La photosynthèse chez les cyanobactéries

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Mécanismes de protection

Les cyanobactéries font régulièrement face à la production de ces ROS. En tant que pionnières de la photosynthèse oxygénique, elles comptent également parmi les premiers organismes à avoir développé des défenses contre ces espèces. Ces mécanismes sont d’une complémentarité remarquable et interviennent à tous les niveaux de la chaîne photosynthétique (Figure 9).
Au niveau des phycobilisomes, le transfert d’énergie vers le PSII est court-circuité par un mécanisme dit de quenching non-photochimique ou NPQ (Figure 9). Il est essentiellement assuré par l’OCP (Orange Carotenoid Protein), une protéine photoactivable grâce au caroténoïde qu’elle lie. Lorsqu’elle est activée, elle se fixe au phycobilisome et dissipe alors l’énergie lumineuse incidente sous forme de chaleur [80,81]. Il a également été montré que la mobilité des phycobilisomes dans le cytoplasme leur permet de s’associer avec les deux photosystèmes. Lorsque le régime photosynthétique est modifié, ces transitions d’état équilibrent les activités de chaque photosystème et assurent ainsi leur synchronisation [82].
L’activité du PSII est largement tributaire des phycobilisomes et profite donc directement du NPQ. Il possède cependant des mécanismes de photoprotection propres qui améliorent sa résistance à l’oxydation. Son centre réactionnel est notamment entouré de nombreux caroténoïdes qui neutralisent l’oxygène singulet produit par le P680 [83]. De plus la protéine D1, très conservée chez les organismes photosynthétiques, a été sélectionnée pour sa sensibilité oxydative. En effet lorsqu’elle est oxydée, elle est sélectivement dégradée par des protéases photoactivables puis remplacée de novo sans nécessiter une déconstruction complète du photosystème [84]. Elle protège donc les autres constituants du complexe au prix d’un turnover élevé. Le PSII possède également un mécanisme de quenching photochimique au niveau du site QB. Le dimère de flavoprotéines (Flv2-4) peut s’y fixer pour limiter la réduction des plastoquinones. Il détourne alors les électrons pour réduire un substrat qui pourrait être l’oxygène [85-87].
Le PSI possède également des effecteurs spécifiques pour diminuer la pression d’excitation de son centre réactionnel. A l’instar du PSII et de ses antennes photosynthétiques, les fluctuations d’intensité lumineuse favorise l’association d’un dimère de flavoprotéines (Flv1-3) au PSI [88]. Celui-ci réduit alors le O2 en H2O sans produire de ROS [89].
L’exposition à une forte lumière déclenche aussi l’expression de l’opéron isiAB (Iron Stress- Induced) codant pour une protéine liant la chlorophylle (IsiA) et la flavodoxine (IsiB), un transporteur d’électron similaire à la ferrédoxine mais utilisant un cofacteur FMN à la place d’un centre Fe-S [90]. Chaque protéine IsiA, homologue à des sous-unités des centres réactionnels, lie 18 molécules de Chl a et s’oligomérise pour former de remarquables structures en couronne [91]. Ces anneaux protéiques se complexent alors à des trimères de PSI et en deviennent les antennes principales (Figures 9 et 10). Lorsqu’elles captent des photons, les molécules de chlorophylle liées s’excitent puis se relâchent en produisant de la chaleur [92].
En aval de la chaîne photosynthétique, différentes enzymes réoxydent les transporteurs d’électrons (ferrédoxine, thiorédoxine) et les cofacteurs réduits (NADH et NADPH). Ceci favorise la circulation des électrons ainsi que la relaxation des centres réactionnels excités et limite donc leur recombinaison avec l’oxygène. Le métabolisme central est un contributeur essentiel pour gérer ce pouvoir réducteur. Il sera décrit plus en détails chez Synechocystis à la fin de ce chapitre tandis que les grands principes de son fonctionnement et de sa régulation sont abordés dans le chapitre III.
Parfois ces voies métaboliques ne suffisent pas pour évacuer le surplus d’électrons mais il existe d’autres enzymes dédiées à cette fonction. Différentes oxydases membranaires assistent par exemple chaque chaîne de transport d’électrons (respiration et photosynthèse) et peuvent en détourner pour réduire l’oxygène en eau [93].
D’autres enzymes réorientent les électrons vers le pool de plastoquinones et entretiennent un flux cyclique d’électrons (CEF) entre le cytochrome b6f et le PSI (Figure 9).
En plus de contribuer au recyclage des équivalents réduits, cette voie sauvegarde le gradient de protons généré par le cytochrome et donc la synthèse d’ATP. Ce flux cyclique existe de manière constitutive et est essentiel pour la croissance d’Arabidopsis thaliana dans les conditions de laboratoire [94]. Il est stimulé par divers stress (oxydatif, osmotique, thermique…) et se décompose en 2 voies : celle utilisant les cofacteurs réduits (NADPH et/ou NADH) et celle utilisant la ferrédoxine. La première est largement dépendante de l’activité FNR (ferrédoxine-NADPH oxydoréductase) réduisant le NADP+ et est appelée la voie FNR [95]. Elle regroupe des enzymes de la respiration (NDH1, SDH) mais pourrait impliquer un transfert des électrons du NADPH vers les PQ opéré directement par la FNR. La seconde voie utilise la ferrédoxine comme donneur d’électrons et est réalisée par la ferrédoxine plastoquinone oxydoréductase Pgr5 [96]. L’hydrogénase joue également le rôle de valve à électrons [97] et sa contribution hypothétique au CEF est discutée dans le chapitre IV.
Il arrive cependant que les fluctuations métaboliques soient trop brusques et/ou trop importantes pour être compensées par ces mécanismes et produisent alors des ROS. Le système de détoxification le plus étudié est le relai superoxyde dismutase (SOD)/catalase (Figure 9). La première réduit le radical superoxyde en peroxyde d’hydrogène (H2O2) qui est ensuite décomposé par la catalase en H2O et O2. Malgré son efficacité, ce système n’empêche pas complètement l’altération des molécules biologiques. Les protéines et leurs thiols (groupements –SH des cystéines) sont particulièrement sensibles à ces oxydations et peuvent facilement perdre leur fonction. Le glutathion (GSH) est un tripeptide Glu-Cys-Gly non ribosomal assurant l’homéostasie des thiols [98]. Lorsqu’elle est perturbée, le glutathion s’oxyde (Figure 9) et se complexe aux cystéines endommagées pour les protéger d’une suroxydation irréversible [99]. Le GSH réduit est également le cofacteur des glutarédoxines (régénération des thiols glutathionylés) et des GSH peroxydases (détoxification du H2O2) et contribue à la tolérance de divers stress métalliques et métaboliques [100,101].

