La réductase de l’oxyde nitreux (N 2OR): une métalloenzyme à cuivre

Etat de l’art sur l’activation de N2O

Il existe divers systèmes catalytiques, décrits dans la littérature, qui permettent la décomposition de N2O. Ils peuvent être classés en deux catégories, selon qu’ils fonctionnent en milieux hétérogène ou homogène.

Milieu hétérogène

Dans l’industrie, le développement de catalyseurs hétérogènes pour réduire la quantité de N2O au niveau des sorties d’usine, en particulier pour celles de production d’acide adipique et d’acide nitrique, a suscité beaucoup d’intérêt.
Plusieurs catalyseurs ont été décrits comme actifs vis-àvis de la décomposition de N2O. On peut les répartir en trois groupes : (i) Cu (Co, Fe) / zéolites (ZMS-5 et béta), (ii) oxydes mixtes, (iii) métaux nobles ou métaux nobles supportés (Rh ou Pt sur Al2O3, ZSM-5, TiO2, ZrO2) (Figure 3). Les systèmes à base de métaux nobles sont efficaces même à basse température et avec des mélanges gazeux peu concentrés en N2O, mais s’oxydent facilement en présence de dioxygène et à plus haute température.

Coupure de la liaison N-O

Comme mentionné précédemment, l’adduit IMes-N2O est stable à température ambiante.
Cependant, à plus hautes températures (supérieures à 60 °C), il se décompose en urée correspondante (Schéma 6). Cette décomposition suit une cinétique de premier ordre et ne dépend pas de la concentration en adduit. Dans des solvants protiques, comme l’eau ou le méthanol l’adduitest cependant moins sensible à la température.

Voie C

En présence de complexes de métaux de transition, l’oxyde nitreux peut opérer en tant que donneur d’atome d’oxygène. Ce type de réaction a été abondamment étudié par Bottomley and coll.
Ils ont ainsi utilisé N2O comme unique oxydant pour la synthèse de complexes bimétalliques pontés par un ligand oxo (Tableau 2, entrée 1) ou pour celle d’oxydes organométalliques (Tableau 2, entrées 2 et 3). Ici, le terme d’oxydes organométalliques regroupe les assemblages possédant au moins trois atomes métalliques, un atome d’oxygènepontant venant de N 2O et une liaison carbone-métal (ligand cyclopentadiényle). L’ensemble deleurs travaux repose sur l’utilisation de complexes de titane, de chrome ou de vanadium possédant des ligands dérivés du cyclopentadiényle. Parkin and coll. se sont également intéressés à ce genre de composé (Tableau 2, entrée 4).
Les différents résultats obtenus pour des complexes de types Cp 2M (M = Ti, Cr, V ou Zr) mis en présence de N2O sont rassemblés dans le Tableau 2.

La réductase de l’oxyde nitreux (N2OR) : une métalloenzyme à cuivre

En parallèle, la Nature a développé au cours de son évolution un système capable de réduire N 2O de façon très efficace (48-72 µmol.min -1 .mg -1 ) à travers l’utilisation d’un site actif unique, le centre CuZ de la réductase de l’oxyde nitreux (N 2OR), une métalloenzyme à cuivre.

