La perte de suppresseurs de tumeurs

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La sénescence prématurée

Cependant, la sénescence peut être aussi déclenchée par d’autres stresses, dont la plupart aboutissent aussi à l’activation de la voie des dommages à l’ADN.

Les dommages à l’ADN

La présence d’extrémité libre d’ADN induit la cascade de réponses des dommages à l’ADN. L’activation des kinases ATM et ATR va phosphoryler le variant d’histone H2AX. La présence de ce variant d’histone phosphorylé va ensuite être responsable du recrutement de nombreuses protéines permettant d’ouvrir la chromatine, de propager et d’amplifier le signal de dommage à l’ADN. Les médiateurs vont ensuite interagir avec les protéines checkpoint du cycle cellulaire, les kinases CHK1 et CHK2. Cela aboutit à l’activation de p53 et des autres effecteurs (Figure 2).
Ces dommages peuvent être causés par des agents génotoxiques, tel l’étoposide (Leontieva & Blagosklonny, 2010), et être utilisé en chimiothérapie pour induire la sénescence dans des cellules cancéreuses (Roninson, 2003). L’exposition des cellules aux irradiations γ (Di Leonardo, Linke, Clarkin, & Wahl, 1994) ou aux UV (Lewis, Yi, Travers, & Spandau, 2008) peuvent aussi déclencher l’apparition de réponse aux dommages à l’ADN et l’induction de sénescence.
Figure 2 : Les voies de réponses aux dommages à l’ADN
Schéma présentant les mécanismes de détection des dommages à l’ADN et l’induction de sénescence associé.
Adaptée de (Campisi & d’Adda di Fagagna, 2007).

Le stress de culture

Des conditions de culture inadéquate peuvent aboutir à une sénescence prématurée (Coppe, Desprez, Krtolica, & Campisi, 2010; Sherr & DePinho, 2000).
On peut citer par exemple des faibles doses de H202 (Q. Chen & Ames, 1994) comme inducteur de sénescence. Il a été démontré (Parrinello et al., 2003) que diminuer la concentration du dioxygène en culture à des niveaux physiologiques, proche de 5%, permettait d’augmenter le nombre de doublement possible d’une population de fibroblastes murins en diminuant le stress oxydant, aussi capable d’induire la sénescence.

La perte de suppresseurs de tumeurs

La perte ou l’inactivation de suppresseurs de tumeurs, tel PTEN (Zhenbang Chen et al., 2005) ou NF1 (Courtois-Cox et al., 2006), peut aussi induire une sénescence prématurée (Figure 3).
Figure 3 : Voie d’induction de la sénescence par la perte de suppresseur de tumeurs Représentation des effets de la perte d’un gène suppresseur de tumeur et leurs mécanismes d’induction de sénescence. Adaptée de (Di Mitri & Alimonti, 2016)

L’activation d’oncogènes

La sénescence induite par les oncogènes est liée à l’expression d’un gène muté. Ce mécanisme a été mis en évidence pour la première fois après l’expression d’une forme oncogénique de RAS, contrôlant le transfert de signaux mitogènes dans la cellule (Serrano, Lin, McCurrach, Beach, & Lowe, 1997). Plus tard, il a été montré que d’autres membres de la cascade de signalisation des MAPK ont les mêmes propriétés d’induction de sénescence (Jeanblanc et al., 2012; Michaloglou et al., 2005). L’expression de ces gènes permettant normalement la stimulation des voies mitogéniques, la sénescence a été décrite comme un mécanisme de protection de ces cellules contre le risque de transformation oncogénique (Zhenbang Chen et al., 2005) (Figure 4).
Il existe des preuves in vivo de la réalité de la sénescence comme mécanisme de protection contre la tumorigénèse : les névi. Ces cellules expriment en majorité la mutation B-RAFV600E, une mutation activant constitutivement la kinase B-RAF, et présentent les caractéristiques des cellules sénescentes. Afin d’échapper à ces mécanismes de protections et permettre la transformation vers le mélanome, il est nécessaire que ces cellules acquièrent d’autres mutations (Dankort et al., 2009; McNeal et al., 2015; D. M. Miller & Flaherty, 2014).
Figure 4 : Modèle d’induction de sénescence après l’activation d’un oncogène
Schéma présentant les différents mécanismes aboutissant à l’induction de sénescence après activation d’un oncogène. L’hyper-réplication induit une accumulation des dommages à l’ADN, aboutissant à la sénescence par les mécanismes classiques des dommages à l’ADN. L’accumulation des ROS active les mêmes mécanismes d’induction de sénescence. On note aussi l’activation de ARF, un régulateur de p53. On observe aussi l’activation de la voie p16-Rb, qui induit la formation de SAHF, pouvant induire la sénescence. Enfin, l’expression du SASP est capable d’induire et de renforcer la sénescence. Tirée de (Reddy & Li, 2011)

