La réaction générale de Schwartzman (nécrose tissulaire) 

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LOCALISATION DES ENDOTOXINES

Les lipopolysaccharides (LPS) constituent la couche la plus externe de la membrane externe des bactéries à Gram négatif [46]. La paroi des bactéries à Gram négatif est constituée de trois couches :
¾ Une membrane interne ou cytoplasmique qui sert de barrière osmotique ;
¾ Une membrane intermédiaire, à base de peptidoglycanes, qui maintient l’intégrité de la structure et la forme caractéristique de la bactérie ;
¾ Une membrane externe contenant les lipopolysaccharides, identifiés dans toutes les bactéries Gram négatif étudiées, responsable d’une partie de l’activité biologique [17].

STRUCTURE DES ENDOTOXINES

Les endotoxines sont donc constituées d’un fragment de paroi de bactérie Gram négatif et du lipopolysaccharide (LPS). Le LPS n’est pas une molécule unique mais une famille de composés ; chaque genre et chaque espèce de bactéries produit un LPS spécifique : les bactéries d’une même famille produisent des LPS de structures similaires, alors que les bactéries de familles différentes produisent des LPS différents [16, 17].
Les LPS, parties biologiquement actives des endotoxines, sont eux-mêmes constitués de deux parties :
¾ Une partie polysaccharidique, fabriquée à partir d’un noyau oligosaccharidique , le « core » ou base, et d’une chaîne O spécifique ;
¾ Une partie phospholipidique, le lipide A, siège de l’activité pro-inflammatoire.

LA FRACTION POLYSACCHARIDIQUE

La chaîne O spécifique

Elle s’insère sur le « core » polysaccharidique ou base : cette chaîne O spécifique peut avoir une grande diversité de structure [16, 17].
Elle est constituée « d’unités d’oligosaccharides » (chaînons) qui se répètent, chacune contenant cinq à sept monosaccharides. Le nombre total d’unités d’oligosaccharides varie, selon l’espèce bactérienne, de vingt à quarante [14]. Des monosaccharides différents constituent les unités d’oligosaccharides des espèces différentes de bactéries à Gram négatif. On a des hexoses classiques (glucose, galactose, mannose) ou des sucres particuliers (tyvelose, paratose). De plus la nature, la séquence, le type de liaison et le groupe de fonction de substitution des monosaccharides varient avec chaque genre et chaque espèce de bactéries.

Le noyau d’oligosaccharide

Le noyau d’oligosaccharide est divisé en deux portions [65] :
• Le noyau (ou core) interne, attaché au lipide A, en position 6 du N-acetylglucosamine. Le noyau interne contient deux sucres inhabituels : l’heptose et l’acide 3-desoxy-D-manno-2-octulosonique (KDO)
Le KDO est une molécule spécifique des lipopolysaccharides. Un résidu de KDO est lié covalentiellement au lipide A et selon les espèces le nombre de résidu de KDO est variable (généralement deux ou trois). L’heptose qui peut être présent sous différentes configurations peut éventuellement faire défaut chez quelques espèces.
• Le noyau (ou core) externe qui est attaché spécifique est fait de monosaccharides galactose…
à la chaîne poly-saccharide O tels que : D-glucose, D- On ne connaît pas d’autres rôles au noyau externe que de fournir un site de fixation à la chaîne O spécifique.

LE LIPIDE A

Il est constitué d’un dimère de N-acetyl-glucosamine phosphorylé comprenant six ou sept acides gras (le plus souvent six).
Tous les acides gras du lipide A sont saturés, certains sont liés directement au dimère; d’autres le sont par l’intermédiaire d’une fonction ester.
C’est par le lipide A que se fixe le LPS à la couche externe de la membrane cellulaire. Il constitue l’ultime spécificité des LPS car les molécules de lipide A sont différentes selon les espèces et à l’intérieur d’une même famille de bactéries.
La synthèse du lipide A est la première étape de l’élaboration du LPS. Les gènes impliqués sont dispersés, et dans certains cas, associés à des gènes responsables dans la synthèse d’autres macromolécules [1].
Le lipide A isolé n’existe pas dans la nature, en tant que précurseur du LPS : au niveau de la membrane cytoplasmique, il se forme un composé précurseur du lipide A, auquel se fixe le KDO, puis les sucres composant le core viennent s’ajouter de façon séquentielle pour former l’unité « lipide A – core oligosaccharide » [51].
La chaîne principale du lipide A des Enterobacteriaceae est le disaccharide β-glycosaminyl-(1-6)- αglucosamine (GlcNII). Ce disaccharide phosphorylé en 1 et 4’ n’a été identifié que dans le lipide A. Le noyau interne se fixe au groupement hydroxyle du GlcNII en 6’.
NB : Les LPS issus des bactéries peuvent contenir des impuretés et en particulier des cations Na+ ,K+,Ca+,mais aussi des amines telles que ethanolamine, putrescine, spermine. Le rôle de ces substances n’est pas connu [17].

