La méthylation de l’ADN

La cohorte familiale d’asthme du Saguenay−Lac-Saint-Jean

Travailler avec ce type de population, soit une population à effet fondateur, permet d’avoir un paysage génétique plus uniforme. En d’autres termes, une telle population présente une plus grande homogénéité génétique soit une plus grande uniformité comparativement à une population dite cosmopolite où l’apport génétique est plus diversifié [152]. Il faut toutefois comprendre qu’homogène ne signifie pas similaire. Il ne faut donc pas confondre cette caractéristique avec le coefficient de consanguinité. En effet, ce coefficient peut être calculé pour mesurer le taux d’apparentement entre les individus d’une même population et d’y mettre en évidence les unions entre individus issus de la même famille [111]. Il est important de le préciser puisque le coefficient de consanguinité proche des individus du SLSJ est comparable aux valeurs obtenues pour les autres régions du Québec contrairement à ce que laisse entendre la croyance populaire [154]. Cette homogénéité génétique est donc attribuable au triple effet fondateur et au haut taux de fécondité de la population qui a permis son accroissement rapide.

La cohorte familiale d’asthme du SLSJ a été construite à partir de 1997 et le recrutement initial s’est amorcé en 1999, à la suite de la mise en place du profil expérimental et de l’approbation des documents éthiques pour les personnes majeures et mineures. L’évaluation des participants s’est étendue jusqu’en 2002 [147]. Cette cohorte a été bâtie grâce au recrutement de participants asthmatiques, soit les probands, ainsi qu’aux membres de leurs familles; d’abord les individus apparentés de premier degré (famille nucléaire), puis la famille élargie lorsque ceux-ci souhaitaient participer. Au total, la cohorte comprend donc 394 individus répartis en 271 familles multigénérationnelles différentes comptant au moins 2 générations et un maximum de 4. Les parents des individus asthmatiques devaient impérativement faire partie de la cohorte pour que chaque famille comprenne un trio et au moins 2 générations. Pour chacun des participants, des échantillons de sang ont été recueillis en plus de recueillir des informations sur leur santé générale et respiratoire puis leurs habitudes de vies à l’aide de questionnaires standardisés modifiés de l’American Thoracic Society (ATS). Le statut asthmatique des individus a été déterminé grâce à des tests de la fonction respiratoire (provocation bronchique à la métacholine, spirométrie avant et après inhalation d’un bronchodilatateur (pré-, post-BD)).

Le statut allergique a également été déterminé grâce à un test d’allergie cutané à la piqûre. Il a donc été possible de recueillir plus de 200 caractéristiques qualitatives ou quantitatives pour la majorité des participants de la cohorte. Certaines sont présentées dans le Tableau 1 suivant. Il est important de mentionner que les données sont disponibles que pour 1214 individus puisque certains participants ont refusé de participer à certaines portions du processus de recrutement. Néanmoins, il s’agit d’une cohorte bien documentée en termes de caractéristiques phénotypiques. Les informations et les échantillons biologiques recueillis ont notamment permis l’utilisation de cet échantillon dans l’étude d’autres traits qui ne sont pas associés à l’asthme ou à l’allergie. À titre d’exemple, la cohorte familiale d’asthme du SLSJ a été utilisée en 2015 dans une étude sur les troubles bipolaires [155].