Les métalloenzymes à cuivre

Les métalloenzymes à cuivre sont impliquées dans différents processus biologiques, aussi divers que le transfert d’électrons, la catalyse d’oxydation (oxydation de phénol, hydroxylation de glycine appartenant à une chaîne protéique, oxydation de l’ascorbate) et le transport du dioxygène. Les protéines utilisant le cuivre comme cofacteur sont divisées en différents groupes (Tableau 8), basés sur la nature de la première sphère de coordination etla symétrie du / des centre(s) métallique(s) .
Au sein d’un même groupe, les sites actifs présentent des caractéristiques spectrales (UV-vis, RPE) etélectrochimiques très similaires. Le cuivre en biologie est principalement coordiné par les chaineslatérales des acides aminés histidines, cystéines et méthionines, en accord avec les principes de lathéorie HSAB (Hard and Soft Acid Base).
Le type I est probablement le plus étudié et caractérisé. La plupart des membres de ce groupe sont des protéines impliquées dans des processus de transferts d’électrons. Ce type de centre ne présente qu’un seul et unique atome de cuivre coordiné par deux atomes d’azote provenant d’histidines et un atome de soufre provenant d’une cystéine. Toutes ces protéines ont un potentiel de réduction supérieur à 0,25 V vs ENH, une forte bande d’absorption associée à un transfert de charge du ligand (cystéine) vers le métal autour de 600 nm et un faible couplage hyperfin dans la région parallèle du spectre RPE. Ce groupe possède trois sous-familles qui se différencient par la nature et le nombre des ligands axiaux.
Les centres de types II sont souvent rencontrés dans des oxydo-réductases. Le centre métallique est alors principalement coordiné par des histidines, bien que des ligands oxygénés puissent être présents. Ils ne possèdent pas d’absorption particulière en UV-vis, mais présentent généralement en RPE un couplage hyperfin caractéristique d’un ion Cu II.
Les centres de types IIIsont quant à eux des centres binucléaires, au sein desquels chacun des ions cuivre se trouve coordiné par trois histidines. Ce type de centre peut être retrouvé dans certaines oxydases telles que la catéchol oxydase ou la tyrosinase, mais peut être également impliqué dans le transport du dioxygène chez les arthropodes (hémocyanine). Dans l’état oxydé, les deux ions cuivre sont couplés antiférromagnétiquement. Il en résulte un spectre silencieux en RPE.

En UV-vis, en revanche, le transfert de charge de type O22-→ Cu

II est observé à environ 345 nm et 580 nm.
D’autres systèmes qui n’appartiennent à aucune des trois classes citées précédemment ont également été caractérisés. Parmi les enzymes possédant un centre polynucléaire se trouve une famille d’oxydase, les laccases qui réalisent l’oxydation de dérivés phénoliques, couplée à la réduction à quatre électrons du dioxygène, générant ainsi deux molécules d’eau.
Les quatre atomes de cuivre de ces enzymes sont arrangés en deux sites, un site mononucléaire de type I et un site trinucléaire pouvant être lui-même de type I (ou bleu), II (ou « normal ») ou III (ou binucléaire couplé). Le site mononucléaire de type I accepte les électrons du substrat et les transfère au site trinucléaire. Une fois ce centre totalement réduit, il peut réaliser la réduction du dioxygène en eau.
Les caractéristiques spectroscopiques de ce centre, à l’état oxydé, sont la somme des caractéristiques de chaque cuivre.
Enfin, un site actif unique en biologie a récemment été cristallisé au sein d’une protéine, la réductase de l’oxyde nitreux (N2OR).
Lui non plus, ne peut être classé dans les sous-familles précédentes. Il s’agit en effet d’un centre tétranucléaire de cuivre au sein duquel les ions métalliques sont pontés par un atome de soufre élémentaire. Il est nommé centre CuZ.
La première purification de la N 2OR issue de Alcaligenes faecalis a eu lieu en 1972, sans caractérisation de sa fonction ni de son activité enzymatique.
Dix ans plus tard, une autre protéine possédant les mêmes caractéristiques spectrales a été isolée de Ps. stutzeri et son activité enzymatique a pu être établie.
La réductase de l’oxyde nitreux est ainsi l’enzyme finale du cycle de dénitrification bactérien qui permet la conversion des ions nitrates en diazote (Figure 6). Depuis, plusieurs structures cristallographiques ont été obtenues à partir de différentes classes de protéobactéries capables d’effectuer toute la voie de dénitrification.