PROPRIETES BIOLOGIQUES

Le LPS est un complexe macromoléculaire comportant une portion lipidique liée de façon covalente à une partie polysaccharidique est responsable de la majorité des effets biologiques liés à l’infection par les germes à Gram négatif.
La composante glucolipidique constante du LPS, le lipide A, est le support des propriétés endotoxiniques thermostables.
La spécificité sérologique réside dans la portion polysaccharidique variable qui correspond à l’antigène somatique O des bactéries à Gram négatif [51].

POUVOIR PATHOGENE [14]

La libération d’endotoxine dans la circulation sanguine, notamment à la suite d’une septicémie à bactéries à Gram négatif, peut conduire à un choc endotoxinique et à la mort. A titre d’exemple, on estime que le nombre des septicémies dues à des bactéries à gram négatif atteint chaque année 300000 individus aux Etats Unis d’Amérique et le taux de mortalité peut atteindre 50%.
Les traitements antibiotiques peuvent conduire à une libération importante d’endotoxine. L’importance de cette libération est variable selon les molécules et, d’une manière générale, les antibiotiques peuvent être classés (en allant des molécules faisant libérer les quantités les plus importantes vers les molécules faisant libérer les quantités les plus faibles) de la manière suivante : céphalosporine, pénicillines, imipenem, aminosides et quinolones.
L’injection d’endotoxine à l’animal provoque des effets tels que : la fièvre, l’hypotension, des troubles de la coagulation, une neutropénie et un avortement chez les femelles en gestation.
Validation du contrôle des endotoxines bactériennes par la méthode au Limulus Amebocyte Lysate (LAL) test .40

L’effet létal

L’intensité du pouvoir pathogène des endotoxines est variable selon espèce animale et selon la bactérie mais les signes observés sont pratiquement toujours identiques. Une forte dose d’endotoxine (environ 0,025 mg /Kg chez le chien et le lapin ou 2,5 mg /Kg chez le rat et la souris) provoque un effet létal [28].

L’effet pyrogène [36]

L’endotoxine agit comme un pyrogène c’est à dire qu’elle donne la fièvre, lorsque les bactéries Gram négatif s’accumulent dans les tissus en quantité suffisante pour venir en contact avec la circulation. La fièvre est provoquée par des quantités très faibles d’endotoxine. Environ 100 ng (0,1µg) injectés par voie intraveineuse chez un adulte volontaire entraînent une réponse pyrogène mesurable c’est à dire de la fièvre. Il faut noter que cette réponse est produite par dix millions de bactéries intestinales, ce qui n’est pas une masse bactérienne particulièrement importante. La flore intestinale normale contient un nombre de bactéries à peu près un million de fois supérieur à cela. Si toute l’endotoxine contenue dans l’intestin devait pénétrer dans le sang et si la fièvre suivait une courbe linéaire, on aurait une température d’environ un million de degrés !
De toute évidence, la quantité d’endotoxine qui passe de l’intestin dans la circulation portale est probablement très faible. Néanmoins, cette quantité d’endotoxine est suffisante pour maintenir un niveau de base de stimulation de la réponse immune, qui est constant, chez les personnes en bonne santé, sans que cela n’entraîne de manifestation pathologique.
La fièvre est produite par l’endotoxine qui induit la libération d’une protéine à partir des phagocytes mononuclées ; cette protéine est connue sous le nom de pyrogène endotoxine. Les plus connues de ces protéines sont IL1 et TNF qui déclenchent toute une série complexe d’évènements que l’on appelle réponse en phase aiguë. Cette fièvre s’accompagne d’une modification du taux des protéines plasmatiques dites de la phase aiguë de la réaction inflammatoire, à savoir le fibrinogène, la protéine C-réactive, la transferrine etc.