Hypothèse et objectifs

L’asthme est une maladie respiratoire chronique commune qui affecte une grande portion de la population, dont 2,4 millions d’individus seulement au Canada [3]. Comme sa prévalence ne cesse d’augmenter, cette condition représente un enjeu majeur de santé publique puisque les coûts y étant associés sont élevés [2, 5]. La physiopathologie de cette maladie est relativement bien décrite, mais l’étiologie de la maladie reste plus difficile à expliquer. En effet, l’asthme est un trait complexe résultant d’interactions gènes-environnement. L’étude de la portion génétique de l’asthme, notamment grâce à l’ère GWAS, a permis d’identifier près de 1000 gènes de susceptibilités [89]. L’héritabilité de l’asthme peut donc être estimée à hauteur de 60%, ce qui en laisse une large portion inexpliquée [73]. C’est à ce niveau que l’étude des déterminants environnementaux peut permettre de mieux comprendre le développement de l’asthme. Cette portion comprend des facteurs propres à l’individu (âge, sexe, etc.) ou encore des expositions auxquels ceux-ci sont soumis (pollution, alimentation, tabagisme, etc.) et les habitudes de vie (pratique d’activités physiques, activités cognitives, etc.). Les mécanismes épigénétiques, dont la méthylation de l’ADN, permettent de visualiser l’impact de ces facteurs dans l’asthme [156].

La méthylation de l’ADN étant spécifique à chaque type cellulaire, il est donc nécessaire d’investiguer au niveau de cellules impliquées dans les processus pathologiques de l’asthme. Les CD4+ sont en effet des acteurs importants relayant le signal inflammatoire par la sécrétion de divers médiateurs et le recrutement d’autres cellules immunes lorsque différenciées en différents sous-types [35]. Une telle étude a donc le potentiel de permettre une meilleure compréhension de l’impact de la méthylation sur la fonction de ces cellules dans l’asthme.

Les objectifs de la présente étude étaient donc de :
1- Caractériser le patron de méthylation des lymphocytes T CD4+ dans l’asthme et l’asthme allergique sur un échantillon de participants de la cohorte canadienne-française sur les troubles respiratoires et l’allergie;
2- Caractériser le patron d’expression des lymphocytes T CD4+ dans l’asthme et l’asthme allergique sur un échantillon de participants de la cohorte canadienne-française sur les troubles respiratoires et l’allergie.

MÉTHODOLOGIE

Recrutement des participants

Un sous-groupe de la biobanque d’asthme du Saguenay−Lac-Saint-Jean a été recruté pour ce projet. En effet, les individus contactés pour participer à ce projet faisaient partie de la biobanque depuis sa création à la fin des années 2000. Ceux-ci sont répartis soit en duos discordants pour le statut d’asthme, c’est-à-dire une fratrie dont un des individus est asthmatique et l’autre ne l’est pas, ou en trio, soit un couple de parents, sans regard à leur phénotype d’asthme, ainsi que leur enfant biologique atteint d’asthme. Les participants acceptant cette nouvelle participation ont été rencontrés à la clinique Ecogène-21 de 2015 à 2016 pour un prélèvement sanguin de 200ml fait par une infirmière de recherche. Cette quantité de cellules a été décidée sur la base des optimisations de la méthode d’isolation des cellules. En effet, les éosinophiles du même échantillon sanguin étaient isolés simultanément aux lymphocytes T CD4+. Ces granulocytes ne comptent que pour 1 à 3% des globules blancs. Il est donc nécessaire d’avoir une quantité de sang de départ plus grande afin d’en avoir une quantité suffisante pour mener divers protocoles épigénétiques et transcriptomiques.

En plus d’un échantillon sanguin, chaque participant était interrogé sur sa santé respiratoire ainsi que sa santé en générale et son environnement dans un questionnaire mené par une personne de l’équipe de la biobanque (moi-même et Lucile Pain, ancienne étudiante au doctorat en biologie). Ce questionnaire de plus de 100 questions a permis de recueillir les dernières données autorapportées par les participants afin de mettre à jour les informations recueillies depuis le recrutement initial.