La cyanobactérie modèle Synechocystis PCC6803

Origine et écologie

Synechocystis sp. PCC6803 (abrégée ci-après Synechocystis) est une cyanobactérie unicellulaire (entre 1-2 μm de diamètre). Elle a été isolée en 1968 dans un lac d’eau douce en Californie et est disponible dans la collection de l’Institut Pasteur [102]. Son temps de génération en conditions standards du laboratoire (photoautotrophie) est compris entre 10 et 12 heures. C’est une bactérie motile qui, contrairement à d’autres espèces, ne produit pas de toxine. Les cellules de Synechocystis sont motiles et peuvent également s’organiser en biofilm via la production d’exopolysaccharides [103]. C’est une cyanobactérie euryhaline pouvant tolérer une salinité équivalente à 2-3 fois celle de l’eau de mer [104,105] ainsi que des pH élevés. Elle est également capable de croître en absence de photosynthèse en utilisant le glucose comme source de carbone et d’énergie mais requiert quelques minutes de lumière bleue tous les jours pour y parvenir. Elle peut aussi produire de l’hydrogène (H2) grâce à son hydrogénase (voir Chapitre IV) et peut utiliser de nombreuses sources d’azote pour soutenir sa croissance (nitrate, ammonium, urée…). Son uréase, décrite plus précisément dans le Figure 11 : Représentation du génome de Synechocystis sp. PCC 6803 composé d’un chromosome circulaire central et de sept plasmides (Source : Cyanobase; http://genome.annotation.jp/cyanobase/Synechocystis)