la réaction générale de Schwartzman (nécrose tissulaire)

Les effets des endotoxines sur la coagulation sont bien illustrés par les réactions de Schwartzman (hypersensibilité non spécifique) observées après deux injections d’endotoxine effectuées à 12 ou 18 heures d’intervalle. Une réaction locale est obtenue par une injection intradermique suivie d’une injection intraveineuse et elle se traduit par une nécrose hémorragique de la zone intradermique. Une réaction générale est obtenue par deux administrations intraveineuses et provoque une nécrose bilatérale du cortex rénal. Les réactions de Schwartzman s’expliquent par une occlusion des petits vaisseaux par de la fibrine et par une coagulation intravasculaire disséminée [47, 49].

La neutropénie

Cette neutropénie s’accompagne le plus souvent d’une diminution du nombre des plaquettes et d’une leucocytose [34].

L’hypotension [36, 49]

L’hypotension est observée environ 30 minutes après une administration d’endotoxine. Elle s’accompagne d’une diminution de la circulation veineuse et d’une congestion des organes. L’hypotension est due à une série de réactions complexes provoquée par l’endotoxine. On a suggéré récemment que les médicaments clefs de l’hypotension induite par l’endotoxine sont le tumor necrosis factor (TNF) et l’interleukine-1(IL-1). L’importance de l’hypotension est donc considérablement réduite par l’administration de sérum anti-tumor necrosis factor ou de sérum anti-interleukine-1 avant injection d’endotoxine. Une hypothèse plus ancienne suggère que la baisse de la résistance des vaisseaux périphériques est due à l’accumulation d’amines vasoactives (histamines et kinines). Des travaux importants sont en cours pour essayer de comprendre les bases moléculaires du choc endotoxinique.

La coagulation intravasculaire disséminée (CIVD)

C’est le nom donné au dépôt de micro caillots dans les petits vaisseaux, entraîne des lésions graves au niveau des organes privés d’apport sanguin. Les effets sont particulièrement sévères au niveau des reins, où l’on observe une nécrose corticale. Les autres organes également affectés sont le cerveau, les poumons et les glandes surrénales [49].
L’endotoxine contribue à la coagulation sanguine de trois manières :
• Elle active le facteur XII (facteur de Hageman) qui déclenche la cascade de la coagulation.
• Elle entraîne une libération du contenu des granules plaquettaires.
• Elle induit la libération, à partir des polynucléaires neutrophiles, de protéine de base qui stabilisent les caillots de fibrine.

L’action abortive

Cette action se produit avec des doses non létales pour la femelle, résulte d’hémorragies placentaires [49].

PROPRIETES IMMUNOLOGIQUES

La spécificité sérologique [46]

Cette spécificité réside dans la portion polysaccharidique variable du LPS qui correspond à l’antigène somatique O des souches lisses ou à la partie externe du core oligosaccharide des souches R.
L’injection de bactéries à Gram négatif ou de LPS à un animal induit la production d’anticorps dirigés contre les déterminants polysaccharidiques.
L’antigène O est hautement immunogène. Cependant, l’immunogénicite diminue considérablement ou s’annule quand il est séparé du lipide A. L’antigène O se comporte donc comme un haptène dont l’activité immunologique nécessite l’effet adjuvant du lipide A ou d’une protéine, quand il s’agit de l’antigène O préparé par hydrolyse acide du LPS.
L’antigène O est un antigène thymoindépendant, c’est à dire qu’il donne une réponse anticorps en l’absence de cellules T.
Les complexes antigènes –anticorps formes activent ensuite le système complément en se fixant à son composant C1q (voie classique) aboutissant à la lyse, cellulaire ou à la phagocytose.
Les anticorps produits sous l’effet du LPS sont essentiellement de nature IgM. Il peut également s’agir d’IgA, c’est le cas lors d’immunisation par Salmonella enterica (serovar typhi) ou d’IgG. Des raisons de la stimulation préférentielle d’IgM restent encore inexpliquées.
Tous les anticorps sont protecteurs mais la protection conférée par IgM est mille fois plus effective, cet anticorps étant plus apte à provoquer la lyse. Ceci a pu être démontré par l’utilisation d’anticorps monoclonaux.
Théoriquement, les anticorps dirigés contre des portions actives du LPS donnent lieu à des réactions croisées anti-LPS et protectrices, lors d’infections systémiques à bactéries Gram négatif diverses.
Ce phénomène est accentué chez les souches R, chez lesquelles la spécificité antigénique est pratiquement nulle [34].
Il existe une tolérance immunogénique aux LPS :
• Une tolérance précoce induite par l’exposition à des doses sublétale de LPS ; l’injection est suivie d’une réponse qui décroît en 3 à 4 jours et se normalise. Cette tolérance est attribuée à des modifications hématopoïétiques spécifiques et à une diminution de la capacité à produire des cytokines.
• Une tolérance tardive, durable, qui est le résultat de la production d’anticorps anti-LPS.
Contrairement à la tolérance précoce, la tolérance tardive est seulement spécifique du LPS inducteur.

