LA REPARATION DES CASSURES DOUBLE-BRIN DE L’ADN PAR LE NHEJ

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La trichothiodystrophie

La TTD se caractérise par des cheveux cassants (à cause d’un déficit en acides aminés souffrés), une ichtyose (maladie de peau se caractérisant par une extrême sécheresse et la présence de squames ressemblant à des écailles de poisson), un retard mental, une hypofertilité et un nanisme (pour revue voir Itin et al., 2001). Ce syndrome au spectre clinique très hétérogène regroupe des maladies comme les syndromes de Pollitt, de Tay, de Sabinas, de Marinseco-Sjögren ou le syndrome des cheveux cassants amish.
La majorité des patients TTD sont sensibles aux UV. Cette photosensibilité s’explique par une mutation dans un des trois gènes suivants : XPD, XPB ou p8 (Giglia-Mari et al., 2004). Les produits de ces trois gènes appartiennent au complexe TFIIH, impliqué à la fois dans le NER et dans la transcription.

Le syndrome de Cockayne

Les patients CS présentent une photosensibilité cutanée et leurs cellules sont sensibles à de nombreux agents génotoxiques dont les UV. Le syndrome inclut un retard physique et mental (Nance and Berry, 1992). En effet, les patients présentent un développement squelettique anormal (tête d’oiseau, caries dentaires, ostéoporose…), une forme de nanisme, un défaut de la maturation sexuelle et un développement psychomoteur affecté par une dégénérescence neuronale précoce et progressive. En outre, le CS est associé à une perte de l’audition, un visage parcheminé, des cheveux fins et des atteintes oculaires (rétinopathie pigmentaire, cataracte). Les signes cliniques apparaissent généralement dans les premières années de la vie mais, dans les cas les plus sévères, ils sont déjà présents à la naissance. L’espérance de vie moyenne est de 12,5 ans et les causes principales de mort sont la pneumonie et les infections des voies respiratoires. Il existe deux groupes de complémentation : CS-A et CS-B. Les protéines CSA et CSB sont impliquées dans le TCR, mais également dans la transcription, ce qui peut expliquer qu’on ne retrouve pas tous les symptômes de CS dans des syndromes associés à un défaut de l’ensemble du NER.
En cas de défaut du TCR, le blocage persistant de l’ARN pol II aux sites de dommages pourrait constituer un signal pro-apoptotique. En effet, les cellules murines ou humaines déficientes en TCR présentent un niveau d’apoptose après exposition aux UV plus important que les cellules déficientes en GGR (McKay et al., 2001; van Oosten et al., 2000). Cette particularité est avancée pour expliquer deux caractéristiques de CS : la dégénérescence neuronale et l’absence de cancer. Le niveau élevé du métabolisme oxydatif observé dans les neurones pourrait constituer une source de dommages bloquant la transcription ce qui expliquerait la dégénérescence neuronale observée dans le CS. D’autre part, cette propension des cellules CS à l’apoptose semble compenser l’augmentation de la mutagenèse liée au défaut de TCR, expliquant pourquoi les patients CS, malgré une sensibilité accrue aux UV, ne développent pas de cancers.