Propriétés génétiques et outils développés

Le génome de Synechocystis est l’un des premiers séquencés en 1996 [106]. Sa taille est d’environ 4 Mb et comprend un peu moins de 4000 gènes répartis sur un chromosome circulaire (3,57 Mb) et 7 plasmides de 2 à 120 kb (Figure 11). On dénombre approximativement 600 gènes homologues à des gènes de plantes dont 160 codant pour des protéines de fonction inconnue. En phase exponentielle de croissance, le chromosome est présent en 12 copies par cellule mais ce nombre varie selon la phase de croissance [107].
En 1970, Shestakov a montré que Synechocystis est naturellement transformable [108].
Cette propriété permet d’introduire des mutations dans le génome (délétion, remplacement de promoteurs, mutations ponctuelles…) de manière efficace par recombinaison homologue [107,109,110]. D’autres outils génétiques, notamment des vecteurs réplicatifs [111,112], ont été développés au laboratoire ou adaptés pour exprimer des gènes de différentes manières chez Synechocystis [113]. Ces systèmes d’expression peuvent par exemple reposer sur des promoteurs phagiques forts (surexpression), parfois associés à des systèmes de régulation (expression conditionnelle ou constitutive) ainsi que des sites de clonage générant des fusions de gènes (double-hybride bactérien, étude de localisation…).

De l’étude de la photosynthèse aux applications industrielles

Les gènes codant pour des protéines essentielles à la photosynthèse ne peuvent pas être délétés dans les espèces photoautotrophes strictes. Initialement, Synechocystis fut utilisée comme modèle d’étude de ce processus grâce à sa faculté de croître en hétérotrophie [114- 116]. Rapidement, les outils de manipulation génétique furent mis au point et contribuèrent à l’étude approfondie des photosystèmes. Synechocystis devint alors logiquement le modèle d’étude des cyanobactéries unicellulaires.
Plus tard, cette compréhension du métabolisme de Synechocystis lui donna un intérêt nouveau vis-à-vis des tendances en biotechnologies. En effet, au-delà d’être aisément manipulable, elle possède un potentiel biotechnologique important.
Synechocystis synthétise naturellement divers métabolites ayant un intérêt pour les sociétés humaines. Elle est par exemple capable d’accumuler des granules intracellulaires de poly-β-hydroxybutyrate (PHB), en particulier lors de carences nutritives. Après extraction, ces PHB peuvent être transformés en plastiques biodégradables. Elle produit également de petites molécules ou peptides qui présentant des activités antioxydantes, antivirales voire même anticancéreuses [117-119]. Enfin, elle synthétise de nombreuses molécules très énergétiques envisagées comme alternative aux énergies fossiles.
Parmi elles, on trouve des terpènes (précurseurs des pigments photosynthétiques) mais aussi du H2, produit et substrat de l’hydrogénase dont le fonctionnement et le rôle sont décrits dans le chapitre IV. Les approches de biologie synthétique permettent également de lui faire produire divers alcools comme l’éthanol, le butanol ou l’isobutanol.
Or la synthèse de tous ses composés intervient dans un métabolisme utilisant seulement de la lumière, du CO2, de l’eau et des minéraux et produit une biomasse facilement valorisable. Etant donné les limitations auxquelles font face les biotechnologies actuelles (décrites dans le chapitre II), ces propriétés trophiques sont éminemment intéressantes dans le cadre des biotechnologies de 3ème génération. Il serait cependant imprudent de considérer que l’ingénierie de tels métabolismes sera aisée. Nous disposons aujourd’hui de nombreux outils pour éditer les génomes et altérer les flux métaboliques. Mais les cyanobactéries modernes sont le fruit de presque 3 milliards d’années d’évolution et leur métabolisme est de ce fait contrôlé et coordonné par des systèmes de régulation extrêmement complexes. Cette robustesse repose notamment sur l’existence de mécanismes de réparation de l’ADN et de recombinaison qui éliminent efficacement les mutations fragilisant cette architecture métabolique.