Mécanisme d’action In vivo des LPS

Quand le LPS est libéré de la surface bactérienne, il se complexe avec des protéines liant le LPS (LBP) telle que la CD 14, avant de se lier à des récepteurs spécifiques des LPS sur les cellules hôtes (monocytes, macrophages ou neutrophiles). Il s’en suit une activation cellulaire [51].
Les macrophages activés libèrent des cytokines : l’interleukine-1(IL1) et le (tumor necrosis factor) TNF.
Ces deux types de cytokines agissent sur presque toutes les cellules, et augmentent l’expression des gènes impliqués dans le processus inflammatoire.
L’endotoxine stimule également l’immunité humorale. La grande variété des anticorps anti-LPS produits, témoigne de la diversité de structure de l’endotoxine et des particularités des différentes bactéries à Gram négatif.

Propriétés immunologiques non spécifiques du LPS

¾ L’effet adjuvant :
L’effet adjuvant est connu depuis longtemps, et on savait que l’adjonction de vaccin TAB (thyphoide et parathyphoide A et B) à une autre vaccination augmentait de façon importante la réponse immunitaire vis-à-vis de la vaccination concomitante Cette action adjuvante est le fait du lipide A et elle peut être obtenue lorsque l’endotoxine est administrée moins de six heures après l’injection de l’antigène [24].
D’autre part, l’endotoxine rompt la tolérance immunologique à un antigène.
¾ La stimulation des lymphocytes B
En induisant la libération d’IL1, l’endotoxine induit la prolifération des lymphocytes B (mais pas celle des lymphocytes T). Les lymphocytes B matures se transforment en cellules productrices d’anticorps. L’élévation du taux des anticorps qui en résulte contribue à augmenter la résistance à l’infection [51].
L’endotoxine stimule la prolifération de lymphocytes B de souris en provoquant l’augmentation de la synthèse de l’acide désoxyribonucléique(DNA)
¾ Activation du complément [49]
Chez les malades souffrant d’une infection à bactérie à Gram négatif comme chez les animaux ayant reçu de l’endotoxine, on observe une baisse du taux de complément qui intervient simultanément avec la thrombocytopenie et la leucopénie. Le système complément joue certainement un rôle dans l’augmentation de la coagulation sanguine due à l’endotoxine. Le LPS peut activer le complément par la voie alterne: le composant C3 en association avec des protéines sériques, complexe le lipide A, aboutissant à la lyse.
La bactérie est protégée de cette action non spécifique du complément par l’antigène O. C’est pourquoi, les mutants rugueux y sont plus sensibles.