Mécanisme proposé de réduction de N2O

Sur la base d’études cinétiques et spectroscopiques de la réaction de N2O avec le centre CuZ* menées in vitro, qui ont permis d’identifier les formes redox actives pour ce centre et qui ont donné des informations sur le nombre d’étapes, une proposition de mécanisme pour la réaction de N2O avec le site CuZ* a été émise.
Aucun mécanisme n’est encore proposé, à ce jour, pour l’état redox CuZ car la forme redox active est encore méconnue. Le mécanisme pour le centre CuZ* est présenté

Développement de l’approche bio-inspirée pour le centre CuZ

L’approche bio-inspirée de la réactivité du centre CuZ de la réductase de l’oxyde nitreux suivie par l’équipe de Tolman est exemplaire.
Afin de mimer l’activité de ce centre CuZ [(His)7 Cu 4S] et d’apporter des preuves supplémentaires au mécanisme proposé pour cette enzyme, l’équipe a synthétisé des complexes polynucléaires de cuivre possédant des atomes de soufre et d’azote coordinants. Aucun complexe de cuivre à l’état réduit n’était alors décrit dans lalittérature pour sa réactivité avec N2O. En utilisant un complexe de cuivre valence mixte trinucléaire ponté par une molécule de disulfure inorganique (Schéma 20), une activité N2 OR non catalytique et à basse température a été mise en évidence. Le complexe [LCu(CH3 CN)]SbF 6 (L = 1,4,7-triméthyltriazacyclononane) mis en présence de Na2 S 2 à -20°C permet d’obtenir une entité trinucléaire {[L3 Cu 3 S 2]} 2+ valence mixte active possédant un cœur [Cu 3 S 2] 2+.

Effet de la nature des ligands exogènes du cuivre sur les propriétés spectroscopiques et la réactivité vis-à-vis de N2O

L’étude menée sur le complexe [Cu2 (L Me MAM S )(H2O)(OTf)](OTf) dans le chapitre II et la comparaison avec [1] ont montré l’importance de la présence de position(s) échangeable(s) aux centres métalliques pour obtenir une réactivité vis-à-vis de N2O. Il nous a donc paru judicieux d’étudier les conséquences sur la réactivité envers N 2O des positions échangeables d’une espèce valence mixte. En conséquence, un nouveau complexe possédant cette fois-ci un ligand acétonitrile coordiné à chaque centre métallique a été isolé et caractérisé. Cette nouvelle espèce, [Cu2 (L Me MAM S)(CH3CN)2 ](BF4)2a été préparée dans CH 3CN. Sa caractérisation a par conséquent été effectuée dans ce solvant mais également dans l’acétone. Ce dernier étant le solvant utilisé pour évaluer la réactivité de [Cu2 (L Me MAM S )(H2O)(OTf)](OTf)dans le chapitre II, il nous a paru nécessaire de nous assurer du maintien de la structure de [Cu2 (L Me MAM S )(CH3CN) 2 ](BF4)2 dans ces conditions.
L’utilisation d’un même solvant d’étude nous permettra ainsi une comparaison des activités de réduction observées.

Synthèse du complexe de cuivre sans contre-ion coordinant

La synthèse du complexe [Cu2 (L Me MAM S )(CH3CN) 2 ](BF4)2 est effectuée en boite à gant, enajoutant à une solution de ligand L Me MAM S-S (page 68) dans l’acétonitrile une solution de [Cu(CH3CN)] 4(BF 4) dans l’acétonitrile. La solution prend instantanément une coloration bleue nuit. Après 30 minutes d’agitation, le complexe est précipité à l’éther diéthylique et obtenu sous forme d’une poudre noire avec unrendement de 60 %.
Comme pour [Cu2 (L Me MAM S )(H2O)(OTf)](OTf), une fois isolé, ce complexe a été caractérisé avec la plupart des techniques disponibles au laboratoire. Ses propriétés spectroscopiques et sa réactivité ont été comparées à celles du complexe [Cu2 (L MeMAM S)(H2O)(OTf)](OTf).

