La pression osmotique et activité de l’eau

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Mode de développement et croissance

Mode de développement des levures

Les levures sont des organismes hétérotrophes et doivent donc prélever dans leur milieu de vie les substances organiques nécessaires à leur vie. Chez les hétérotrophes, deux principales voies énergétiques sont connues : la respiration (en présence d’O2) et la fermentation (en absence d’O2). Ces deux processus exigent une source de carbone et d’énergie à partir de composés carbonés (Le Blanc, 2007-2008).
En présence d’oxygène, toutes les levures sont capables de dégrader le glucose, le fructose et le mannose conduisant à la formation de CO2 et H2O (Pol, 1996). Au cours de ce processus, les levures réalisent un métabolisme oxydatif ou une respiration aérobie: Sucre + Oxygène CO2+ Eau + 38 molécules d’ATP
Cette voie métabolique est beaucoup plus énergétique et confère aux levures une multiplication importante. Notons qu’en plus des sucres simples, certaines levures utilisent d’autres glucides (mono, di ou tri saccharides et des polysaccharides), mais aussi des acides, des alcools et des alcanes (Larpent, 1991).
En absence d’oxygène, les levures privilégient un métabolisme fermentatif qui conduit à la formation d’éthanol et de CO2. En plus de ces composés majoritaires, des alcools, des aldéhydes, des esters, des acides, … sont formés en plus petites quantités. Ce métabolisme est moins énergétique que le métabolisme oxydatif (Guiraud et Rosec, 2004). Ici, il y’a production de 2 molécules d’ATP seulement. Sucre CO2 + Ethanol + 2molécules d’ATP

Croissance

Comme tout organisme vivant, les levures exigent pour leur croissance des conditions physico-chimiques favorables dont les plus importantes sont :

La température

La température adéquate pour la culture des levures se situe généralement entre 25 et 30°C. Toutefois, elles peuvent tolérer des températures entre 35 et 45°C (Leveau et Bouix, 1993). Certaines levures peuvent pourtant se développer à 0°C (Oteng-Gyeng, 1984) ou à plus de 50°C (Bourgeois et al., 1988; Leveau et Bouix, 1993).

Le pH

Le pH optimal de croissance de la grande majorité des levures se situe entre 4,5 et 6,5 mais de nombreuses espèces tolèrent de grandes variations de pH. Des espèces peuvent s’adapter à des milieux acides (pH entre 2,8 et 3,0) ou alcalins (pH entre 8 et 8,5) (Bourgeois et al., 1988; Larpent et Larpent Gourgaud, 1997).

La pression osmotique et activité de l’eau

La pression osmotique joue également un rôle majeur dans le développement des levures. Son effet varie d’une souche à une autre : la plupart des levures peuvent se développer à des activités de l’eau inférieures à 0,90 ; les xérotolérantes peuvent vivre à des pressions osmotiques plus élevées correspondant à une activité de l’eau de l’ordre de 0,60 mais leur métabolisme est lent (Leveau et Bouix, 1979; Larpent et Larpent Gourgaud, 1997), car elles sont capables de synthétiser des osmoprotecteurs (exemple : le glycérol).

L’oxygène

Toutes les levures sont capables de vivre en aérobiose autrement dit il n’existe pas d’espèces anaérobies strictes. Toutefois il existe des aéro-anaérobies facultatives (Bouix et Leveau, 1991).

Habitat

Les levures colonisent tous les milieux et sont donc des organismes ubiquitaires. Largement répandu dans la nature, ce groupe de champignon se rencontre surtout sur les végétaux riches en sucres directement assimilables (Bouix et Leveau, 1991). En effet, les milieux concentrés en sucres constituent un de leurs milieux préférés comme les sirops, le miel, les fleurs ainsi que les fruits mûrs (mangues, pommes, raisins …) (Leclerc, 1975; Oteng-Gyang, 1984). De même, les levures peuvent aussi être présentes à l’intérieur d’autres êtres vivants et dans les eaux, dans l’air et dans le sol (Leveau et Bouix, 1993; Pol, 1996).

Besoins nutritionnels

Comme tout être vivant, les levures ont besoin d’éléments nutritifs pour survivre, croitre et se reproduire. Elles doivent trouver dans leur milieu de vie tous les éléments nécessaires à la synthèse cellulaire.