Table des matières

Introduction
Chapitre I. Histoire des cyanobactéries : du façonnement de la biosphère aux enjeux biotechnologiques modernes
A. De la soupe primitive à la diversité biologique actuelle
1. La chimie prébiotique et les premiers processus biochimiques compartimentalisés
2. La photosynthèse et la Grande Oxydation
3. Diversité microbienne
B. De la soupe primitive à la diversité biologique actuelle
1. Les processus microbiologiques, alliés ancestraux des sociétés humaines
2. Essor des biotechnologies
C. Les biotechnologies vertes
1. Nouveaux enjeux et intérêts
2. Avantages majeurs des cyanobactéries
3. Exemples et limitations persistantes
a. La production de biocarburants
b. La production de petites molécules plateformes
c. Vers l’identification et la levée des verrous biologiques
Chapitre II. La photosynthèse chez les cyanobactéries
A. Les complexes photosynthétiques et mécanismes fonctionnels
1. Le phycobilisome : unité de capture des photons
2. Le photosystème II : séparation de charge et oxydation de l’eau
3. Le cytochrome b6f : pompe à protons et carrefour des électrons
4. Le photosystème I : réduction de la ferrédoxine
5. L’ATP synthase : production d’énergie chimique
B. Un processus puissant mais versatile
1. Le stress oxydant
2. Mécanismes de protection
C. La cyanobactérie modèle Synechocystis PCC6803
1. Origine et écologie
2. Propriétés génétiques et outils développés
3. De l’étude de la photosynthèse aux applications industrielles
D. Le métabolisme central
Chapitre III. La balance carbone/azote, équilibre vital mais fragile
A. La voie anabolique : le cycle de Calvin et sa régulation
1. Les enzymes majeures du cycle
a. La phosphoribulokinase (PRK)
b. La Ribulose-1,5-Bisphophate Carboxylase/Oxygénase (RuBisCO)
c. La glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH)
d. Régénération du ribulose-5-phosphate (Ru5P)
2. Régulation générale du cycle de Calvin
3. CP12, régulateur majeur de l’activité du cycle
a. Caractéristiques
b. Un mécanisme de régulation efficace
c. Diversité phylogénétique et rôle des protéines CP12
d. Le « switch » CP12 au service de l’ingénierie métabolique
B. Les voies cataboliques du carbone
1. Glycolyse, voies d’Entner-Doudoroff et des pentoses phosphates
2. Le cycle de Krebs et la respiration
3. Les réservoirs de carbone
C. Le métabolisme de l’azote
1. Voies de production de l’ammonium
a. Réduction assimilatrice du nitrate
b. Dégradation des acides aminés
c. Hydrolyse de l’urée
2. Incorporation du NH4
+ et cycle de l’urée
a. Synthèse des précurseurs azotés
b. Le cycle de l’urée
3. L’urée et l’uréase
a. Intérêts pour les biotechnologies
b. Organisation génomique des gènes codant pour les sous-unités de l’uréase et ses protéines de maturation
c. Fonction de l’uréase chez les cyanobactéries
D. La carence d’azote
1. Effets physiologiques et mécanismes de détection
2. Effecteurs et réponses à la carence en azote
a. Cascade de signalisation
b. Dégradation des réserves et chlorose
c. Coordination avec le métabolisme du carbone
Chapitre IV. Le dihydrogène, un composé énergétique aux propriétés attrayantes
A. Caractéristiques, applications et production biologique d’hydrogène
1. Caractéristiques
2. Applications actuelles et futures
3. Vers un carburant renouvelable
a. Enjeu de la production biologique de H2
b. Les hydrogénases
B. Organisation génomique, rôle et régulation : Revue I
