La recherche des activités enzymatiques

ISOENZYMES

Afin de mieux comprendre la diversité génétique chez Ascochyta rabiei, il nous a paru nécessaire de prospecter d’autres outils de caractérisation que l’étude morphologique. A cet effet, nous avons choisi d’étudier le polymorphisme isoenzymatique des protéines mycéliennes solubles.

Cette approche a été exploitée pour l’étude de la diversité génétique d’Ascochyta rabiei par El Biari. Les enzymes, codées par des allèles ou locus différents, possèdent fréquemment des mobilités électrophorétiques variables.
Ceci est dû à des variations dans le contenu en acides aminés des molécules, qui est dépendent de la séquence nucléotidique de l’ADN Les profils d’électrophorèse peuvent ainsi être utilisés pour comparer les individus. Les données des études enzymatiques sont souvent analysées simplement par la technique de comptage des bandes.

Une interprétation génétique de ces mêmes données peut fournir des informations complémentaires sur la génétique et la taxonomie d’un groupe d’organismes. Douze systèmes enzymatiques ont tout d’abord été sélectionnés par la technique du système PAGE pour déterminer ceux qui donnent une bonne révélation et résolution et qui permettent de mettre en évidence du polymorphisme entre les isolats. Les systèmes retenus ont ensuite été utilisés pour la caractérisation génétique de tous les isolats de la collection.

ESTERASES

Des bandes de couleurs différentes apparaissent sur les gels, les isoenzymes réagissant avec la beta naphtyl acétate produisent une bande rouge, ceux réagissant avec l’alpha naphtyl acétate produisent une bande violette.
L’observation du zymogramme des estérases est réalisée après révélation de l’enzyme par le substrat α-naphtyl acétate (Figure 13). Quatre bandes ont été révélées. Elles montrent des mobilités relatives comprises entre 0.4 et 0.68, les différents isolats peuvent être détectés par le nombre et la position des bandes qui les identifient. La révélation de l’estérase chez tous les isolats d’Ascochyta rabiei a nettement donné 4 bandes se répartissant en 3 zones. Les 3 bandes constituant « ce groupe 2 » se déplacent de façon concomitante d’un individu à l’autre, ce qui laisse supposer qu’elles sont déterminées par un même locus.

Dans ce cas, les 4 bandes trouvées chez chacun des isolats peuvent s’expliquer par des phénomènes post transcriptionnels intervenant, soit séquentiellement dans le temps, soit dans différents régions d’isolement.
L’hétérogénéité de zymogramme des estérases donne une assez bonne représentation de la complexité génétique de l’espèce.

PHOSPHATASE ACIDE

L’analyse de zymogramme révèle des migrations anodiques et cathodiques pour un total de trois sites actifs (Figure 15) se situent entre 0,16 et 0,73.
Toutefois, ici encore, les fréquences de bandes restent simultanées de plusieurs fractions caractérisées par des migrations très voisines et non séparables dans le système utilisé. Aucun polymorphisme n’a été observé pour la phosphatase acide pour la population considérée. Les fréquences de bandes restent simultanées de plusieurs fractions caractérisées par des migrations très voisines et non séparables dans le système utilisé.

Les résultats de cette révélation sont illustrés par un dendrogramme (Figure 16), qui est composé de quatre groupes (A, B, C et D) de similairité (87%). La branche A regroupe des isolats (A11, A17, A19, A21, A24, A25, A29, A30 et A41), la branche B (A2, A3, A6, A14, A18, A20, A31, A33, A36, A37, A39), la branche C renferme les isolats suivants (A1, A8, A9, A10, A12, A13, A16, A32, A38, A42) par contre la branche D referme deux isolats (A4 et A34).

SUPEROXIDE DISMUTASE

Dans la superoxyde dismutase, trois bandes électrophorétique de l’activité a été détecté dans la région supérieur du gel juste après le gel de concentration leurs fréquences est entre 0,16 et 0,33 et une bande est situé en partie inférieur du gel de séparation avant le front de migration en position 0,98 (Figure 17).
Les résultats de cette révélation sont illustrés par un dendrogramme (Figure 18), qui est composé de cinq groupes (A, B, C, D et E) de similairité (60%).
 La branche A regroupe des isolats (A1, A9, A10, A11, A12, A13, A16, A17, A21, A24, A25, A29, A30, A32 et A34)
 La branche B (A2, A3, A6, A14, A18, A37, A41),
 La branche C renferme les isolats suivants (A4 et A31) par contre
 La branche D referme uniquement l’isolat (A19).
 La branche D referme deux isolats (A20 et A33).