Les autres inducteurs

Il existe d’autres moyens d’induire la sénescence. Un changement dans l’épigénome, et plus particulièrement dans le niveau d’acétylation des histones, augmenté par l’utilisation de Butyrate de Sodium ou la trichostatine A, conduit à une hyperacétylation provoquant un stress chromatinien. Ce stress sera caractérisé par l’apparition d’un phénotype sénescent. De même, il a été montré qu’une diminution du niveau de HDAC-1 était corrélée avec le nombre de passage de fibroblastes. Il semblerait donc que l’intégrité de l’épigénome et plus spécifiquement les modifications de la chromatine soient impliquées dans l’induction de sénescence (Bandyopadhyay et al., 2002; Place, Noonan, & Giardina, 2005).
Plusieurs études ont montrées que la présence de composés inflammatoires comme IL6, IL8, IGFBP7, IFN-β ou TGF-β étaient capable d’induire la sénescence de façon paracrine (Acosta et al., 2013; Moiseeva, Mallette, Mukhopadhyay, Moores, & Ferbeyre, 2006; Reimann et al., 2010)

Caractéristiques

Il est très difficile de définir une liste de caractéristiques communes aux cellules sénescentes. De la même façon, il est difficile de caractériser une cellule sénescente étant donné que les caractéristiques peuvent varier. Aujourd’hui, il n’existe pas une caractéristique unique permettant de qualifier une cellule l’arborant comme sénescente. Afin d’être capable d’identifier avec précision une cellule sénescente, on considère que des cellules présentant plusieurs combinaisons de caractéristiques présentées ci-après sont sénescentes.
Comme nous l’avons vu précédemment, il existe un grand nombre d’inducteurs de sénescence, dépendant d’un grand nombre de voies. De la même façon, il existe un nombre important de caractéristiques, certaines étant liées au type d’inducteur de sénescence, tandis que d’autres sont plus universelles (Figure 5).

L’arrêt du cycle cellulaire est le marqueur universel des cellules sénescentes.

Parmi les marqueurs de la sénescence, il faut dans un premier temps insister sur l’arrêt du cycle cellulaire. Cet arrêt est définitif et est considéré comme le seul marqueur universel de la sénescence. En effet, le nombre élevé d’inducteur de sénescence, associé aux nombreux types cellulaires pouvant devenir sénescents induit logiquement un grand nombre de réponses et de marqueurs différents.

Augmentation des CDKN du loci INK4 et de la voie p53/pRB

L’arrêt du cycle cellulaire est couplé avec l’activation des réseaux de signalisation suppresseurs de tumeurs, p53 et CDKN2A/p16 (Beauséjour et al., 2003). L’expression de p16, elle aussi dépendante du signal et du type cellulaire, est considérée comme un marqueur de sénescence. Dans des cellules normales, l’expression de p16 est faible ou nulle. L’activation de p16 aboutit à l’inhibition de la prolifération via l’activation de la protéine pRB.
$Figure 5 : Différents inducteurs et différentes caractéristiques
Les marqueurs de sénescence détectés in vivo dans des lésions néoplasiques humaines et murines. Les grandes familles de stresses permettant l’induction de sénescences sont regroupées par couleur. Puis dans chaque famille on retrouvera les différences selon les tissus, les stresses spécifiques et enfin les biomarqueurs, dont la légende est présente au milieu du schéma. Adaptée de (Kuilman, Michaloglou, Mooi, & Peeper, 2010)

Modification de la chromatine : SAHF

L’induction de la sénescence peut aussi induire un remodelage de la chromatine, qui va permettre l’inhibition de gènes pro-prolifératifs (Narita et al., 2003) au sein de foyers ponctuels d’hétérochromatine, appelé SAHF (Senescence Associated Heterochromatine Foci). Les SAHF sont formés par un repositionnement tridimensionnel de la chromatine, qui se réorganise en couches concentriques avec au centre des histones H3-K9me3, puis H3-k27me3 puis H3-k36me3, sans qu’il soit observé de redistribution majeure de ces marques le long des chromosomes (Chandra et al., 2013) et (Figure 6)
Figure 6 : Formation et composition des SAHF
En haut : Immunofluorescence présentant les foyers d’hétérochromatine induit en sénescence.
En bas : Composition des différentes marques d’histones dans les SAHF avec au centre H3K9me3, marque de l’hétérochromatine constitutive (en vert), puis des marques H3K27me3 correspondant à l’hétérochromatine facultative (en rouge) et enfin autour, des marques spécifiques de l’euchromatine, H3K36me3 (en bleu). Tirée de (Chandra et al., 2015; Chandra & Kirschner, 2016)

DNA SCARS

Comme nous l’avons vu précédemment, la présence de dommages à l’ADN persistants peut induire la sénescence. Les DNA-SCARS (DNA Segments with Chromatin Alteration Reinforing Senescence) contiennent un grand nombre de marqueurs des foyers de dommages à l’ADN, tel que 53BP1, phospho-ATM ou phospho-CHK2, et des corps PML (Rodier et al., 2011). La composition de ces foyers est différente de ceux se formant juste après les dommages.