Isolation des lymphocytes T CD4+

L’échantillon sanguin de 200ml était rapporté au laboratoire une à deux heures suivant le prélèvement afin de procéder à l’isolation des cellules afin d’éviter l’activation des cellules sanguines, ce qui donnerait une quantité de cellules plus faible à la fin du protocole. Une première centrifugation a permis de retirer le plasma de l’échantillon. Par la suite, la méthode de séparation au gradient de Ficoll a été utilisée pour recueillir les fractions cellulaires séparées. Ce tampon, composé de molécules denses de polysaccharides diluées en solution aqueuse, permet d’isoler les cellules mononuclées du sang périphérique (PBMC) puisque leur densité est plus faible que celle du Ficoll [158]. Comme les granulocytes ont une densité plus élevée, ceux-ci se retrouvaient dans le culot du tube lors de la centrifugation alors que les cellules mononuclées flottaient au-dessus du Ficoll. Les deux fractions ont donc pu être séparées et purifiées séparément. Il ne sera ici question que du protocole d’isolation des lymphocytes T CD4+. La fraction cellulaire d’intérêt a été lavée avant de procéder à une sélection négative par des anticorps anti-CD45 couplés à des billes magnétiques selon le protocole du EasySepTM Human Naïve CD4+ T Cell Isolation Kit (Stemcell, Vancouver, CB, Canada), et retenues par un aimant (« The Big Easy » EasySepTMMagnet, Stemcell).

Le principe moléculaire y est montré dans la Figure 8. En résumé, un anticorps spécifique, anti-CD45 dans ce cas-ci, a été mis en solution et s’est lié aux cellules exprimant cet antigène. La quantité totale d’anticorps utilisée dépend de la quantité de cellules comptées avec un hématimètre. Ce comptage permettait également de vérifier à l‘oeil la présence de contamination par d’autres types cellulaires comme les granulocytes ou les monocytes. Par la suite, un complexe tétramérique fait d’un anticorps spécifique au premier anticorps et d’un anticorps lié à une bille magnétique a été mis en solution pour qu’il s’attache à l’anticorps anti-CD45. Lorsque le tube contenant la solution cellulaire avec les cellules maintenant liées à une bille magnétique a été mis dans un aimant, celles-ci ont été retenues sur la paroi du tube alors que les cellules en suspension n’exprimant pas le CD45 ont été séparées.

Les lymphocytes T CD4+ isolés ont ensuite été comptés à grâce au compteur automatisé de cellules Orflo’s Moxi Z Mini (Fisher Scientific, Ottawa, ON, Canada). Environ 2 millions de cellules ont été conservées à -80C pour l’isolation de l’ADN et la même quantité pour l’isolation de l’ARN total.

Données de méthylation

Séquençage (MCC-seq)

L’ADN des lymphocytes T CD4+ a d’abord été obtenu grâce au DNeasy Blood and Tissue kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) selon le protocole du manufacturier. Ce protocole comprend d’abord une lyse des cellules et de leur noyau afin de libérer le matériel génétique qui y est contenu. Par la suite, l’échantillon lysé est passé dans une colonne qui permet de retenir l’ADN et de le purifier en enlevant les débris cellulaires par lavage avec divers tampons. Finalement, l’ADN est élué par un dernier tampon puis précipité avec de l’isopropanol et lavé une dernière fois par de l’éthanol à 70%.

La technique utilisée pour obtenir le niveau de méthylation des CpG d’intérêts distribués sur tout le génome est le methyl-capture sequencing (mcc-seq). Cette technique a été mise au point par l’équipe du Dr Tomi Pastinen, les collaborateurs du présent projet, en collaboration avec la branche recherche et développement de Roche Nimblegen (Roche NimbleGen, Madison, WI, É.-U.). Brièvement, cette technique de séquençage de nouvelle génération permet de séquencer des régions d’intérêts de l’ADN en les capturant. Par conséquent, il est possible de mesurer le niveau de méthylation des CpG qui s’y trouvent. Cette étape a été effectuée en collaboration avec l’équipe du Dr Tomi Pastinen à la plateforme du Centre d’innovation Génome Québec et Université McGill.