Xeroderma pigmentosum

La peau parcheminée (xeroderma) et les défauts de pigmentation (pigmentosum) au niveau des zones exposées au soleil sont les signes principaux de XP. L’exposition au soleil entraîne une dégénérescence progressive de la peau et des yeux avec apparition des premiers symptômes vers l’âge de 2 ans. Contrairement aux patients TTD ou CS, les patients XP présentent un risque accru de développer des cancers de la peau au niveau des zones exposées au soleil (1000 fois supérieur à celui de la population générale). Il s’agit principalement de carcinomes des cellules basales et de carcinomes squameux et, plus rarement, de mélanomes (Daya-Grosjean and Sarasin, 2005). L’âge moyen d’apparition de la première tumeur se situe à 8 ans, soit 50 ans avant la population générale. De plus, 18% des patients XP présentent des défauts neurologiques liés à une dégénérescence neuronale primaire. En plus des cancers de la peau, les patients XP ont un risque augmenté de 10 à 20 fois de développer des cancers internes avant l’âge de 20 ans. L’incidence de cette maladie varie de 1 / 250 000 dans les pays occidentaux à 1 / 40 000 au Japon et en Afrique du nord (pour une revue de cas cliniques voir Kraemer et al., 1987).
Des expériences de fusions cellulaires ont déterminé sept groupes de complémentation (XP-A à XP-G) parmi les patients XP présentant un défaut du NER. Les sept protéines correspondantes (XPA à XPG) sont impliquées dans les différentes étapes du NER décrites ci-dessus. La perte de fonction d’un huitième gène (POLΗ) entraîne un variant de XP (XP-V) qui n’est pas associé à un défaut du NER mais à un défaut de la TLS. Dans les cellules de patients XP-V, d’autres polymérases fautives peuvent se substituer à pol η pour assurer la TLS. Des mécanismes alternatifs de recombinaison ont également été proposés pour prendre en charge le blocage des fourches de réplication aux sites de dommage (Limoli et al., 2005). L’hétérogénéité génétique de XP conduit à une grande hétérogénéité clinique. Un défaut exclusif du GGR (XP-C ou XP-E) ou de la TLS (XP-V) n’est généralement pas associé à une dégénérescence neuronale et les patients XP-C et XP-V présentent des caractéristiques cliniques similaires. La plupart des mutations identifiées dans le gène XPC entraînent une troncature importante de la protéine avec une perte de fonction. Les mutations du gène XPC sont parmi les plus fréquentes chez les patients XP. Les atteintes associées à une mutation du gène XPE sont en général modérées. Les cellules de patients XP-E présentent un niveau de synthèse de réparation correspondant à 50 à 80% de celui de cellules normales. Une mutation dans le gène XPA affecte l’ensemble du NER. Les patients XP-A présentent une sensibilité aux UV plus importante que les patients XP-C. On trouve peu de patients XP-F. Leurs symptômes sont en général modérés. Les mutations plus invalidantes ne seraient pas compatibles avec la vie. De même, l’activité hélicase de la protéine XPB étant indispensable à l’initiation de la transcription, on trouve peu de patients XP-B. Les mutations du gène XPD sont plus nombreuses. Chez les patients XP-D, ces mutations n’affectent que l’activité hélicase de la protéine XPD ou sa stimulation par l’interaction avec la protéine p44 du complexe TFIIH. Cependant, la protéine XPD est également impliquée dans la TTD. Dans ce cas, les mutations observées affectent la transcription in vitro. Une mutation du gène XPB, XPD ou XPG peut être associée à XP, ou une atteinte mixte XP/CS ou XP/TTD. Les mutations du gène XPG sont rares mais leurs conséquences sont sévères, avec généralement une combinaison de symptômes XP et CS.
Le NER constitue donc une voie de réparation prenant en charge une grande variété de lésions de l’ADN. De plus, certains de ses facteurs sont impliqués dans le processus cellulaire majeur qu’est la transcription. Ces caractéristiques permettent de comprendre la complexité et la sévérité des pathologies associées à un défaut d’une des protéines du NER.

La réparation des cassures double-brin de l’ADN par le NHEJ

Les DSB sont particulièrement dangereuses pour la cellule car les deux brins de la double hélice sont affectés. Elles peuvent conduire à la perte d’information génétique ou à des réarrangements chromosomiques entraînant la mort cellulaire ou l’apparition de cancers. La cellule dispose de deux mécanismes principaux de réparation des DSB : la RH et le NHEJ. Le NHEJ, à la différence de la RH, ne nécessite pas la présence d’homologies de séquence pour opérer et peut prendre place dans toutes les phases du cycle cellulaire (Rothkamm et al., 2003). Le NHEJ est également impliqué dans la recombinaison V(D)J, un mécanisme essentiel dans le développement du système immunitaire (pour revue voir Lieber et al., 2004). Au moins quatre étapes sont nécessaires à la réparation d’une DSB par NHEJ : (i) reconnaissance de la cassure ; (ii) alignement des extrémités ; (iii) modification des extrémités pour qu’elles puissent être liguées et (iv) ligature proprement dite. Ce mécanisme met en jeu plusieurs protéines et certaines étapes restent à caractériser (pour revue voir Hefferin and Tomkinson, 2005; Lieber et al., 2003; Weterings and van Gent, 2004). La voie NHEJ est conservée au cours de l’évolution et elle opère également chez les procaryotes (pour revue voir Bowater and Doherty, 2006). Il existe cependant des différences entre bactérie, levure et eucaryotes supérieurs. Nous nous intéresserons principalement aux mécanismes du NHEJ dans les cellules d’eucaryotes supérieurs.

