LA PERITONITE INFECTIEUSE FELINE

LA PERITONITE INFECTIEUSE FELINE

Prophylaxie sanitaire

Les mesures suivantes concernent essentiellement les chatteries et les élevages. La vente d’un chaton infecté constitue un vice rédhibitoire ; un seul test positif vis à vis des Coronavirus est suffisant pour faire valoir ses droits au vendeur (loi du 22 juin 1989, arrêté du 2 août 1990- article 285 du code rural) ((4) et (27)). Pour les chatteries saines, il faut éviter la surpopulation (pas plus de trois chats par litière) et entretenir convenablement les litières, réaliser des quarantaines de deux mois avec deux contrôles sérologiques négatifs avant l’introduction permet de limiter l’infection (1). De plus, il faut différer l’introduction d’un chaton jusqu’à ce qu’il puisse subir un test et que celui-ci soit interprétable : 12 semaines d’âge pour un test sérologique (22). La RT-PCR n’est pas utilisée pour l’instant dans ce cadre vue la possibilité d’excrétion et de virémie intermittentes ((5) et (15)). Le personnel soignant et le matériel doivent être soumis aux mesures d’hygiène habituelle : lavage des mains, utilisation de pédiluves, désinfection avec des produits usuels, …

Au sein d’un élevage infecté, la lutte contre l’infection est très difficile : toute chatterie présentant une infection enzootique par un Coronavirus risque de voir se développer un jour une PIF au sein de son élevage ou chez des chatons vendus à l’extérieur ((1) et (21)). La première mesure à prendre est d’interdire tout échange avec l’extérieur, en arrêtant les expositions et les saillies (27). La source principale de contamination étant la voie oro-fécale, il est nécessaire de veiller à une hygiène stricte avec notamment mise en place d’une litière pour deux chats au plus et nettoyage quotidien des litières. L’environnement doit être aussi pris en compte afin de limiter la persistance de Coronavirus dans le milieu extérieur : lavage des sols, des murs, hygiène du personnel … (28) Il est fortement conseillé de réaliser des contrôles sérologiques réguliers sur l’ensemble de l’effectif ; si les mesures sont efficientes, la plupart des chats vont être capable d’éliminer le virus et de retrouver un statut d’indemne ; toutefois les chats restant positifs au delà d’un an doivent être considérés comme infectés chroniques et faire l’objet de recherche par RT-PCR de virus dans les matières fécales ((5) et (15)).

En ce qui concerne les chatons, l’idéal est d’arrêter la reproduction afin de conserver un effectif faible, de limiter les contacts étroits au moment des saillies et la contamination des nouveaux animaux. Jusqu’à l’âge de 4-5 semaines les anticorps maternels permettent une protection efficace du chaton ; leur concentration sanguine commençant à diminuer à 6 semaines d’âge, le sevrage précoce (4 à 5 semaines) semble être une bonne méthode visant à limiter les risques d’infection, la contamination se faisant majoritairement par la mère chez le chaton (5).

Migration sur gel d’agarose

Le gel est constitué de 200 mL de TBE (Triborate d’EDTA) et de 2g d’agarose. Ce premier mélange est chauffé au micro-onde 5 minutes afin de bien dissoudre l’agarose. Ensuite on ajoute une goutte de BET (bromure d’Ethidium) à cette solution d’agarose à 1%. On laisse refroidir le tout avant de le déposer dans un bloc plastique contenant un peigne ; en le retirant, des puits apparaissent. 12μL du contenu de chaque tube ayant subi la RT-PCR sont mélangés à 3μL de bleu de bromophénol. Ainsi 15 μl sont déposés dans chaque puit. Le premier puit va contenir 5μL de marqueur qui servira d’échelle de taille après migration. Le bloc contenant le gel est constitué d’une anode et d’une cathode ; les puits sont situés à la cathode afin que les produits déposés migrent vers l’anode (ainsi les ADN, chargés négativement, migrent vers la borne positive).

Les bornes sont reliées à un générateur développant un courant 200mA d’intensité en appliquant une tension de 70V, et ce pendant 40min. Une fois la migration finie, le gel est déposé sur une plaque transparente placée au-dessus d’une source de rayons ultra violets ; ainsi sont révélées les différentes migrations de chacun des ADN obtenus par RT-PCR.