Sources de carbone

Pour leur vie, les levures exigent une ou des sources de carbone pour la biosynthèse de constituants cellulaires variés tels que les glucides, les protéines, les lipides, les acides nucléiques, etc. (Botton, 1991). Des sucres sont utilisés comme source principale de carbone par les levures et donc d’énergie. Les oses tels que le glucose, le fructose et le mannose constituent les sources les plus efficaces utilisés par plus de 400 espèces identifiées (Pol, 1996). D’autres levures particulières utilisent des sources de carbone non conventionnelles. En effet, elles sont capables d’oxyder des acides organiques et des alcools (éthanol, glycérol) (Oteng-Gyang, 1984).

Sources d’azote

La majeure partie des levures est capable d’assimiler différentes sources d’azote (organique et inorganique) pour la biosynthèse d’acides aminés, de protéines, d’acides nucléiques et de vitamines (Larpent et Larpent-Gourgaud, 1997; Guiraud, 1998). Comme les levures ne peuvent pas fixer l’azote libre, l’assimilation des ions d’ammonium est largement répandue chez ces dernières. Toutefois, des espèces se caractérisent par leur capacité à utiliser les nitrates et d’autres composés azotés tels que les acides aminés, les bases puriques et pyrimidiques comme source d’azote (Walker et al., 1997; Bouix et Leveau, 1999).

Oligoéléments et facteurs de croissance

En plus du carbone et de l’azote, le développement adéquat des levures nécessite d’autres éléments nutritifs. Ces éléments sont des sels minéraux et des oligoéléments nécessaires à de très faibles concentrations. De plus, certaines espèces demandent l’apport de un ou plusieurs facteurs de croissance comme des vitamines, des coenzymes et des acides aminés (Larpent-Gourgaud et Sanglier, 1992).

Reproduction

Le mode de reproduction des levures se réalise soit par voie sexuée, soit par voie asexuée, selon les conditions du milieu (Larpent et Larpent-Gourgaud, 1997). La reproduction asexuée est la plus utilisée pour la majeure partie des levures: soit par bourgeonnement soit par fission binaire (Bonaly, 1991). Dans certaines conditions du milieu, certaines levures se reproduisent par voie sexuée par conjugaison de deux cellules donnant formation à un zygote. Ainsi, les levures peuvent se multiplier par une voie plus complexe alternant une phase haploïde et une phase diploïde. Les figures 2 et 3 illustrent les modes de division des levures.

Ecologie

Le manioc s’adapte bien aux sols légers, sablonneux et bien drainés, mais il pousse aussi sur des sols arides ou pauvres impropres à la culture d’autres plantes. Durant les périodes de sécheresse, le manioc perd ses feuilles, ce qui lui permet de survivre (CPS. Le manioc, 1995).

Composition chimique et valeurs nutritionnelles

Le tubercule de manioc, appelé couramment le manioc, est un aliment digeste et énergétique. Quasiment dépourvu de protéines, de vitamines et de sels minéraux, il possède un fort taux d’amidon et de glucides qui lui permettent d’atteindre les 137 kcal pour 100 g. Notons aussi que le manioc doux peut atteindre les 262 kcal pour 100 g. Cette haute valeur énergétique lui permet de constituer un apport non négligeable de sucres.
La farine de manioc joue un rôle de substitut de la farine de blé pour les personnes atteintes de maladies coeliaques puisqu’il ne contient pas de gluten tout comme le quinoa. Les tableaux 3, 4 et 5 présentent respectivement la composition, la teneur en éléments minéraux et en vitamines du manioc.

Isolement des souches levuriennes

Préparation de la suspension mère (NFV 08 002)

Pour préparer 250ml de solution mère : 25g de morceaux de manioc sont additionnés de 225ml de solution stérile d’eau peptonée tamponnée et le mélange est agité énergiquement.

Milieu d’ensemencement

Le milieu utilisé est le milieu Sabouraud-chloramphénicol 5%. Le milieu Sabouraud a été choisi puisque c’est un milieu sélectif favorisant la culture et l’isolement des champignons et des moisissures et donc des levures. Il permet ainsi l’isolement des levures. L’addition de chloramphénicol 5% est nécessaire, afin d’empêcher le développement des bactéries.

Ensemencement et incubation

Sous une hotte à flux laminaire : deux boîtes de Pétri sont préparées, où dans chacune d’elle 1ml de la solution mère est déposé au fond de la boîte. 20ml de milieu Sabouraud-chloramphénicol 5% en surfusion (45°C) sont ensuite ajoutés dans chaque boîte ; le tout est remué en faisant bouger la boîte sur la paillasse et laissé refroidir. Après refroidissement, les deux boîtes sont retournées et incubées à 30°C pendant 48heures.