Activité SA-ß-Galactosidase

Un des premiers marqueurs de sénescence à avoir été identifié est l’expression de Senescence Associated–ß-galactosidase (Dimri et al., 1995). Cette augmentation d’activité est liée à l’augmentation de la masse lysosomale. Cette activité a permis de mettre en évidence la présence de cellules sénescentes in vivo, et montrer une accumulation de cellules sénescentes avec l’âge (Figure 7).
Figure 7 : Cellules sénescentes positives au test SA-ß-Galactosidase
Microscopie présentant la différence d’intensité de signal entre des cellules en prolifération et des cellules sénescentes. Adaptée de (Vredeveld et al., 2012)
Cependant ce marqueur est aussi identifié dans des cellules quiescentes, dans certaines conditions de culture liées par exemple à une confluence très élevé, mais aussi dans le processus de maturation des macrophages (Brusuker, Rhodes, & Goldman, 1982; Hall et al., 2016; Holt & Grainger, 2012; Kurz, Decary, Hong, & Erusalimsky, 2000; Yegorov, Akimov, Hass, Zelenin, & Prudovsky, 1998). Ainsi, malgré le fait qu’il y a plus de 20 ans on pensait avoir découvert un marqueur spécifique de la sénescence, les expériences récentes ont montré qu’il n’était pas, seul, un marqueur fiable pour définir une cellule comme étant sénescente.

Modification morphologique

Parmi les changements visibles lié à la sénescence, on observe une modification de la morphologie des cellules, qui varie selon l’inducteur de sénescence. Les cellules peuvent présenter différents profils, avec par exemple des cellules étalées, plates et multinucléées pour des cellules induites en sénescences par H-Rasval12, le stress oxydant ou des dommages à l’ADN (Q. Chen & Ames, 1994; Parrinello et al., 2003; Serrano et al., 1997) ou des cellules fusiforme après l’expression de B-RAFV600E ou la répression de p400 (Chan, Narita, Lowe, & Livingston, 2005; Michaloglou et al., 2005).

Modification transcriptomique

L’arrêt du cycle cellulaire entraîne, de façon inéluctable, une modification du transcriptome. On note entre autre la répression de E2F1 et d’autres gènes permettant la progression des cellules dans le cycle cellulaire comme les cyclines, c-Fos, … (Mason, Jackson, & Lin, 2004). On observe aussi la dérégulation des CKI CDKN2A et CDKN1A.
Cette modification ne touche cependant pas que des gènes liés au cycle cellulaire et à l’arrêt de prolifération. On trouve aussi un grand nombre de microARNs régulé lors de l’entrée en sénescence (Bischof & Martínez-Zamudio, 2015; Noren Hooten et al., 2010). Ces microARNs peuvent moduler un grand nombre de processus cellulaires, comme la répression du cycle cellulaire par miR-21 (Benhamed, Herbig, Ye, Dejean, & Bischof, 2012; Dellago et al., 2013) ou le contrôle des gènes de l’inflammation (Olivieri et al., 2013)
Un grand nombre de cellules sénescentes surexpriment des gènes codants pour des protéines secrétées (Kuilman & Peeper, 2009; Trougakos, Saridaki, Panayotou, & Gonos, 2006), que l’on détaillera de façon plus complète dans le paragraphe suivant.

SASP

Les cellules sénescentes secrètent des centaines de composés parmi lesquels on trouve des composés pro-inflammatoire tels les cytokines, chimiokines, des facteurs de croissance ou des protéases (Coppe et al., 2010; Kuilman & Peeper, 2009). L’ensemble de ces composés est appelé généralement SASP pour Senescence Associated Secretory Phenotype, mais on trouve aussi parfois l’appellation SMS (Senescence-Messaging Secretome).