La première étape est la préparation de la librairie pour le séquençage pour chacun des échantillons. Cette étape a été faite avec le KAPA High Throughput Library Preparation Kit (KAPA Biosystems, Wilmington, MA, É.-U.). La quantité d’ADN utilisée variait de 700 à 1000ng selon la quantité de départ. De l’ADN non méthylé λ (concentration de 0.01%) (Promega, Madison, WI, É.-U.) y est ajouté et sert de substrat pour les enzymes de restriction de la réaction. Cet ADN de départ avait aussi préalablement été fragmenté en morceaux de 300 à 400 paires de bases (pb) par sonication.

La taille des fragments a été validée par le Bioanalyzer d’Agilent (Agilent, Santa Clara, CA, É.-U.) qui utilise un procédé automatisé d’électrophorèse. Une fois le matériel de départ prêt, la librairie a ensuite pu être appliquée aux échantillons selon le protocole fourni par le manufacturier. Le procédé comprend une étape de réparation des extrémités des fragments d’ADN. Ceci permet par la suite aux adaptateurs spécifiques de s’hybrider sur les fragments pour l’étape subséquente de capture des fragments et de séquençage. Par la suite, la librairie a été convertie au bisulfite de sodium afin de pouvoir procéder au séquençage des sites de méthylation ciblés. Cette conversion au bisulfite de sodium a été faite grâce au Epitect Fast DNA Bisulfite Kit (Qiagen) selon le protocole du manufacturier. Brièvement, ce procédé permet de conserver les cytosines méthylées et de changer en uraciles celles qui ne le sont pas. Les lectures faites lors du séquençage subséquent permettront donc de mesurer le niveau de méthylation en prenant en compte le signal des cytosines restantes.

Par la suite, la quantification de la quantité d’ADN pour chaque échantillon a été mesurée par fluorescence avec oliGreen (Life Technologies, Burlington, ON, Canada). Une amplification par PCR a ensuite été faite avec le Kapa Hifi Uracil+DNA polymerase (KAPA Biosystem) avec 9 à 12 cycles PCR selon la quantité d’ADN mesurée, dans le but d’avoir une quantité suffisante de matériel pour la réaction de séquençage. Finalement, une purification des librairies amplifiée a aussi été faite pour éliminer les produits PCR non désirés.

L’étape de capture des fragments a été faite par le SeqCap Epi Enrichment System protocol (Roche NimbleGen) selon le protocole du fabricant. Cette capture repose sur des sondes s’hybridant sur les deux brins de l’ADN de la région ciblée lors d’une incubation avec celles-ci. Dans ce cas-ci, la capture a été faite à une température de 40C pendant 72h. Une réaction de capture peut être faite pour 12 échantillons simultanément. Comme la quantité d’ADN nécessaire pour une capture est de 1ug, 84ng de chaque échantillon étaient mis en commun pour chaque capture. Toujours selon le protocole du manufacturier, la librairie capturée a été encore une fois amplifiée et purifiée avant de pouvoir procéder au séquençage des fragments capturés. Ce séquençage a été fait sur la plateforme HiSeq4000 (Illumina, San Diego, CA, É.-U.) en utilisant une configuration permettant de séquencer les fragments à partir des deux extrémités, 3’ et 5’ (paired-end), et de générer des séquences d’une longueur de 100pb. Les régions ciblées, soit 822 884, comportaient un total de 4 609 564 CpG et ont généré 119 089 296pb séquencées.

Alignement et contrôles qualité

Une fois les régions d’intérêts séquencées, il est nécessaire de situer celles-ci sur le génome afin de connaître les positions des CpG dont la méthylation différentielle a été mesurée. Cette étape, l’alignement, a été faite grâce à GenAP_pipe pipeline 425 (https://bitbucket.org/mugqic/genpipes) un outil d’analyse étape par étape développé par le Centre d’Innovation Génome Québec de l’Université McGill. La version hg19/GRCh37 du génome humain a été utilisée comme génome de référence.

