade annulaire ou anneau (« ring form »). Dans le sang s’effectue alors le cycle asexué (schizogonie érythrocytaire) qui consiste en:
-Une évolution progressive du stade annulaire en trophozoïte (possède une volumineuse vacuole nutritive);
-Au grossissement du trophozoïte, le noyau se divise ensuite pour donner un schizonte contenant des pigments malariques ou hemozoïne, GPI ou glycosylphosphatidylinositol…;
-Une individualisation de chaque noyau contenu dans le schizonte. Ainsi se forme un schizonte mature ou un corps en rosace.
-L’éclatement des schizontes matures libérant des merozoïtes qui vont parasiter d’autres hématies pour effectuer un nouveau cycle érythrocytaire.
C’est au cours de cette phase que survient l’accès fébrile dû à la libération de l’hemozoïne ou pigment malarique. Apres plusieurs cycles érythrocytaires schizogoniques, s’amorce le cycle sexué ou sporogonique. Dans les hématies apparaissent des éléments à potentiel sexuel: les gamétocytes mâles (microgamétocytes) et femelles (macrogamétocytes).

Les marqueurs d’activation des lymphocytes

                 A part les marqueurs sis au niveau des lymphocytes qui permettent de les identifier comme: CD2, CD3, CD4, CD5, CD7 et CD8, lors de leur activation, d’autres marqueurs apparaissent:
-CD 69: appelé aussi molécules d’induction de l’activation (AIM), Leu-23. Le CD69 est engagé dans les évènements précoces de l’activation des lymphocytes. Ceci a été montré pour les cellules T, les cellules NK, les cellules B. Des anticorps anti-CD69 augmentent l’activité cytolytique des cellules NK, des thymocytes et des cellules TcRαβ et γδ. Des anticorps anti-CD69 induisent l’activation des plaquettes.
-Foxp3 (Forkhead box P3): facteur de transcription Scurfin, JM2. C’est un marqueur d’activation des lymphocytes T régulateurs (Tr) CD4+/CD25+. Foxp3 est indispensable dans l’activation des cellules T régulateurs, c’est aussi un répresseur de la transcription et tient un rôle majeur dans la maintenance de l’autotolerance.
-CD80 : c’est un marqueur précoce d’activation, régule l’activation des T et l’expression du gène de l’IL-2.

