Soutenance mémoire
La paroi végétale et ses constituants
La paroi végétale
La paroi qui entoure la membrane plasmique des cellules végétales permet à la cellule de croître et d’avoir une certaine plasticité grâce à sa structure et sa complexité, détaillée plus bas dans ce chapitre (Chundawat et al. 2011). La paroi constitue également une structure rigide autour des cellules ce qui permet le maintien de leur forme. Cette structure rigide est possible grâce à la pression osmotique qui crée une force de tension sur la paroi (Somerville et al. 2004 ; Cosgrove 2005). La paroi végétale permet aussi de résister aux infections par des agents pathogènes. En effet, en réponse à des pathogènes, la cellule végétale produit des polysaccharides résistants aux attaques enzymatiques tels que la callose, qui est un β-1,3- glucane (Aist 1976 ; Vorwerk, Somerville, et Somerville 2004 ; Underwood 2012). Les cellules végétales produisent aussi des protéines, comme des chitinases, qui se retrouveront dans la paroi végétale et pourront dégrader la chitine présente dans les parois des champignons et ainsi opposer une résistance à ceux-ci (Vorwerk, Somerville, et Somerville 2004). La paroi des jeunes cellules doit aussi être poreuse afin de laisser passer l’eau, les nutriments et les hormones nécessaires à la vie des cellules (Burton, Gidley, et Fincher 2010).
Cette paroi est essentiellement composée de polysaccharides (pour plus de 80%), de protéines glycosylées et de lignines (10 à 25%) (figure 1). Elle se divise en deux grandes parties distinctes : la paroi primaire d’une part et la paroi secondaire d’autre part. La paroi primaire est la première à être synthétisée et est composée de cellulose, d’hémicelluloses et de pectines (figure 1A) (Cosgrove 2005). La paroi secondaire est synthétisée dans un deuxième temps et vient s’intercaler entre la membrane plasmique et la paroi primaire. Elle se compose de cellulose, d’hémicelluloses et de lignines et est plus épaisse et rigide que la paroi primaire (Somerville et al. 2004). La paroi secondaire se divise en trois parties appelées S1, S2 et S3. La partie S1 est la plus externe située juste sous la paroi primaire et se distingue des deux autres par la présence d’hélices de microfibrilles de cellulose. La partie S2 est la partie centrale et la partie S3 est la plus interne. Ces deux parties ne possèdent pas d’hélices de microfibrilles de cellulose (figure 1B) (Pérez et al. 2002).
Les polysaccharides sont donc les constituants principaux de la paroi et représentent la plus grande source renouvelable de carbone de la planète. Parmi ceux-ci, la cellulose est le polysaccharide majeur de la paroi végétale (40 à 60 %) devant les polysaccharides dits « noncellulosiques » que sont les hémicelluloses (20 à 40 %) et les pectines (environ 35 %). Les protéines présentes dans la paroi sont, pour certaines, impliquées dans le remodelage de celle-ci (Somerville et al. 2004 ; Cosgrove 2005). Autour de la paroi se trouve la lamelle moyenne, riche en pectines et impliquée dans l’adhésion et les jonctions cellulaires (Mohnen 2008).
La cellulose
La cellulose est le polymère le plus abondant sur Terre. Sa structure et sa biosynthèse sont bien caractérisées. Les microfibrilles de cellulose sont synthétisées dans la membrane plasmique parallèlement aux microtubules du cytosquelette ce qui permet à la paroi de s’adapter à la croissance des cellules végétales notamment en ce réorganisant. Cette réorganisation est rendue possible par la présence de protéines dans la paroi végétale (Bashline et al. 2014). En effet, l’orientation de la cellulose est dépendante de celle des microtubules car les protéines synthétisant la cellulose sont liées aux microtubules et se déplacent le long de ceux-ci (Crowell et al. 2011 ; Chan et al. 2011). Les protéines qui fabriquent les microfibrilles de cellulose sont des celluloses synthases (CESA) et sont organisées en hexamères puis en hexamères d’hexamères, appelés rosettes, dans la membrane plasmique (figure 1A) (Somerville et al. 2004 ; Cosgrove 2005 ; Bashline et al. 2014). La cellulose est un polysaccharide linéaire composé d’unités D-glucopyranosyle liées en β-1,4 (figure 2A). La structure secondaire de la cellulose peut s’assimiler à une hélice à 2 résidus par tour, avec un pas de 10,4 Å et une translation axiale de 5,2 Å par résidu. La structure tertiaire de la cellulose est constituée d’une association parallèle des chaînes polysaccharidiques en microfibrilles de 3 à 5 nm de diamètre (Cosgrove 2005). Ces microfibrilles sont réparties tout autour de la cellule dans la paroi et sont extrêmement résistantes aux attaques mécaniques et enzymatiques en raison de leur grande stabilité due à leur organisation cristalline (Quiroz-Castañeda et Folch-Mallol 2013) (Várnai et al. 2014). La cellulose est majoritairement sous forme cristalline dans laquelle viennent s’insérer des régions dites amorphes (5 à 20 %) (figure 2B). Les régions cristallines sont caractérisées par une structuration très organisée des microfibrilles maintenues par de nombreuses liaisons hydrogène intra et intermoléculaires ainsi que par des interactions de van der Waals (Béguin et Lemaire 1996 ; Quiroz-Castañeda et Folch-Mallol 2013). La perte de ces interactions conduit à la formation de régions amorphes moins structurées (Quiroz-Castañeda et FolchMallol 2013).