PEROXYDASE

Le profil électrophorétique de ce système montre une seul zone d’activité avec la dianisidine. Tous les isolats possèdent l’isoenzyme (0,14) en commun, ce système n’a révélé aucun polymorphisme isoenzymatique (Figure 19).

LEUCINE AMINOPEPTIDASE

Comparativement aux zymogrammes des systèmes précités, le profil électrophorétique des LAP se caractérise par la révélation deux bandes au moyen du substrat L-leucine-ß-naphtylamide. Deux bandes de migration différentes sont détectées : l’une correspond à l’isoenzyme 1 (0,42) et l’autre correspond à l’isoenzyme 2 (0,52) Quoi qu’il en soit, l’étude du dendrogramme de la figure 5 met en ةévidence l’individualisation de trois groupes assez bien structurés. Ce faible nombre d’isozymes par isolat (Figure 20) apparaît d’ailleurs surprenant si l’on compare ce résultat à celui d’une analyse similaire menée sur les Colletotrichum des graminées qui avait révélé l’existence, en moyenne, de quatre isozymes LAP par souche, dont une était commune aux deux espèces Colletotrichum falcatum et C. graminicola (Huguenin et al.,1978).

INTERPRETATION ET ANALYSE DES DONNEES

La combinaison des données des différents profils des isonezymes obtenus avec 5 systèmes isoenzymatique a permis d’effectuer une classification des isolats présentée sous forme dendrogramme.
Ce dendrogramme construit à partir de la matrice de similairité de l’indice de Jaccard est représenté sur la figure 22. Il fait apparaitre 4 principales branches (A, B, C et D) séparées à un taux de similairité 0,49.
La branche A formé une grappe constitue de 12 isolats (31,25% des isolats), les isolats de cette branche se séparent en 4 rameaux A1, A2, A3, A4 et A5 à un taux de similairité 0,69.
La branche B rassemble 10 isolats, elle comprend que les isolats qui proviennent de deux régions de Sidi Bel Abbès et Témouchent, par contre la branche C regroupe 09 isolats d’origine de Mascara, Bel Abbès et Témouchent.

La branche D renferme uniquement l’isolat A19 qui provient de Sidi Bel Abbès. Skovgaard et Rosendahl, 1998) ont comparé des isolats de Fusarium oxysporum provenant de différents habitat sont été comparés par rapport à isoenzymes int ra-et extracellulaires.Cinq enzymes intracellulaires: estérases, superoxyde déshydrogénase, malate déshydrogénase, dihydrolipoamide déshydrogénase et succinate déshydrogénase ont été extraitsà partir du mycélium, et quatre C1 C2 C3 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 Similarité enzymes extracellulaires: protéase, cellulase (endoglucanase), amylase et lipase ont été obtenus à partir du milieu de culture. Les protéines ont été séparées soit par PAGE discontinue ou par IEF, et isoenzyme sont été détectées par coloration spécifique. Les isolats de Stenocarpella maydis isolés à partir des semences (Dorrance et al, 1999) ont analysé ces isolats par l’étude du polymorphisme des isoenzymes et de la variabilité morphologique. Cette étude a montré que cette collection à un faible niveau de polymorphisme isoenzymatiques. Les données d’enzymes intracellulaires (ont été analysées par une analyse de non pondérée couplé Procédée groupe (UPGMA), qui sépare les isolats en trois groupes principaux.

Les grappes générées par les enzymes intracellulaires sont faiblement corrélés avec les types d’électrophorèse basés sur les enzymes extracellulaires. Ces résultats suggèrent que les enzymes extracellulaires peuvent être d’une valeur limitée pour classification dans F. oxysporum. Études électrophorétiques de multilocus-enzymes (MLEE) et des protéines de cellules entières (SDS- PAGE) ont été réalisées afin d’évaluer la parité entre les différentes méthodes de caractérisation de cinq espèces de Fusarium récupérés dans les zones de culture du coton en Egypte par des méthodes de taxonomie numérique. Les données obtenues ont révélé que le SDS -PAGE et estérase isoenzymes sont plus efficaces dans le regroupement des isolats de leurs espèces respectives tandis que la peroxydase et isoenzyme malate déshydrogénase a beaucoup résolution limitée dans l’organisation de tous les isolats dans leurs propres à l’espèce groupes respectifs. A de faibles corrélations ont été détectés entre l’origine géographique des isolats et la diversité génétique. Les résultats indiquent que la variation inter- spécifique estimée peut être plus prononcée avec des marqueurs de protéines qu’avec isoyzmes lorsque les deux approches sont appliquées aux mêmes populations. Le niveau de la variabilité génétique détectée à l’intérieur et entre Fusarium spp accessions avec des protéines et isoyzmes estérase analyse suggère qu’il s’agit d’une technologie de marqueur fiable, efficace, et efficace pour déterminer les relations génétiques dans Fusarium genre (Aly et al, 2003) Un total de 13 isolats représentatifs de Fusarium oxysporum f. sp.melonis proviennent de différents régions de l’Iran, USA et la France, huit isolats de sept formaes spéciales de l’Iran et un isolat de F.oxysporum f. sp.niveum et des Etats-Unis ont été comparés sur la base de l’analyse des isoenzymes et le profil des protéines soluble. L’analyse des isoenzymes de phosphatase alcaline (ALP), la catalase (CAT), estérase (EST), la malate déshydrogénase (MDH), la superoxyde dismutase (SOD) et la xanthine déshydrogénase (XDH) a révélé un polymorphisme isoenzymatique entre les différentes forme spéciale de F. oxysporum dans lequel 22 phénotypes électrophorétiques (EP) ont été déterminés (Mohammadi et al, 2004) Polymorphismes isozymes de l’estérase, l’hexose kinase et la malate déshydrogénase est souvent limité des profils isoenzymes.