Réponse immune contre le stade érythrocytaire

                Pendant l’infection palustre, la rate est impliquée dans l’élimination des plasmodies, pour la génération de l’immunité et de l’hématopoïèse. Des études suggèrent que les macrophages de la rate agissent de la même manière que les neutrophiles. Ceux-ci extraient les plasmodies intra-erythrocytaires sans que les hématies soient lésées. (Angus et al., 1997, Chotivanich et al.,2000). Lors du développement des parasites, des antigènes protéiques et non protéiques (endotoxines) sont exprimés déclenchant une cascade de réaction immunitaire (Sherman, 1998), comme le montre la figure 3. Les antigènes protéiques sont captés et apprêtés par les CPA puis présentés aux cellules TCD4 dans le contexte de molécules de la classe II. Les cellules CD4 vont se différencier essentiellement en Th1 et sécréter des cytokines (Riley 1999). En produisant IFN-γ, les Th1 induisent l’activation des monocytes/macrophages. Ces derniers éliminent les parasites par phagocytose. Tandis que IL-4 produit par les Th2 induisent la production des anticorps par les plasmocytes (Taylor-Robinson 1998). Parmi toutes les cytokines produites par ces 2 sous populations, la balance entre TNF-α et IFN-γ est très importante aussi bien dans la résolution que dans l’aggravation de l’infection (Riley 1999). En 1990, chez l’homme, on a démontré pour la première fois l’augmentation du tauxdes cellules Tγδ lors de l’accès palustre. (Ho et al., 1990, Roussilhon et al., 1990). Ceci est observable aussi au niveau de la rate d’un paludéen (Bordessoule et al., 1990, Nakazawa et al., 1994). In vitro, les antigènes du stade schizonte stimulent potentiellement les cellules Tγδ (Pichyangkul et al., 1997, Elloso et al., 1998). Ces dernières reconnaissent aussi les antigènes non peptidiques sans présentation aux CMH (Morita et al., 1995) Ces antigènes contiennent des phosphoesters capable de se lier directement aux TcR γδ (Dieli et al., 2001). Les endotoxines parasitaires comme GPI (Glycosylphosphatidylinositol) stimulent l’activité des NO synthases des macrophages aboutissant à l’élimination des parasites (Tachado et al., 1996). Mais ces endotoxines peuvent stimuler directement les macrophages à sécréter le TNF-α. Ce dernier est pyrogène et à l’origine de la séquestration parasitaire au niveau du cerveau (Miller et al., 1994). La phagocytose des merozoïtes de Plasmodium falciparum est observée chez les individus infectés (Sun et Chakrabarti, 1985). Cette phagocytose, non seulement prévient l’invasion des merozoïtes, mais aussi diminue les effets toxiques causés par les molécules de surface des merozoïtes (Gerold et al., 1996, Schofield et al., 1996). Le role des cellules NK lors de l’infection palustre a été découvert récemment. In vitro, les cellules NK purifiées des individus sains et infectés par Plasmodium falciparum lysent directement les cellules infectées (Orago et Facer, 1991). Ces travaux ont été confirmés par Mavoungou et al., 2003). Chez des donneurs non immuns, les cellules NK sont les premières cellules du sang périphériques qui produisent IFN-γ en réponse aux globules rouges infectés (Artavanis-Tsakonas et Riley, 2002). Ce mécanisme peut impliquer un contact étroit entre le parasite et les cellules NK (perforine/granzyme) (Artavanis-Tsakonas et Riley, 2002 ; Artavanis-Tsakonas et al., 2003). Mais les anticorps sont aussi impliqués dans la protection, celle-ci est dirigée essentiellement par les IgG que les IgM (Bouharoun-Tayoun et al., 1990, Chumpitazi et al., 1996). Ces anticorps agissent en bloquant le processus d’invasion des merozoïtes par opsonisation, facilitant ainsi la phagocytose par les macrophages (Druilhe et Khusmith, 1987 ; Kumaratilake et Ferrante, 2000).

Les paramètres immunologiques

                 Les tests immunologiques in vitro utilisant des cellules mononuclées ont fait l’objet de cette étude. Les réponses immunitaires in vitro ont été mesurées en 7 jours et 4 jours. Les résultats n’étaient exploitables que sur les cultures de 4 jours ; le taux de mortalité des lymphocytes dépassait de plus de 30% sur les cultures de 7 jours. Les conditions des prélèvements, de transfert du terrain vers le laboratoire et l’état sanitaire des sujets (fréquemment exposé à diverses infections) sont des facteurs pouvant influencer l’état des cellules ainsi que leur adaptation aux conditions de culture in vitro. Nous avons observé une corrélation significative des index de stimulations des lymphocytes B et macrophages. Ceci pourrait s’expliquer soit :
– par la sensibilité des sujets en réponse à P. falciparum, c’est à dire les cellules B et les macrophages agissent en parallèle dans le processus de présentation d’antigènes.
– par l’activation des cellules B mémoires. Ces cellules ont la capacité à répondre plus rapidement et plus intensément à un re-exposition par le même antigène. En effet, les études menées à Manarintsoa (Madagascar) après la dernière épidémie des années 80, ont suggéré que la protection contre P. falciparum serait due à une mémoire immunologique (Deloron Chougnet, 1992).
L’analyse a montré une corrélation des index de stimulations entre les lymphocytes TcRαβ et lymphocytes TcRγδ. D’après les études in vitro de Waterfall et ses collaborateurs en 1998, la réponse des cellules CD4+TcRαβ+ est prédominante en présence d’extrait de schizontes. Parallèlement, en présence de schizontes non lysés, les auteurs ont observé une activation supplémentaire des cellules TcRγδ+. Les schizontes non lysées induisent fortement la production d’IL-2. Ce qui suggère que l’activation des TcRγδ nécessite de l’IL-2 (Waterfall et al., 1998). Les TcRαβ stimulées produisent de l’IFN-γ et de l’IL-12, ce dernier stimule l’activation des lymphocytes TcRγδ. (Riley, 1999). Si nos résultats ont indiqué l’existence d’une corrélation positive des index de stimulations CD8+ et CD4+, observés au sein des populations TcRαβ, la littérature a souligné plutôt que les CD8 n’interviennent que pendant le stade pré-érythrocytaire(Hafalla et al., 2006). Sur toute la population lymphocytaire CD4+, une activation préférentielle des sous population Th1 a été observée, les Th1 activées produisent IFN-γ. Ce médiateur est nécessaire dans l’activation des cellules effectrices de la réponse immunitaire dirigée contre les stades sanguins de P. falciparum (Taylor-Robinson, 1998). Par ailleurs, nos résultats semblent mettre en évidence une inhibition de la prolifération des cellules T en présence de P. falciparum (Index de stimulations inférieurs a 1). Ceci pourrait s’expliquer par 3 phénomènes soit :
– l’altération des cellules les rendant inaptes à répondre aux stimuli in vitro.
– par l’apoptose. C’est un phénomène physiologique normal de mort cellulaire pouvant intervenir chez les lymphocytes T après activation. En effet, in vitro, les cellules mononuclées du sang périphérique (PBMC) exposées à des extraits de P. falciparum expriment un taux élevé de CD95, marqueur de l’induction de l’apoptose (Toure et al., 2000).
– par l’anergie. Lorsqu’un lymphocyte T naïf reconnaît un antigène par son TcR, en absence de co-stimulation, ce lymphocyte s’inactive et est en état d’anergie. La cellule est alors incapable de produire l’IL-2 et est réfractaire à toute restimulation par le même antigène. In vitro, ce phénomène d’anergie a été observé surtout chez les sous populations TcRγδ (Vγ9Vδ2) en présence de P. falciparum (Martini et al., 2003).