Les cassures double-brin de l’ADN : production, signalisation et réparation

Origine des DSB

Les DSB peuvent être des effets collatéraux du métabolisme cellulaire. Nous avons vu que les ROS peuvent induire une grande variété de lésions de l’ADN dont des DSB. Les DSB peuvent également être formées indirectement, au cours de la réplication d’une SSB non réparée, par la proximité de deux SSB ou au cours d’un processus de réparation. Le nombre de DSB endogènes liées à la réplication dans des cellules normales est estimé à 10 à 50 par cellule et par cycle (Haber, 1999; Vilenchik and Knudson, 2003). Certaines DSB que l’on peut qualifiées de « programmées », constituent des intermédiaires de processus cellulaires normaux. C’est le cas des DSB créées lors de la recombinaison méiotique, de la différentiation des lymphocytes (recombinaison V(D)J) et durant la recombinaison des immunoglobulines (CSR de l’anglais class-switch recombination). L’action des topoisomérases de type II (topoII) entraîne également la formation transitoire de DSB destinées à relaxer la double-hélice d’ADN pour permettre la réplication, la recombinaison, la transcription et la ségrégation des chromosomes. Les DSB programmées ne sont donc pas dangereuses en elles-mêmes mais peuvent le devenir si les processus au cours desquels elles sont formées ne se déroulent pas correctement. Enfin, la cellule dispose d’un système de protection des extrémités de ses chromosomes afin d’empêcher leur prise en charge par les voies de réparation. Cependant, en cas de faille de ce système ou si le raccourcissement des télomères est trop important, les extrémités peuvent être considérées comme des DSB à réparer, ce qui entraîne des fusions délétères pour la cellule.
Différents agents génotoxiques induisent des DSB. Parmi ceux-ci, certains nécessitent un processus cellulaire comme la réplication. Les RI produisent une grande variété de dommages incluant oxydation, SSB et DSB. Les DSB produits par les RI présentent une grande complexité. Elles sont induites directement par dépôt d’énergie ou indirectement par la génération de ROS. Ils existent des agents chimiques mimant les effets des RI tels la bléomycine, la néocarzinostatine (NCS) et la calicheamicine (CAL). La NCS et la CAL appartiennent à la famille des enediynes et induisent des DSB de façon plus spécifique que les RI (Yu et al., 1994). Par exemple, le ratio DSB : SSB est de 1 : 3 pour la CAL contre 1 : 20 pour les RI (Elmroth et al., 2003). Les inhibiteurs des topoisomérases comme l’étoposide (VP16) ou la camptothécine (CPT) bloquent le complexe ADN/topoisomérase et conduisent à la formation d’une DSB lors de la réplication.