L’analyse des zymogrammes de la population Trichoderma harzianum et Trichoderma reesei par logiciel UPGMA, a totalement séparé de ces groupes à l’exception la population de T. Trichoderma aureoviride, cette analyse a montré que T. harzianum présente des niveaux élevés de diversité génétique par rapport aux autres espèces de Trichoderma (Shafiquzzaman et al, 2007).

Conclusion

La variabilité morphologique chez trente isolats d’Ascochyta rabiei isolés de trois origines (Ain Témouchent, Mascara et Sidi Bel Abbès), a été recherchée par différents types morphologiques, nous avons enregistré que cet aspect est vraiment variable selon les isolats, nous avons noté la présence de quatre types morphologiquement distincts (jaune, marron clair, marron foncé et vert) à partir de clones par isolement monospore. La première conclusion qu’il convient de tirer est que la morphologie des isolats n’a présenté aucune relation entre leurs aspects et leurs origines.

De même l’étude du pouvoir pathogène, des dix isolats de d’Ascochyta rabiei, a montré une variabilité pathologique qui varie d’un isolat à un autre, les résultats de la confrontation de ses isolats avec deux variétés (flip 90-13 et flip 33-99) ont révélé que aucun isolats de la collection étudie a montré aucune agressivité vis-à-vis les deux variétés de pois chiche testés, par contre nous avons enregistré une variabilité pathogénique, lors de la confrontation de ces isolats avec la variété de pois chiche ILC-1779, l’analyse factorielle a regroupé tous les isolats au centre, sauf que pour deux isolats.

La recherche des activités enzymatiques dans les filtrats de cultures des dix isolats d’A. rabiei nous a permis de mettre en évidence la présence de trois groupes de métabolites protéiques responsables de la dégradation des constituants de la parois et des réserves cellulaires(amylase, cellulase et pectinase), L’étude a montré une nette influence de la source de carbone (amidon, cellulose, carboxyméthyl cellulose, pectine de citron, acide polygalacturonique et glucose) lors de dosage de l’amylase, cellulase, pectine méthylestérase (PME) et polygalacturonase (PGase) dans les filtrats de culture des isolats cultivés dans milieu farine de pois chiche qui contient 1% de ces substrats, les 10 isolats utilisé pour ce test ont produit ces enzymes et le degré de l’activité enzymatique varie d’un isolat à un autre.

Lors de l’étude de l’influence de différents facteurs de croissance sur la production de deux types d’enzymes amylase et pectinase, a révélé une nette influence de ces facteurs sur ces enzymes. L’activité «in vitro» de ces biocatalyseurs est variable en fonction du substrat et de temps d’incubation. Le rôle de ces enzymes dans la pathogenèse n’a pas pu être établi car pour pouvoir leur assigner un rôle dans l’infection de type anthracnose, il faudrait rechercher leur existence dans les plantes infectées et suivre leur évolution dans les différents organes aériens de l’hôte au cours de la maladie.