LPS ET VIRULENCE BACTERIENNE

La perte de virulence liée à la mutation « smooth, rough » (S, R) suggère un rôle possible des chaînes latérales dans la pathogénécité d’une souche. De ce fait, dans certains cas, les différences observées entre souches virulentes et souches avirulentes peuvent être interprétées d’après la composition du LPS. Cependant, les grandes variations de virulence entre des souches smooth d’un même genre, ou d’un même sérotype, font penser qu’elles ne dépendent pas seulement de la composition du LPS. Les différences peuvent être aussi quantitatives. La surface de la bactérie joue un rôle dans la protection de la cellule contre son environnement, et permet aux bactéries de s’adapter à certaines conditions. Elle rend même certaines souches résistantes à l’action bactéricide des lysosomes des polynucléaires [28].
La structure du LPS, qui s’étend à l’extérieure de la paroi, retient le complexe anticorps-complément éloigné de la membrane. De plus, dans les premières étapes de l’infection, l’endotoxine libérée sans dommage pour la bactérie pourrait diminuer localement les défenses de l’hôte [9].
Les chaînes latérales à spécificité O constituent la région du LPS la plus impliquée dans la virulence.
C’est pourquoi les souches rugueuses sont généralement moins virulentes que les souches lisses. L’antigène O intervient d’abord dans la première phase de l’infection : il constitue un moyen d’attachement à des récepteurs cellulaires [57].
Chez Actinobacillus pleuropneumoniae, les sérotypes ayant un LPS de type lisse adhèrent plus massivement aux anneaux trachéens que les LPS de type intermédiaire [2].
Dans une étape plus tardive, l’antigène O permet à la bactérie d’échapper aux mécanismes de défense de l’hôte. En effet, le complément peut être activé par la voie alterne, par fixation de son composant C3 sur le lipide A. Pour la plupart des germes, cette lyse n’est possible que pour les mutants rugueux : les chaînes latérales à spécificité O bloquent l’accès du complément à la bactérie.
L’antigène O protège donc la bactérie de la lyse [33].
Une souche rugueuse de Salmonella enterica s. v Choleraesuis n’était virulente qu’après inoculation dans une veine ou dans le péritoine, et non après administration orale : l’antigène O est nécessaire à la survie du germe dans le tractus digestif [20].
En outre, chez les souches lisses (S), l’accès du complément à la bactérie diminue avec l’épaisseur de l’antigène O.

NOTION DE BIOFILM [3]

Les techniques d’observation, comme la microscopie confocale à balayage laser qui permet d’obtenir des images en trois dimensions, ont permis de découvrir des amas de cellules fixées à un support, regroupées à l’intérieur d’une matrice polysaccharidique sécrétée par elles mêmes, se comportant telles des colonies organisées ayant pour but de s’auto protéger et de « socialiser» leurs comportements. L’association des microorganismes au sein d’une matrice d’exopolymères attachée à une surface est appelée un biofilm.
Un biofilm ressemble à une communauté complexe, hautement différenciée, regroupée en différentes niches qui sont fonction de la particularité de la population microbienne en présence. La découverte d’un tel type d’organisation à mis en évidence une faiblesse des antibiotiques et des détergents, des matériaux industriels, mais aussi une sous estimation importante vis à vis de la biomasse que les bactéries attachées représentent et de leurs rôles dans les cycles biogéochimiques, ainsi que des relations qu’elles peuvent avoir avec d’autres organismes vivants, que ce soit dans le milieu aérien ou aquatique.
La mise en place d’un biofilm s’effectue en 4 étapes:
• Le transport des bactéries sur les surfaces, par diffusion ou par flux turbulent.
• L’adsorption: pratiquement instantanée, elle survient souvent lors de la modification de la surface.
• L’adhésion: elle est due à différents types de forces qui interviennent entre la surface inerte et la cellule vivante (Van der Waals, électrostatiques et interactions hydrophobes). Elle est influencée par l’hydrophobicité des germes, variable selon les espèces et l’état physiologique du germe concerné, par les SPE, produites par les bactéries, qui peuvent aussi être favorables à la fixation d’autres espèces microbiennes, et par la température.
• Cette adhésion se fait en deux temps : l’adhésion réversible pendant laquelle la bactérie peut être facilement enlevée par simple rinçage, et l’adhésion irréversible qui nécessite des forces plus importantes pour retirer les bactéries (raclage, brossage).
• La colonisation: elle peut durer de quelques heures à quelques mois en fonction des conditions dans lesquelles se trouvent les micro-organismes. Il y a formation d’un réseau de micro-colonies qui se multiplient dans le réseau de polymères, nommé glycocalyx.