Purification et conservation

Après l’incubation, la caractérisation des colonies isolées permet de distinguer les différents types de colonies présents dans les cultures. Chaque type de colonie est ensuite repiqué dans une boîte de Pétri afin de le purifier.
Lors de la purification : 20ml de milieu Sabouraud-chloramphénicol 5% en surfusion sont versés dans chaque boîte de Pétri. Une fois le milieu solidifié, un prélèvement de chaque type de colonie est effectué à l’aide de l’anse stérilisé par flambage puis ensemencé à la surface du milieu. Toutes les boîtes sont enfin retournées et incubées à 30°C le temps qu’il faut pour avoir des colonies bien développées.
Après incubation, chaque boîte doit contenir des colonies présentant les mêmes caractéristiques macroscopiquement et microscopiquement donc une culture homogène ou une seule souche.
Un prélèvement de chaque souche ainsi obtenue est de nouveau repiqué à la surface d’un milieu Sabouraud-Chloramphénicol 5% dans une boîte de Pétri, afin d’avoir une souche pure de levure. Toutes les souches pures de levure sont ensuite conservées dans des tubes vissés contenant du milieu Sabouraud-Chloramphénicol 5% en pente: un prélèvement de chaque souche pure est ensemencé à la surface de la pente. Les tubes sont incubés à 30°C pendant 48h puis conservées à +4°C au réfrigérateur et vont servir pour des études ultérieures comme l’identification.

Etude des caractères morphologiques

Observation à l’état frais

Principe

Cette observation ne nécessite pas de coloration, ni de réactif mais simplement de l’eau distillée stérile qui permet de bien distinguer au microscope les caractéristiques recherchées lors de cette étude.

Mode opératoire

Sous une hotte à flux laminaire, à l’aide de l’anse de platine stérilisé, un prélèvement de la souche pure à étudier est déposé sur une lame mince bien dégraissée et mélangé avec une goutte d’eau distillée stérile qui y a été déjà déposée. Quand la préparation est bien homogénéisée, elle est recouverte par une lamelle et observée immédiatement au microscope: la forme des cellules, leur mode de groupement, leur mode de division ainsi que leur mobilité sont notés.

Coloration Gram

Principe

La coloration de Gram est une coloration différentielle, car elle repose sur une différence fondamentale entre la composition chimique de la paroi des germes. Cette coloration permet d’attribuer, si possible, aux levures étudiées le critère Gram-négatif ou Gram-positif. Après l’action successive d’un premier colorant (le violet de Gentiane), d’iode, d’alcool et d’un deuxième colorant (la fuschine ou la safranine) :
– Les germes à Gram positif : gardent la coloration du violet de Gentiane car ne sont pas décolorés par l’alcool. Leur paroi, à faible teneur en lipides, forme une barrière qui empêche l’entrée de l’alcool dans le cytoplasme.
– Les germes à Gram négatif : apparaissent en rose car après leur décoloration par l’alcool, ils sont recolorés par le deuxième colorant. Leur paroi, à teneur en lipides plus élevée, laisse l’alcool pénétrer dans le cytoplasme.

Mode opératoire

La technique de la coloration Gram se réalise en plusieurs étapes :
o Préparation du frottis :
Une goutte issue d’une solution de la souche pure de levure à étudier est étalée sur une lame mince. Après séchage, l’étalement est fixé par flambage en passant trois fois la lame, le frottis vers le haut, dans la flamme d’un bec Bunsen.
o Coloration
Le frottis est recouvert pendant 1 minute par une solution de violet de Gentiane qui est ensuite chassée par une solution iodo-iodurée (lugol). Après 15-20 secondes, le mordançage par le lugol est encore répété deux fois. Le frottis est ensuite lavé abondamment à l’eau du robinet.
o Différenciation
Le frottis est recouvert pendant 5-10 secondes par de l’alcool 70° et lavé abondamment à l’eau du robinet.
o Contre coloration
Le frottis est recoloré pendant 30 secondes par une solution de Fuschine de Ziehl, lavé à l’eau du robinet et séché entre deux feuilles de papier filtre.
o Observation au microscope
La coloration des cellules constitutives de chaque souche pure de levure est notée.

Etude des caractères physiologiques

Type respiratoire

Principe

Le principe vise à définir le type respiratoire de la souche pure de levure. La détermination du type respiratoire consiste à étudier le comportement des souches vis-à-vis de l’oxygène de l’air. Il existe différents types de microorganisme suivant ce comportement :
– les anaérobies stricts: ne croissent qu’en l’absence d’oxygène.
– les aérobies stricts: ne se développent qu’en présence d’oxygène.
– les aéro-anaérobies facultatifs: croissent aussi bien en absence qu’en présence d’oxygène, mais préférant l’aérobiose.
– les anaéro-aérobies facultatifs : croissent aussi bien en présence qu’en absence d’oxygène mais préférant l’anaérobiose.
– les microaérophiles : ont besoin d’une faible quantité d’oxygène pour se développer.