Table des matières

INTRODUCTION
GENERALITE
I.-Le paludisme
I.1- Phase sexuée ou sporogonie chez l’anophèle
I.2-Phase de multiplication asexuée chez l’homme
I.21- Phase pré-érythrocytaire
I.22- Phase érythrocytaire
II- L’immunité
II.1- Immunité innée
II.2- Immunité adaptative
II.21- Immunité humorale
II.22- Immunité cellulaire
II.221- Reconnaissance d’antigènes et activation des cellules T
II.222- Les marqueurs d’activation des lymphocytes
II.3- Immunité dirigée contre P. falciparum
II.31- Réponse immune contre le stade pré-érythrocytaire
II.32- Réponse immune contre le stade érythrocytaire
III. Les caractéristiques du paludisme à Saharevo
III.1- Le phénotype parasitologique MDPA
III.2- Relation entre MDPA et les familles de Saharevo
MATERIELS ET METHODES
I- Choix de la population étudiée
I.1- Lieu d’étude
I.2- La population étudiée
I.3- Critères d’inclusion et d’exclusion
I.31- Pour la population étudiée
I.32-Pour les prélèvements
I.33- Pour les souches de P. falciparum maintenues en culture
II- Culture in vitro des souches de Plasmodium falciparum
II.1- La souche étudiée
II.2-Principe
II.3- Mise en culture
III- Mise en co-culture de PBMC (Peripheral Blood Mononuclear Cells) et Plasmodium falciparum
III.1- Etapes préliminaires
III.11- Isolement de PBMC par le Ficoll
III.12- Numération cellulaire
III.2- Mise en coculture
III.21- Test de prolifération
III.22- Test de phenotypage
III. 3- Acquisition au cytomètre
III.31- Principe de la CMF
III.32- Lecture
IV- Expression des résultats
V. Analyse des résultats
RESULTATS
I.- Analyse descriptives des variables
I.1- Description des sujets et fratries
I.2- Le paramètre MDPA
I.3- Les paramètres immunologiques
II.- Index de stimulation des différentes sous populations cellulaires
III.- Les paramètres influençant la réponse immunitaire
IV.- Analyse de corrélation entre les index de stimulation
V.- Analyse de l’hétérogénéité entre fratrie et les réponses immunitaires
DISCUSSIONS ET CONCLUSION
1- Les variables immunologiques
2- Le paramètre MDPA
3- La distribution familiale des réponses immunitaires
4- Conclusion

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