Gènes M et N

Afin de mieux caractériser les souches virales circulant chez ces animaux et de différencier les souches de FCEV des souches de CCV, nous avons étudié les séquences des gènes M et N. La RT-PCR était la méthode de choix pour amplifier ces gènes avant de les cloner et de les séquencer. Les RT-PCR sur les gènes M et N, ont été réalisées à partir de tous les échantillons (et pas seulement à partir de ceux qui donnent un résultat positif sur la séquence consensus) pour éviter de passer à côté des faux négatifs (on ne connaît pas la sensibilité de la première RTPCR). Pour le gène M, les amorces utilisés en première intention ont été 5’ext et 3’ext : elles nous ont permis d’amplifier le gène M en entier ; sa taille est de 802 paires de bases.

En cas d’échec, nous avons effectué une RT-PCR avec les amorces 5’ext et 3’int qui ne permettent d’amplifier qu’un fragment du gène M (sa taille est de 360 paires de bases). Pour le gène N les amorces utilisées en première intention ont été 5’ext et 3’ext : elles nous ont permis d’amplifier le gène N en entier (sa taille est de 1150 paires de bases). En cas d’échec avec les amorces précédentes, nous avons utilisé les amorces 5’cons et 3’cons qui permettent d’amplifier un fragment du gène N (sa taille est de 400 paires de bases).

Echantillons issus de chats

Les analyses qui suivent démontrent l’existence de deux types de séquences différentes, la première rassemblant les échantillons 3, 5, 7, 15, 16 et 18 dont les séquences isolées sont plus proches du FECV classique ; la deuxième qui rassemble les échantillons 6, 8, 12, et 17 dont les séquences isolées s’avèrent être plus proches du CCV et du TGEV que du FECV. L’alignement des séquences nucléotidiques montre que pour la séquence du gène N des chats n°3, 5, 7, 15, 16 et 18, on retrouve 87 à 94% d’homologie avec les séquences de FECV classique (79-1683, 79-1146 et UCD1) contre 66 à 77% avec les séquences de CCV classiques et 64 à 77% avec le TGEV. Concernant les échantillons 6, 8, 12, et 17, on retrouve bien plus d’homologie avec les séquences de CCV classiques, soit 85 à 89% contre 73 à 78 % avec les séquences de FECV. Pour ces chats la séquence du gène N est même plus proche de celle du TGEV avec 85% d’homologie pour l’échantillon 12 et 98 à 99% d’homologie pour les autres chats.

Etude du taux d’infection à Coronavirus chez les chats vivant chez des particuliers dans une clinique de la région parisienne en 2004

Nous avions pour objectif de développer une méthode de RT-PCR appliquée aux Coronavirus du groupe 1 au sein du laboratoire de virologie de l’ENVA, dans le but de détecter les animaux infectés et d’étudier le taux d’infection dues aux Coronavirus chez les chats de particuliers au sein d’une clinique de la région parisienne en 2004. Nous avons utilisé des amorces déjà décrites dans la littérature (21) qui ne sont pas spécifiques des Coronavirus félins mais permettent d’amplifier une séquence très conservée au sein des Coronavirus du groupe 1. La séquence amplifiée est appelée séquence consensus. Il s’est avéré que 13% des animaux de l’étude étaient excréteurs en Coronavirus et que 16% possédaient des anticorps dirigés contre les Coronavirus. Notre test de référence était auparavant la sérologie par immunofluorescence indirecte. Or les résultats obtenus avec la RT-PCR sur selles ont concordé significativement avec les résultats obtenus par la méthode sérologique ( kappa >0,75) ; ainsi nous avons pu garder la RTPCR sur selles pour notre deuxième étude (sur la circulation virale).