Voies activées par les DSB

Les DSB peuvent induire des mécanismes cellulaires allant au-delà des processus de réparation proprement dits. Ces mécanismes mettent en jeu des protéines de détection des dommages (complexe Mre11/Rad50/Nbs1, Ku), des protéines de transduction (kinases ATM, ATR et DNA-PKcs) et des protéines effectrices (protéines de la réparation, du contrôle du cycle cellulaire ou de l’apoptose) (pour revue voir O’Driscoll and Jeggo, 2006; Valerie and Povirk, 2003).
La voie de signalisation principale activée par les RI est celle dépendant de la kinase ATM (ataxia telangiectasa mutated). Cette protéine est mutée dans le syndrome humain d’ataxia telangiectasa (AT). Les cellules AT sont radiosensibles. Le complexe Mre11/Rad50/Nbs1 (complexe MRN) serait responsable de l’activation et/ou du recrutement d’ATM aux sites de DSB (Falck et al., 2005). Les DSB entraînent la phosphorylation de l’histone H2AX, l’histone phosphorylé étant nommé γ-H2AX (Rogakou et al., 1998). Cette phosphorylation, assurée de façon redondante par les kinases ATM et DNA-PKcs (Burma et al., 2001; Stiff et al., 2004), s’étend sur des mégabases autour de la lésion et produit des foyers intranucléaires ponctuels détectable par immunocytochimie. De nombreuses protéines comme TP53BP1 (tumor protein 53 binding protein 1), MDC1 (mediator of DNA damage checkpoint 1), BRCA1 (breast cancer associated protein 1) et le complexe MRN se localisent au niveau des ces foyers (Paull et al., 2000; Stewart et al., 2003; Wang et al., 2002). La kinase ATR (ATM Rad3-related protein) est activée par les régions d’ADN simple-brin de façon dépendant de la protéine ATRIP (ATR interacting protein) et est au cœur de la réponse cellulaire aux UV. Cependant, la kinase ATR est également activée par les DSB de façon dépendant d’ATM, de NBS1 et de l’activité nucléasique de Mre11. Le rôle d’ATR dans la réponse aux RI est limité aux phases S et G2 du cycle cellulaire et est régulé par les cyclines dépendant des kinases (CDK) (Jazayeri et al., 2006). La voie ATR pourrait être impliquée dans la stabilisation des fourches de réplication ou dans l’activation de la RH.
Ces voies de signalisation vont coordonner la réponse cellulaire à l’irradiation qui regroupe les points de contrôle du cycle cellulaire, l’apoptose et la réparation par NHEJ ou RH dans un réseau complexe (Tableau 3 et Figure 3). Des mutations d’une des protéines impliquées dans ces voies sont retrouvées dans certaines pathologies humaines.

Contribution du NHEJ et de la RH au maintien de l’intégrité génétique

Les étapes du NHEJ seront décrites en détail dans les sections II.2 et II.3. La RH est un processus complexe dont la description précise n’entre pas dans le cadre de cette étude (pour une revue détaillée des différents mécanismes de RH voir Helleday, 2003). Brièvement et de façon très simplifiée, elle débute par la résection des extrémités de la cassure, étape assurée par le complexe MRN. La protéine BRCA2 facilite la formation de nucléofilaments de protéine Rad51 sur les extrémités simple-brin ainsi formées et recouvertes par RPA. L’action de Rad51, de ses paralogues et des protéines Rad52 et Rad54 permet l’invasion du brin homologue et la re-synthèse de la région endommagée. La jonction de Holliday ainsi formée est résolue, ce qui achève le processus de réparation (Figure 3) (pour revue voir Hoeijmakers, 2001; Valerie and Povirk, 2003).
La contribution relative de la RH et du NHEJ dans la réparation des DSB chez les eucaryotes supérieurs reste controversée. Cependant, à l’heure actuelle, il est admis que le NHEJ y est le mécanisme prépondérant. Plusieurs hypothèses ont été avancées sur les relations entre NHEJ et RH dans les cellules de mammifères : (i) voies distinctes (Ristic et al., 2003) ; (ii) compétition et/ou compensation (Allen et al., 2003; Allen et al., 2002) ; (iii) collaboration pour la réparation de certaines DSB ou la conservation de l’intégrité génétique dans l’animal (Couedel et al., 2004; Richardson and Jasin, 2000). Récemment, l’analyse du recrutement des protéines de réparation des DSB aux sites de dommages induits par un laser dans des cellules humaines a montré un comportement différentiel du NHEJ et de la RH (Kim et al., 2005). Les protéines du NHEJ sont recrutées précocement et de façon transitoire alors que celles de la RH apparaissent plus tardivement et persistent aux sites de lésions non réparées. Le NHEJ pourrait donc être un mécanisme de réparation immédiat, la RH prenant en charge les cassures résiduelles. Ceci est similaire à des résultats précédemment obtenus chez la levure (Frank- Vaillant and Marcand, 2002). De plus, le NHEJ étant opérationnel dans toutes les phases du cycle cellulaire et la RH étant tributaire de la disponibilité d’une séquence homologue (Rothkamm et al., 2003), la phase du cycle cellulaire influence le choix de la voie de réparation. Chez la levure, la cycline dépendante des kinases CDK1 contrôlerait la résection des extrémités nécessaires à la RH. En phase G1, en l’absence d’activité de CDK1, le NHEJ serait favorisé alors que la RH serait préférée en phase S (Scully and Xie, 2005). La prédominance du NHEJ chez les eucaryotes supérieurs peut s’expliquer par le fait que leur génome présente de nombreuses séquences répétées (correspondant à 40% du génome chez l’homme). Le recours au NHEJ pourrait permettre de limiter les risques de recombinaison au niveau de ces séquences (Lieber et al., 2003). Comme seul un faible pourcentage du génome code effectivement des protéines, le recours à une voie encline à l’erreur mais rapide comme le NHEJ serait moins dommageable que l’entrée en phase S ou en mitose en présence de cassures non réparées.