C. Une compréhension partielle du métabolisme de l’hydrogène
1. Ubiquité des hydrogénases
2. Convergence structurale avec NDH-I et réseau des centres Fe-S
3. CP12 et les opérons hox
Résultats et discussion
I. CP12 n’est pas essentielle mais exerce un contrôle global du métabolisme en photoautotrophie
A. Construction des mutants de délétion et de surexpression du gène cp12
1. Construction du mutant de délétion Δcp12
2. Construction des mutants de surexpression TR-cp12 et CE-cp12
B. Absence d’effets sur la croissance et l’activité du cycle de Calvin
C. Analyse transcriptomique du mutant Δcp12
D. Capacité photosynthétique et perturbation rédox
E. Impact sur le métabolisme du carbone
II. En mixotrophie, CP12 structure les flux du carbone et est nécessaire pour maintenir l’équilibre carbone/azote
A. La présence de glucose engendre une insuffisance rédox photodépendante
B. Construction et analyse des mutants ponctuels WTr, Δ4Cys et ΔCore
C. Réponse transcriptionnelle du mutant Δcp12 en mixotrophie et implications
D. Analyse métabolomique
III. Apparition d’une mutation secondaire perturbant le métabolisme de l’urée dans le contexte génétique Δcp12
A. Le mutant Δcp12 n’est pas capable d’utiliser l’urée comme source d’azote
1. La croissance du mutant Δcp12 en milieu urée mime une carence d’azote
2. Influence de l’urée comme source d’azote sur le métabolisme
3. Le défaut de croissance du mutant Δcp12 en urée est dû à une mutation secondaire dans son génome
B. Compensation métabolique et interaction entre uréase et hydrogénase
C. Discussion complémentaire
IV. Surproduction de l’hydrogénase et sélection de mutants adaptés pour la croissance prolongée en dégradant l’urée
A. Objectifs, résultats et article
B. Résultats complémentaires et discussion
Conclusion et perspectives
Matériel et Méthodes
I. Matériel
A. Synechocystis sp. PCC6803
B. Escherichia coli
C. Plasmides
II. Méthodes
A. Biologie moléculaire
1. Extraction et purification des acides nucléiques
a. Resuspension et dosage des préparations
b. Extraction d’ADN génomique (ADNg) et plasmidique
c. Purification des fragments d’ADN
d. Extraction des ARN totaux
2. Ligation et transformation de E. coli par choc thermique
3. Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) et déclinaisons
a. PCR générique
b. PCR assemblage
c. PCR quantitative
4. Transcriptomique sur puce à ADN
B. Manipulation génétique chez Synechocystis
1. Inactivation de gène par transformation
2. Transfert de plasmide réplicatif par conjugaison
C. Tests de croissance
D. Mesure des pigments de Synechocystis
1. Evaluation globale
2. Extraction et dosage spectrophotométrique de la chlorophylle a
E. Dosages des activités enzymatiques
1. Activités PRK, GAPDH et G6PDH
2. Activité uréase
3. Activité hydrogénase
F. Etude in situ des processus cellulaires
1. Production et consommation du pouvoir réducteur
2. Production et consommation d’oxygène
G. Analyse des métabolites de Synechocystis
1. Dosage enzymatique du glutathion (GSH) intracellulaire total
2. Dosage enzymatique du glycogène
3. Quantification relative de métabolites par spectrométrie de masse
H. Méthodes de microscopie
1. Microscopie à fluorescence
2. Microscopie électronique à transmission
Références
Annexes
Annexe I : Etude comparative des systèmes de réparation et de recombinaison de l’ADN chez les cyanobactéries
Abstract
Résumé

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