Conclusions et perspectives

Ces travaux de thèse s’inscrivent dans le cadre de la réduction de N2O par des complexes de métaux de transition. L’intérêt porté à ce gaz est lié à son implication dans de nombreux phénomènes environnementaux néfastes. Plus précisément, l’objectif de ce travail de thèse était la synthèse et l’étude de la réduction de N 2O par de nouveaux complexes dinucléaires de cuivre, modèles bio-inspirés du site actif CuZ de la N2OR. La préparation de modèles structuraux a elle aussi été envisagée.
Inspiré des travaux réalisés précédemment au laboratoire sur un complexe possédant une sphère de coordination « fermée », un premier complexe présentant des positions labiles pouvant permettre de le rendre actif vis-à-vis de la réduction de N 2O a été isolé. Une étude approfondie de la nature des ligands exogènes en solution nous a permis de mettre en évidence le maintien de la structure cristalline dans l’acétone, à savoir la coordination d’une molécule d’eau et d’un contre-ion triflate. Cette relative stabilité en solution est très certainement liée à la présence d’une liaison hydrogène entre ces deux ligands exogènes. Le complexe [Cu2 (L Me MAM S)(H2O)(OTf)](OTf) s’avère être réactif vis-à-vis de N 2O mais de façon non catalytique. L’hypothèse de travail selon laquelle des positions « facilement » échangeables aux centres métalliques sont requises pour la réactivité est donc validée. Nous avons pu mettre en évidence que la réactivité de ce complexe est directement liée à la présence d’une molécule d’eau dans la sphère de coordination de l’un des centres à cuivre, cette dernière étant alors déplacée par N 2O. Des calculs théoriques, réalisés par le Docteur Maylis Orio, nous ont permis de proposer un adduit Cu-N2O pertinent, intermédiaire clef de la réduction. Ce complexe constitue ainsi le premier système moléculaire bio-inspiré de ce type, décrit dans la littérature, capable de réduire N2O à température ambiante, pression atmosphérique et dans des temps relativement courts.
Par la suite, l’influence de différents ligands exogènes sur la réactivité a été évaluée. En utilisant un mode de préparation adapté, un second complexe dinucléaire à valence mixte possédant cette fois-ci une molécule d’acétonitrile sur chaque ion cuivre a été isolé et cristallisé. Contre toute attente, le comportement en solution de cette espèce [Cu2 (L Me MAM S )(CH3CN) 2 ](BF4)2 s’est montré difficile à étudier. Des caractéristiques spectroscopiques différentes sont observées en fonction du solvant d’étude (acétonitrile ou acétone). Il s’est finalement révélé délicat d’identifier avec certitude les espèces présentes en solution. Il ressort néanmoins que des changements notables dans les sphères de coordination des métaux ont lieu en fonction du solvant. L’analyse des propriétés de délocalisation de ces espèces, associée à ce changement de sphère de coordination s’est avérée non triviale. En particulier, la spectrophotométrie UV-vis-proche infrarouge qui est couramment utilisée pour la caractérisation de complexes inorganiques s’est révélée peu concluante, des spectres ayant des allures identiques pouvant correspondre à des transitions de natures différentes. Il a cependant été possible de confirmer la présence, dans l’acétone, d’une et unique molécule d’eau coordinée à l’un des ions cuivre. Cette nouvelle espèce, et seulement celle-ci, est réactive vis-à-vis de la réduction de N 2O. La réactivité huit fois supérieure de ce complexe comparée à celle du dérivé isolé dans le chapitre II peut s’expliquer par l’absence de liaison hydrogène dans ce cas, qui favoriserait en quelque sorte l’échange de la molécule d’eau avec le substrat. Aucune réactivité n’est observée dans l’acétonitrile, et ce probablement à cause d’une compétition entre l’acétonitrile et N2O pour la coordination.