Les hémicelluloses
Les hémicelluloses sont un groupe hétérogène de polysaccharides ramifiés. En effet, elles présentent différents squelettes polysaccharidiques : glucanes, xylanes, mannanes, glucomannanes et β-(1→3,1→4)-glucanes. Des unités osidiques liées en β-1,4 et une position équatoriale des hydroxyles portés par les carbones en positions C1 et C4 (Scheller et Ulvskov 2010) font partie des caractéristiques communes aux différentes structures qui constituent les hémicelluloses. Les ramifications peuvent être constituées de différentes unités osidiques : du glucose, du galactose, de l’arabinose, du mannose, du xylose, du rhamnose, des acides glucuroniques… Ces polysaccharides peuvent aussi être estérifiés, avec formation de groupements acétyl-esters et féruloyl-esters, sur la chaîne principale ou sur les ramifications. Ces polysaccharides sont composés de monosaccharides neutres permettant leur liaison à la cellulose par l’intermédiaire d’un réseau de liaisons hydrogène, les chaînes d’hémicelluloses s’enroulant autour des fibres de cellulose (Cosgrove 2005 ; Bashline et al. 2014). Les hémicelluloses peuvent aussi se lier de façon covalente aux pectines (Cosgrove 2005 ; Bashline et al. 2014). Cette association permet la formation d’un réseau de polysaccharides dans la paroi et de diminuer la résistance mécanique de celle-ci en empêchant l’agrégation de la cellulose, facilitant ainsi l’expansion de la paroi (Somerville et al. 2004). Les hémicelluloses sont synthétisées dans l’appareil de Golgi par des enzymes dénommées « celluloses synthases like » (CSL) (Driouich, Faye, et Staehelin 1993) et sont ensuite sécrétées par le biais d’un trafic de vésicules allant de l’appareil de Golgi à la membrane (Driouich et al. 2012 ; Bashline et al. 2014). Les hémicelluloses les plus communes sont le xyloglucane, les glucurono(arabino)xylanes et les glucomannanes dans des proportions différentes en fonction du type de plante ainsi que de l’organe (tige, graine, fruit …) (Somerville et al. 2004 ; Cosgrove 2005 ; Scheller et Ulvskov 2010 ; Bashline et al. 2014). Les hémicelluloses sont moins bien caractérisées et moins valorisées que la cellulose. Les hémicelluloses étant plus complexes que la cellulose, elles nécessitent un plus grand nombre et une plus grande variété d’enzymes pour totalement les hydrolyser (Cosgrove 2005).
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Table des matières
Introduction générale
I. Préambule
II. La paroi végétale et ses constituants
A. La paroi végétale
B. La cellulose
C. Les hémicelluloses
1. Les xyloglucanes
2. Les xylanes
3. Les glucomannanes
4. Les β-(1→3,1→4)-glucanes
D. Les pectines
E. La lignine
III. Dégradation des polysaccharides de la paroi végétale
A. La base de données CAZy
B. Les glycosides hydrolases
C. Carbohydrate estérases (CE)
D. Enzymes à activité auxiliaire (AA)
E. Modules de liaison aux glucides (CBM)
F. Exemple de la dégradation totale d’un arabinoxylane
1. Les endo-β-1,4-xylanases
2. Les β-xylosidases
3. Les α-L-arabinofuranosidases
4. Les α-glucuronidases
5. Les carbohydrate estérases (CEs)
IV. Les systèmes de dégradation de la biomasse végétale, des réservoirs naturels d’enzymes
A. Le microbiote intestinal humain
B. Le rumen bovin
C. Les champignons
D. Les vers de terre
E. Les termites
V. L’exploration de la diversité
A. La métagénomique fonctionnelle
B. La métagénomique
C. La métagénomique 16S
D. Le RNA seq ou « transcriptome sequencing »
E. Comparaison de ces méthodes
VI. Projet de thèse
I. Annotation des banques métagénomiques de termites
A. Assemblages puis sélection des contigs
B. Recherche des cadres ouverts de lecture
C. Annotation fonctionnelle et taxonomique
II. Etude structurale et fonctionnelle de GH*
A. Sous clonage
B. Recherche des meilleures conditions pour l’expression de GH*
C. Purification
1. Chromatographie d’affinité sur ions métalliques immobilisés (IMAC)
2. Chromatographie d’exclusion-diffusion
D. Fluorimétrie différentielle à balayage
E. Recherche de l’activité de GH*
1. Activité sur pNP-substrats
2. Activité de phosphorolyse sur oligosaccharides
3. Activité sur polysaccharides
F. Chromatographie échangeuse d’anion à haute performance couplée à un système de détection ampérométrique pulsée (HPAEC-PAD)
G. Détermination des paramètres optimaux
H. Cristallisation
I. Congélation des cristaux et collecte de données
J. Détermination de la structure de GH*
Conclusion générale