Mode opératoire

La détermination du type respiratoire d’un germe se fait sur un milieu sans nitrate contenant du glucose, et conditionné en tubes étroits. Le milieu de culture utilisé est la gélose viande foie (V.F). Les milieux stériles encore en surfusion, contenus dans des tubes vissés, sont laissés refroidir. Un ensemencement en spirale d’un prélèvement de chaque germe est par la suite effectué, du fond vers le haut du milieu. Après refroidissement du milieu, les tubes sont incubés à 30°C pendant 24 à 48h.
Après l’incubation, 5cas peuvent alors se présenter :
– Développement des souches, caractérisé par la turbidité en profondeur du milieu de culture, pour les germes anaérobies stricts.
– Prolifération dans la zone superficielle du milieu de culture, pour les germes aérobies stricts.
– Développement sur toute la hauteur du milieu avec une abondance près de la zone superficielle, pour les germes aéro- anaérobies facultatifs.
– Croissance sur toute la hauteur du milieu, mais plus marquée en profondeur, pour les germes anaéro – aérobies facultatifs.
– Croissance dans la zone intermédiaire pour les germes microaérophiles.

Table des matières

INTRODUCTION
Première partie: SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
I-Généralités sur les levures
I-1.Morphologie et structure
I-2.Mode de développement et croissance
I-2.1. Mode de développement
I-2.2. Croissance
I-2.2.1. La température
I-2.2.2. Le pH
I-2.2.3. La pression osmotique et activité de l’eau
I-2.2.4. L’oxygène
I-3.Habitat
I-4.Besoins nutritionnels
I-4.1.Sources de carbone
I-4.2.Sources d’azote
I-4.3.Oligoéléments et facteurs de croissance
I-5.Reproduction
I-6.Classification
I-7.Utilisations des levures
II- Le manioc
II-1.Historique et origine du manioc
II-2.Description botanique
II-2.1 Position systématique
II-2.2. Morphologie
II-2.3.Ecologie
II-3.Composition chimique et valeurs nutritionnelles
III-Interactions entre plantes et microorganismes
Deuxième partie: MATERIELS ET METHODES
I-Matériels
I-1.Le matériel végétal
I-2. La récolte
II-Méthodes
II-1.Isolement des souches levuriennes
II-1.1. Préparation de la suspension mère (NFV 08 002)
II-1.2. Milieu d’ensemencement
II-1.3. Ensemencement et incubation
II-2. Purification et conservation
II-3. Identification des souches
II-3.1. Etude des caractères culturaux
II-3.1.1. Principe
II-3.1.2. Mode opératoire
II-3.2.Etude des caractères morphologiques
II-3.2.1. Observation à l’état frais
II-3.2.1.1. Principe
II-3.2.1.2. Mode opératoire
II-3.2.2. Coloration Gram
II-3.2.2.1. Principe
II-3.2.2.2. Mode opératoire
II-3.3. Etude des caractères physiologiques
II-3.3.1. Type respiratoire
II-3.3.1.1. Principe
II-3.3.1.2. Mode opératoire
II-3.3.2. Influence de la température
II-3.3.2.1. Principe
II-3.3.2.2. Mode opératoire
II-3.4. Etude des caractères biochimiques
II-3.4.1. Etude sur le milieu Hajna-kliger
II-3.4.1.1. Principe
II-3.4.1.2. Mode opératoire
II-3.4.2. Etude sur le milieu Lysine-Fer
II-3.4.2.1. Principe
II-3.4.2.2. Mode opératoire
II-3.4.3. Etude sur le milieu Citrate-Simmons
II-3.4.3.1. Principe
II-3.4.3.2. Mode opératoire
II-3.4.4. Etude sur le milieu Mannitol-mobilité
II-3.4.4.1. Principe
II-3.4.4.2. Mode opératoire
II-3.4.5. L’Auxanogramme du carbone
II-3.4.5.1. Principe
II-3.4.5.2. Mode opératoire
Troisième partie: RESULTATS ET INTERPRETATIONS
I-Isolement des souches de levure
II-Purification et conservation
III-Identification des souches
III.1- Les caractères culturaux
III.2-Les caractères morphologiques
III.3-Les caractères physiologiques
III.3.1-Type respiratoire
III.3.2-Influence de la température
III.4-Les caractères biochimiques
III.4.1- les caractères biochimiques sur milieux d’identification
III.4.2- L’Auxanogramme du carbone
IV-Détermination des genres et des espèces de levures isolées
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
WEBOGRAPHIE

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