Table des matières
Abréviations et symboles
Introduction générale 
Introduction bibliographique 
I. L’oxyde nitreux, un gaz inerte impliqué dans de nombreux processus 
A. Un rôle environnemental majeur
B. Quelques propriétés de l’oxyde nitreux
II. Etat de l’art sur l’activation de N 2O
A. Milieu hétérogène
B. Milieu homogène
1. Cas des paires frustrées de Lewis
2. Cas des carbènes N-hétérocycliques
a. Coupure de la liaison N-O
b. Coupure de la liaison N-N
3. Cas des paires frustrées de Lewis incluant un carbène N-hétérocyclique
4. Complexes de métaux de transition et lanthanides
a. Voie A – Formation de complexes stables incorporant N 2 O comme ligand
b. Voie B – Coupure de la liaison N-N
c. Coupure de la liaison N-O
i. Voie C
ii. Voie D
III. La réductase de l’oxyde nitreux (N 2OR): une métalloenzyme à cuivre
A. Les métalloenzymes à cuivre
B. Propriétés de la réductase de l’oxydenitreux
1. Le centre CuA
2. Le centre CuZ
a. Le centre CuZ – [2Cu 2+ –2Cu + ]
b. Le centre CuZ* – [1Cu 2+ –3Cu + ]
3. Mécanisme proposé de réduction de N 2O
IV. Complexes bio-inspirés de l’activité N2O réductase
A. Développement de l’approche bio-inspirée pour le centre CuZ
B. Approche choisie au laboratoire
V. Références bibliographiques
Synthèse, caractérisation, spéciation en solution et réactivité d’un complexe dinucléaire de cuivre bio-inspiré de la réductase de l’oxyde nitreux (N2OR)
I. Synthèse du ligand L Me MAM S-S et du complexe de cuivre correspondant
II. Caractérisation du complexe 
A. Structure cristallographique et études théoriques
B. Etude en solution
1. Spectrophotométrie UV-visible et proche infrarouge
2. RPE
3. Electrochimie
C. Mise en évidence de la nature des ligands exogènes
1. Résonance magnétique nucléaire du 19 F
2. Titrage acide-base
a. UV-visible
b. RPE
D. Mise en évidence de la labilité des ligands exogènes
1. Electrochimie
2. UV-visible, RPE
E. Etude théorique de la stabilité relative de tous les différents systèmes
III. Réactivité vis-à-vis de la réduction de N2O
A. Evaluation de la réactivité
B. Etude mécanistique
C. Calcul du mode fixation de N2O
D. Cinétique
IV. Conclusion
V. Références bibliographiques
Effet de la nature des ligands exogènes du cuivre sur les propriétés spectroscopiques et la réactivité vis-à-vis de N2O
I. Synthèse du complexe de cuivre sans contre-ion coordinant
II. Caractérisation du complexe 
A. Structure cristallographique et études théoriques
B. Etude en solution
1. Spectrométrie de masse
2. RPE
3. UV-visible
a. Effet du solvant d’étude
b. Titrage
c. Discussion
i. Cas de l’acétone
ii. Cas de l’acétonitrile
4. Propriétés électroniques des complexes à valence mixte
a. Classe I
b. Classe II
c. Classe III
d- Détermination expérimentale du paramètre de couplage électronique VAB dans les systèmes de classe II ou III
5. Electrochimie
III. Réduction de N2O
IV. Conclusion
V. Références bibliographiques 
Etude de la stabilité de liaisons disulfures en présence d’un sel cuivrique
I. Cas du ligand disulfure L Me PipeS-S
A. Synthèse
B. Structure cristallographique
C. Propriétés spectroscopiques
D. Etude mécanistique
II. Cas du ligand L Me MAM S-S
III. Cas du ligand L Me BPA S-S
A. Synthèse
B. Description et caractérisation des complexes
1. Complexe [Cu4 (L Me BPA S-S)](OTf)8
a. Structure cristallographique
b. Propriétés spectroscopiques
2. Caractérisation des complexes de type [Cu2 (L Me BPA SO2 )] 3+ (1), (2) et (3)
a. Structures cristallographiques
b. Propriétés spectroscopiques des complexes sulfinato
3. Caractérisation du complexe [Cu2 (L Me BPA SO3 )] 3+
C. Etude mécanistique
1. En milieu anhydre et anaérobie
2. En présence d’eau en milieu anaérobie
3. En condition aérobie et anhydre
4. En présence d’eau en milieu aérobie
D. Discussion
IV. Conclusion
V. Références bibliographiques 
Conclusions et perspectives
Partie expérimentale
I. Généralités 
A. Chromatographie
1. Analytique
2. Séparative
B. Spectrophotométrie UV-visible et proche infrarouge
C. RPE
D. RMN
E. Spectrométrie de masse
F. Diffraction des RX
G. Electrochimie
H. Analyses élémentaires
I. Expérience type de réduction de N2O
J. Expériences de GC-MS
K. Mesures de cinétique
L. Calculs théoriques
II. Synthèse des ligands et complexes 
III. Références bibliographiques 
Annexe : données cristallographiques 
Publication

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