En revanche la RT-PCR sur sang n’a pas donné de résultats concordants avec ceux de la sérologie, ni même avec ceux de la RT-PCR sur selles (kappa proche de 0 pour les deux tests de concordance). De plus seuls 6% des chats testés se sont avérés virémiques et aucun n’a été testé positif pour les deux autres tests. L’hypothèse la plus plausible pouvant expliquer cette observation serait que les chats concernés seraient en tout début d’infection : ils connaîtraient une première période de virémie, transitoire et non associée à une réponse immunitaire ni à une excrétion virale fécale. Nous n’avons pas été en mesure de pouvoir vérifier cette hypothèse car il n’a pas été possible de faire revenir les chats virémiques à la clinique. La RT-PCR sur selles est très spécifique des infections à Coronavirus du groupe 1 mais elle ne l’est pas pour les Coronavirus félins ; de plus aucune étude n’a permis de déterminer la sensibilité ou la spécificité de la sérologie par immunofluorescence indirecte qui était notre test de référence.

Ainsi nous ne pouvons conclure qu’à un taux d’infection apparent, qui avoisinerait 13% (selon les résultats de la RT-PCR sur selles) et 16% (selon les résultats de la sérologie), pour les chats de particulier de cette clinique en 2004. A l’échelle des populations testées, nous avons montré que le taux d’infection à Coronavirus chez les chats de particuliers était inférieur au taux de prévalence chez les chats vivant en collectivité (80 à 90% lors d’infections enzootiques). Cette information, bien que largement admise, n’avait pas encore été vérifiée sur le terrain. Un autre biais de notre étude vient du fait que nous n’avons gardé que les chats pour lesquels la prise de sang et l’écouvillonnage rectal avaient été réalisés. Ainsi, 32% des chats, pour lesquels il n’avait été possible de réaliser que l’un des deux prélèvements, n’ont pas fait partie de l’étude ; on ne peut donc exclure un biais (involontaire) d’échantillonnage au sein de la population étudiée et donc un défaut de représentativité. Par ailleurs, cette étude ne peut donner lieu à quelque extrapolation que ce soit en dehors du contexte précis de cette clinique durant la période considérée.

Table des matières

INTRODUCTION
PREMIERE PARTIE BIBLIOGRAPHIQUE : ETUDE GENERALE DE LA PERITONITE INFECTIEUSE FELINE
I. VIROLOGIE
1. Morphologie
2. Classification des Coronavirus félins
3. Propriétés physico-chimiques
4. Biologie
• Multiplication virale
• Antigénicité
• Franchissement de barrière d’espèce
II. LA PERITONITE INFECTIEUSE FELINE
1. Pathogénie
2. Epidémiologie
• Epidémiologie descriptive
• Epidémiologie analytique
• Epidémiologie synthétique
3. Symptômes
4. Lésions
5. Diagnostic
• Diagnostic différentiel
• Imagerie médicale
• Analyse du liquide d’épanchement
• Tests biochimiques sanguins
• Numération formule sanguine
• Histologie
• Sérologie
• Amplification du génome viral
• Algorithme décisionnel en cas de suspicion de PIF
6. Thérapeutique
7. Prophylaxie
8. Pronostic
9. Conclusions et Perspectives
PRESENTATION DES DEUX PROJETS D’ETUDE DEUXIEME
PARTIE EXPERIMENTALE
I. MATERIEL ET METHODES
1. Les animaux
• Première étude sur le taux d’infections à Coronavirus chez les chats de particulier
• Deuxième étude sur la circulation de Coronavirus en collectivité
2. Les prélèvements
3. Méthode de titrage des anticorps anti-coronavirus par immunofluorescence indirecte
4. Techniques moléculaires
• Extraction des ARN viraux leucocytaires à partir de sang total
• Extraction des ARN viraux à partir d’écouvillons rectaux
• RT-PCR
• Clonage des gènes
• Séquençage et analyse phylogénétique
5. Tests statistiques
II. RESULTATS
1. Etude du taux d’infections à Coronavirus chez des chats de particuliers asymptomatiques
2. Etude de la circulation virale de Coronavirus entre des chiens et des chats en bonne santé en contact au sein d’une SPA
• Résultats des RT-PCR o Séquence consensus o Gènes M et N
? Gène M
? Gène N
• Résultats des clonages
• Résultats des analyses de séquence o Pour le gène M o Pour le gène N Bilan
III. DISCUSSION
1. Etude des infections à Coronavirus chez les chats de particuliers dans une clinique de la région parisienne en 2004 2. Etude de la circulation virale au sein d’une SPA
CONCLUSION
BIBLIOGRAPHIE

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