Table des matières

INTRODUCTION 
1. POIS CHICHE 
2. PRODUCTION MONDIALE DU POIS CHICHE 
3. COMMERCE ET CONSOMMATION 
4. ORIGINE ET CLASSIFICATION 
5. CARACTERISTIQUES GENERALES DE LA PLANTE 
6. LES PRINCIPALES MALADIES FONGIQUES DU POIS CHICHE 
7. RESISTANCE DU POIS CHICHE A L’ASCOCHYTA RABIEI 
7.1. SUR LE PLAN GENETIQUE
7.2. SUR LE PLAN PATHOLOGIQUE
8. CARACTERISTIQUES D’ASCOCHYTA RABIEI 
8.1. TAXONOMIE
8.2. CYCLE DE VIE
8.3. VARIABILITE MORPHOLOGIQUE ASCOCHYTA RABIEI
8.4. SYMPTOMES ET CYCLE DE LA MALADIE
8.5. CONDITIONS ENVIRONNEMENTALES
8.6. EPIDEMIOLOGIE
8.7. MODE D’INFECTION DE LA PLANTE HOTE PAR ASCOCHYTA RABIEI
9. LA PROTECTION DES PLANTES
9.1. LUTTE GENETIQUE
9.2. LA LUTTE BIOLOGIQUE
9.3. LUTTE CHIMIQUE
10. EFFETS DES AGENTS PATHOGENES SUR LA PAROI DE L’HOTE 
11. COMPOSANTS DE LA PAROI CELLULAIRE DE L’HOTE
11.1. CELLULOSE
11.2. HEMICELLULOSES
11.3. PECTINE
12. PRINCIPALES ENZYMES DE DEGRADATION SYNTHETISEES PAR LES PARASITES 
12.1. LA PECTINE METHYLESTERASE (PME)
12.2. PECTINESTERASES (PE) OU PECTINE-METHYLESTERASES (PME)
12.3. L’HYDROLYSE: LA POLYGALACTURONASE (PG) ET LA PECTINE METHYLGALACTURONASE (PMG)
12.4. LES LYASES OU TRANSELIMINASES
12.5. TRANSELIMINASE PECTINOLYTIQUE (PTE)
1. ETUDE DU POLYMORPHISME ISOENZYMATIQUE CHEZ ASCOCHYTA RABIEI 
1. TECHNIQUE D’ISOLEMENT
1.1. MATERIEL FONGIQUE
2. ETUDE MORPHOLOGIQUE DU CHAMPIGNON 
2.1. ETUDE MACROSCOPIQUE
2.2. ETUDE MICROSCOPIQUE
3. ETUDE DU POUVOIR PATHOGENE 
3.1. MATERIEL VEGETAL
3.2. ECHELLE DE NOTATION
4. INFLUENCE DES SOURCES DE CARBONE SUR LA CROISSANCE D’ASCOCHYTA RABIEI 
5. RECHERCHE DES ACTIVITES ENZYMATIQUES 
5.1. DOSAGE DES PROTEINES PAR LA METHODE DE BRADFORD
5.2. DOSAGES ENZYMATIQUES
5.2.1. Dosage de la cellulase
5.2.2. Dosage de l’amylase
5.2.3. Dosage de la Pectine méthyle estérase
5.2.4. Dosage de la Polygalacturonase (PG)
6. ETUDE DES DIFFERENTS FACTEURS INFLUENÇANT SUR LES ACTIVITESENZYMATIQUES 
7. ETUDE DE LA VARIABILITE ISOENZYMATIQUES CHEZ ASCOCHYTA RABIEI 
7.1. PRINCIPE DE DETECTION DES ISO ENZYMES PAR ELECTROPHORESE
7.1.1. Cas des hydrolases
7.1.2. Cas des déshydrogénases
7.1.3. Le superoxyde dismutase
7.1.4. Leucine Aminopeptidase (LAP)
7.1.5. Peroxydase
7.2. REVELATION DES ACTIVITES ENZYMATIQUE
7.3. LECTURE DES ZYMOGRAMMES
7.4. ANALYSE DES ZYMOGRAMMES
8. ANALYSE DES DONNEES 
Les résultats sont traités statistiquement, nous avons utilisé deux logiciels XlStat version 2007 et Statistica
5.1. Les résultats détailles des études de statistique sont présentées en (annexe 03).
1. ASPECT MORPHOLOGIQUE DES ISOLATS
2. POUVOIR PATHOGENE 
3. INFLUENCE DES DIFFERENTS SUBSTRATS SUR LA CROISSANCE MYCELIENNE 
4. ACTIVITE AMYLOLYTIQUE 
5. ACTIVITE CELLULOSIQUE 
6. ACTIVITE PG 
7. ACTIVITE PME 
8. INFLUENCE DES DIFFERENTS FACTEURS SUR L’ACTIVITE AMYLOLYTIQUE 
9. ANALYSE DES EFFETS INDIVIDUELS DES FACTEURS
10. ISOENZYMES 
10.1. ESTERASES
10.2. PHOSPHATASE ACIDE
10.3. SUPEROXIDE DISMUTASE
10.4. PEROXYDASE
10.5. LEUCINE AMINOPEPTIDASE
11. INTERPRETATION ET ANALYSE DES DONNEES 
Conclusion
MILIEU FARINE DE POIS CHICHE 
MILIEU CZAPECK

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