Les protéines impliquées dans le NHEJ

Le corps du complexe de réparation NHEJ, comprenant les protéines Ku70, Ku80, DNA-PKcs, Artemis, XRCC4 et Ligase IV est relativement bien connu. Cependant, en 2006, deux équipes indépendantes ont mis en évidence un nouveau facteur nommé XLF-Cernunnos (Ahnesorg et al., 2006; Buck et al., 2006). D’autres protéines sont soupçonnées de participer au NHEJ, sans que leurs rôles ne soient encore parfaitement déterminés.

La protéine kinase dépendant de l’ADN

La protéine kinase dépendant de l’ADN (DNA-PK de l’anglais DNA-dependent protein kinase) est une enzyme formée de deux sous-unités dont les protéines appartiennent au groupe XRCC (X-ray cross complementing) (pour revue voir Burma and Chen, 2004; Collis et al., 2005; Meek et al., 2004) :
– La sous-unité catalytique est une kinase à sérine/thréonine de 469 kDa nommée DNA-PKcs (XRCC7). Elle appartient à la famille des kinases apparentées à la kinase du phosphatidylinositol (famille PIKK), comme les protéines ATM, ATR, mTOR et TTRAP.
Toutes ces protéines sont impliquées dans la réponse cellulaire aux dommages de l’ADN ou au stress. Ces kinases sont, en outre, sensibles à la wortmannine. Le motif consensus de la DNA-PKcs est une sérine ou une thréonine suivie d’une glutamine (motif S/T-Q).
Cependant, elle est capable de phosphoryler in vitro une sérine ou une thréonine suivie d’un acide aminé hydrophobe comme la tyrosine, la leucine ou l’alanine.
– La sous-unité régulatrice, Ku, est constituée des protéines Ku70 et Ku80 (XRCC6 et XRCC5), protéines de 73 et 86 kDa respectivement. Ku présente une forte affinité pour les extrémités d’ADN double-brin. La structure de l’hétérodimère permet l’encerclement de la double hélice d’ADN. La protéine Ku70 est induite après RI de façon dépendant de p53 et de ATM (Brown et al., 2000). L’inositol hexakisphosphate (IP6) en s’associant à Ku en modifie la conformation (Hanakahi and West, 2002) et stimule le NHEJ dans des extraits de cellules de mammifères (Hanakahi et al., 2000).