Table des matières

INTRODUCTION
PREMIERE PARTIE : GENERALITES
I. NOTIONS GENERALES SUR LA FIEVRE JAUNE
I.1. AGENT PATHOGENE ET VECTEUR
I.2. SIGNES CLINIQUES
I.3. LE VACCIN AMARIL STABILISE
II. DEFINITION DES ENDOTOXINES BACTERIENNES ET LOCALISATION
II.1. DEFINITION
II.2.LOCALISATION DES ENDOTOXINES
III.STRUCTURE DES ENDOTOXINES
III.1. LA FRACTION POLYSACCHARIDIQUE
III.1.1. La chaîne O spécifique 
III.1.2. Le noyau d’oligosaccharide 
III.2. LE LIPIDE A
IV.PROPRIETES BIOLOGIQUES
IV.1. POUVOIR PATHOGENE
IV.1.1. L’effet létal 
IV.1.2. L’effet pyrogène 
IV.1.3. La réaction générale de Schwartzman (nécrose tissulaire) 
IV.1.4. La neutropénie 
IV.1.5. L’hypotension 
IV.1.6. La coagulation intravasculaire disséminée 
IV.1.7. L’action abortive 
IV.2. PROPRIETES IMMUNOLOGIQUES
IV.2.1 La spécificité sérologique 
IV.2.2. Mécanisme d’action In vivo des LPS 
IV.2.3. Propriétés immunologiques non spécifiques du LPS 
V. LPS ET VIRULENCE BACTERIENNE
V.1. NOTION DE BIOFILM
V.2. INTERACTION BACTERIES PATHOGENES-HOTE
VI.RESISTANCE AUX AGENTS PHYSICO-CHIMIQUES
VII. LPS ET RESISTANCE BACTERIEN AUX ANTIBIOTIQUES
VIII. METHODE D’ETUDE DES LPS 
IX. ESSAIS DE DETECTION DES ENDOTOXINES
IX.1. LES TESTS DE DETECTION
IX.1.1. Le test in vivo 
IX.1.2. Le test in vitro
IX.2. INTERFERENCES DANS LE TEST LAL
X. CRITERES DE LA VALIDATION
X.1. LA LIMITE DE DETECTION
X.2. SPECIFICITE
X.3. REPETABILITE
X.4. REPRODUCTIBILITE
DEUXIEME PARTIE : TRAVAIL PERSONNEL
I. PRESENTATION DU CADRE D’ETUDE
II. MATERIEL
II.1. APPAREILLAGE ET VERRERIE
II.2. PRECAUTIONS DE REALISATION DE L’ESSAI
II.2.2. Test préalable de stérilité 
II.2.1. Vaccin Amaril Stabilisé 
III. VALIDATION DU DOSAGE DES ENDOTOXINES PAR LA METHODE LAL
III.1. MATERIEL
III.2. METHODE
III.2.1. Qualification initiale (Validation de la sensibilité du Lysat) 
III.2.2. Calibration RSE/CSE 
III.2.3.Essai de recherche des interférences 
IV. ESSAI DES ENDOTOXINES PAR LA METHODE LAL
IV.1. PREPARATION DE L’ENDOTOXINE STANDARD DE CONTROLE (CSE)
IV.2. MODE OPERATOIRE
IV.3. LECTURE
IV.4. INTERPRETATION DES RESULTATS
V. RESULTATS ET ANALYSES
V.1 PRECAUTIONS DE REALISATION DE L’ESSAI
V.1.1 Test de stérilité 
V.1.2. Vaccins 
V.2. TEST DE CONFORMITE
V.2.1.Qualification initiale (validation de la sensibilité du Lysat) 
V.2.2. Calibration CSE/RSE
V.3 ESSAI DE RECHERCHE DES INTERFERENCES
V.3.1. Détermination de la dilution maximale significative 
V.3.2. Recherche des interférences du vaccin sur le test pour un lot 
V.3.3. Recherche d’interférences du vaccin sur le test pour trois lots 
V.4. ESSAI DES ENDOTOXINES PAR LA METHODE LAL
VI. DISCUSSION
VI.1 CHOIX DE LA METHODE
VI.2 ANALYSE DES RESULTATS
VI.2.1. Test de conformite 
VI.2.2. Essai de recherche des interferences 
VI.2.3. Essai de routine
VI.2.4. Validation de la methode 
CONCLUSION
BIBLIOGRAPHIE 

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