Régulation du SASP

Le SASP est une combinaison de plusieurs composés, exprimés différentiellement selon le type cellulaire et l’inducteur de sénescence. Cependant, certains mécanismes par lesquels l’expression et la sécrétion de ces différents composés peuvent être partagés. NF-κB est le régulateur majeur des éléments du SASP (Acosta et al., 2008; Kuilman et al., 2008). Plusieurs voies sont impliquées dans l’induction du SASP telles que les dommages à l’ADN (Rodier et al., 2009), l’activation de la voie mTOR (Laberge et al., 2015) ou de p38-MAPK (Freund, Patil, & Campisi, 2011). En 2017, deux équipes différentes ont identifié cGAS/STING comme pouvant être responsable de l’expression des gènes du SASP (Dou et al., 2017; Glück et al., 2017). Le complexe cGAS/STING est un composant du système immunitaire inné permettant la détection d’ADN cytosolique et le déclenchement de la réponse inflammatoire via la stimulation des gènes interférons (Stimulation of INterferon Genes).

Table des matières

Introduction
1. La sénescence
1.1 Les différents inducteurs de sénescence
1.1.1 La sénescence réplicative
1.1.2 La sénescence prématurée
1.1.2.1 Les dommages à l’ADN
1.1.2.2 Le stress de culture
1.1.2.3 La perte de suppresseurs de tumeurs
1.1.2.4 L’activation d’oncogènes
1.1.2.5 Les autres inducteurs
1.2 Caractéristiques
1.2.1 L’arrêt du cycle cellulaire est le marqueur universel des cellules sénescentes.
1.2.2 Augmentation des CDKN du loci INK4 et de la voie p53/pRB
1.2.3 Modification de la chromatine : SAHF
1.2.4 DNA SCARS
1.2.5 Activité SA-ß-Galactosidase
1.2.6 Modification morphologique
1.2.7 Modification transcriptomique
1.2.8 SASP
1.2.8.1 Régulation du SASP
1.2.8.2 Rôle du SASP
1.2.9 Résistance à l’apoptose
1.2.10 Histone H2A.J
1.3 Rôle de la sénescence in vivo
1.3.1 Rein
1.3.2 Diabète de type II
1.3.3 Fibrose pulmonaire idiopathique
1.3.4 Stéatose hépatique non alcoolique
1.3.5 Système cardiovasculaire
1.3.6 Système immunitaire
1.3.7 Cachexie liée à l’âge
1.3.8 Cancer
2. Glucocorticoïdes
2.1 Mécanismes d’actions
2.1.1 Actions Génomiques
2.1.2 Action Non-Génomiques
2.2 Effets in vivo et en médecine humaine
2.2.1 Effets sur le métabolisme du glucose et le fonctionnement du foie
2.2.2 Effets respiratoires et cardiovasculaires
2.2.3 Effets musculosquelettiques
2.2.4 Effets immunitaires
2.2.5 Effets sur la peau et affections cutanées
2.3 Glucocorticoïdes et sénescence
3. MAPK
3.1 Rôle des voies MAPK
3.2 Différentes voies MAPK
3.2.1 La voie p38
3.2.2 La voie JNK
3.2.3 La voie ERK
4. Névi et mélanome
4.1 Formation des névi
4.2 Du névi au mélanome
5. EGR-1
5.1 Expression et régulation de EGR1
5.2 Fonction de EGR-1
5.3 EGR1 et sénescence
5.4 EGR1 et glucocorticoïdes
Résultats
1. Induction de sénescence par B-RAFV600E
2. Effet des glucocorticoïdes sur la sénescence
3. Modulation de la voie MAPK
4. Rôle de la voie NF-κB
5. Effets du clobetasol sur les CKI
6. Effets transcriptomiques du clobetasol et identification de cibles
7. EGR-1 et CKI
8. EGR-1 et échappement de sénescence
9. Création de la lignée KO EGR1
10. Effets du KO de EGR1 sur l’induction de sénescence
11. Effet des glucocorticoïdes en l’absence de EGR1
12. Cellules KO EGR1, glucocorticoïdes et induction de CKI
13. Expériences préliminaires
13.1 Glucocorticoïdes et échappement de sénescence
13.2 Résultat préliminaire de ChIP contre EGR1
13.3 H2A.J dans la sénescence induite par B-RAFV600E
Discussions et Conclusions
1. B-RAFV600E
2. Glucocorticoïdes
3. EGR1
4. Conclusion générale
Perspectives
1. Rôle de EGR1 dans l’induction de la sénescence
2. Autres mécanismes d’action des glucocorticoïdes
3. Se rapprocher du in vivo
4. Les glucocorticoïdes en médecine humaine
Matériels et méthodes
1. Cellules, expression d’oncogène et conditions de culture cellulaire
2. Traitements et drogues utilisées
3. Microscopie haut débit, inversé et immunofluorescence
4. ARN : extraction, RT, qPCR et séquençages hauts débits
5. Identification des gènes cibles de NF-κB
6. SiRNA
7. Western Blot
8. CrispR cas9
9. Chromatin Immuno-Precipitation
Bibliographie

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