Table des matières

INTRODUCTION
STRESS GENOTOXIQUE ET REPARATION DE L’ADN
I. LA REPARATION PAR EXCISION DE NUCLEOTIDES
I.1. Les dommages de l’ADN pris en charge par le NER
A) Dommages causés par les UV
B) Adduits formés par des molécules électrophiles
C) Diversité des lésions prises en charge par le NER
I.2. Facteurs et étapes du NER
A) Reconnaissance des dommages et initiation du NER
B) Formation du complexe de pré-incision
C) Incision du fragment endommagé
D) Etape de re-synthèse et ligation
I.3. Cinétique de réparation des dommages pris en charge par le NER
A) Réponse bi-phasique
B) Type de dommage
C) Localisation dans le génome
I.4. Réplication trans-lésionnelle
I.5. Pathologies associées à un défaut du NER
A) La trichothiodystrophie
B) Le syndrome de Cockayne
C) Xeroderma pigmentosum
II. LA REPARATION DES CASSURES DOUBLE-BRIN DE L’ADN PAR LE NHEJ
II.1. Les cassures double-brin de l’ADN : production, signalisation et réparation
A) Origine des DSB
B) Voies activées par les DSB
C) Contribution du NHEJ et de la RH au maintien de l’intégrité génétique
II.2. Les protéines impliquées dans le NHEJ
A) La protéine kinase dépendant de l’ADN
B) Artemis
C) Le complexe XRCC4/Ligase IV
D) XLF-Cernunnos
E) Autres activités impliquées dans le NHEJ
II.3. Modèle(s) du NHEJ
A) NHEJ dépendant de DNA-PK
B) Voies alternatives du NHEJ
II.4. Pathologies humaines associées à un défaut du NHEJ
A) SCID et RS-SCID
B) Mutations hypomorphiques de LigIV
C) Mutations de XLF-CERNUNNOS
III. LA PROTEINE KIN17
III.1. Conservation des protéines kin17 au cours de l’évolution
III.2. Régulation de l’expression de la protéine kin17
III.3. Domaines fonctionnels de la protéine kin17
III.4. Interaction de la protéine kin17 avec les acides nucléiques
A) Interaction de la protéine kin17 avec l’ADN, implication dans le métabolisme de l’A
B) Interaction de la protéine kin17 avec l’ARN, implication éventuelle dans la transcript
III.5. Implication de la protéine kin17 dans la réponse au stress génotoxique
A) La protéine kin17 dans la réponse cellulaire aux UVC
B) La protéine kin17 et la réponse cellulaire aux radiations ionisantes
RESULTATS
ARTICLE I
ARTICLE II
ARTICLE III
ARTICLE IV
L’interférence ARN à long terme
1. L’interférence ARN comme outil biologique
2. Mécanismes moléculaires de l’interférence ARN
A) Le complexe RISC
B) miRNA et siRNA
C) Mode d’action des siRNA et des miRNA
3. Introduction d’ARN double-brin dans des cellules de mammifères à des expérimentales
4. Structures shRNA et vecteurs d’expression
5. Design des séquences shRNA
Article IV
ARTICLE V
Principes de l’analyse du NHEJ in vitro
1. Caractéristiques des tests de NHEJ in vitro
A) Intérêts des tests in vitro par rapport aux tests in vivo
B) Difficultés inhérentes aux méthodes in vitro
2. Mécanismes du NHEJ in vitro
A) Produits obtenus après la réparation de coupures enzymatiques
B) Une définition de la fidélité du NHEJ in vitro
3. Protocole utilisé dans le cadre de cette thèse
A) Obtention d’extraits totaux actifs pour le NHEJ
B) Substrats
C) Réaction de réparation et analyse des produits
Résultats préliminaires
Article V Résultats additionnels
CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES
LA PROTEINE KIN17, LA REPLICATION ET LA REPONSE AUX DOMMAGES DE L’ADN
1. La protéine kin17 et la réplication de l’ADN
A) Niveau d’expression de la protéine kin17 et prolifération
B) Rôle(s) de la protéine kin17 dans la réplication de l’ADN ?
2. La protéine kin17 dans la réponse aux atteintes génotoxiques
A) Association de la protéine kin17 avec la chromatine et dommages de l’ADN
B) Réponse de la protéine HSAkin17 à différents agents génotoxiques
C) Implication de la protéine HSAkin17 dans la radiosensibilité
D) Un rôle de la protéine HSAkin17 dans la réponse aux DSB ?
UN MODELE SYNGENIQUE DE CELLULES HUMAINES POUR L’ETUDE DES MECANISMES REPARATION DE L’ADN : LES EXEMPLES DU NER ET DU NHEJ
1. Validation du système de vecteurs pEBV-siRNA
2. Qu’apprend-on des cellules HeLa déficientes en NHEJ ?
A) Phosphorylation de la protéine XRCC4 après induction de DSB
B) Les protéines DNA-PKcs et XRCC4 sont impliquées dans la réparation des DSB induit par l’étoposide
C) Radiosensibilité des cellules DNA-PKcsKD et XRCC4KD et NHEJ in vitro
3. Un modèle pour l’étude des relations entre mécanismes de réparation : l’exemple la protéine XPC
MATERIEL ET METHODES
1. Test de NHEJ in vitro
2. EMSA
3. Mesure de l’activité kinase de DNA-PKcs
REFERENCES
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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