Dans un premier temps, les séquences brutes doivent être triées selon l’indice de score phred. Celui-ci est un indicatif de la fiabilité et l’efficacité du séquençage [159]. Les séquences dont le score phred est de 30 et plus et dont la longueur en paire de bases est de 50 et plus ont été conservées. Les adaptateurs Illumina spécifiques à la réaction de séquençage ont été retirés des séquences grâce à l’outil Trimmomatic (v.0.36) [160]. En effet, une réaction de séquençage nécessite l’ajout de courtes séquences aux fragments d’ADN lors de la préparation de la librairie. Ceux-ci doivent donc être retirés afin d’obtenir les séquences d’ADN réelles. L’alignement à proprement parler a ensuite été fait en utilisant l’outil Bismark (v.0.18.2) et bowtie2 (v.2.3.1) développé par une équipe de l’Université du Maryland [161, 162]. Les séquences présentent en duplicata ont aussi été retirées grâce à l’outil picard (v.2.9.0).

Finalement, les CpG se retrouvant à la même position que des SNP (selon la liste de référence dbSNP 137) ont été exclus, tous comme ceux pour lesquels il y avait moins de 5 séquences et ceux se retrouvant dans la DAC Blacklisted 32 Regions ou la Duke Excluded Regions [163]. Ce dernier critère permet de retirer les CpG se retrouvant dans des régions problématiques du génome, souvent caractérisées par des répétitions de nucléotides [163]. Les CpG pour lesquels des données étaient disponibles pour moins de 120 échantillons ont aussi été enlevés pour les analyses subséquentes. Les données de méthylation ont été rendues disponibles pour 173 échantillons. En effet, seulement ceux ayant des résultats pour au moins 1,5 million de CpG ont été conservés.

Données d’expression

Séquençage de l’ARN

Une quantité précise de cellules (2×10-6) a été préalablement congelée à -80°C dans une solution de TRIzol® (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Ce réactif permet de conserver adéquatement les acides nucléiques, en particulier l’ARN qui est beaucoup moins stable que l’ADN lors de la congélation à basse température (-80°C). Ce réactif permet donc l’obtention d’un l’ARN ayant une intégrité, une pureté ainsi qu’une concentration adéquate [164]. L’isolation de l’ARN total (ARNt) a été faite grâce au RNeasy Mini Kit selon le protocole du manufacturier (Qiagen). Il s’agit d’une méthode permettant la lyse des cellules puis la purification de la solution obtenue sur colonne grâce à différents tampons dont l’affinité avec l’ARN est variable.

La filtration sur colonne de la solution avec les lavages permet d’éliminer les débris cellulaires avant d’éluer l’ARN purifié à la fin du processus. Le dosage de l’ARN a ensuite été fait sur le Bioanalyzer d’Agilent afin d’obtenir la concentration ainsi que la mesure d’intégrité (RIN) des échantillons. Le RIN devait être d’autre moins 7 pour considérer que l’échantillon était valable et adéquat pour les étapes subséquentes. Les échantillons ont ensuite été envoyés à l’équipe du Dr Tomi Pastinen à l’Université McGill, collaborateur du présent projet, afin de procéder à la mesure de l’expression des gènes à la plateforme Centre d’innovation Génome Québec et Université McGill.

Le niveau d’expression des gènes a été mesuré par séquençage, tout comme pour la méthylation. Dans un premier temps, une quantité de 500ng d’ARNt pour chaque échantillon a été utilisée pour préparer la librairie de séquençage. Celle-ci a été faite grâce au TruSeq Stranded Total RNA Sample Preparation Kit d’Illumina selon le protocole du manufacturier. La figure suivante illustre les grandes étapes du processus de préparation de la librairie (Figure 9).

Alignement et contrôles qualité

Comme pour les données de séquençage générées pour la technique de mcc-seq, le score phred a été utilisé comme premier filtre (phred33≥30) tout comme la longueur des lectures faites qui devaient être d’au moins 32 paires de bases pour être conservées. L’outil Trimmomatic (v.0.32) a été utilisé pour retirer les séquences des adaptateurs Illumina ayant permis le séquençage des fragments d’ADNc [160]. Les séquences ont finalement pu être alignées sur la version hg19/GRCh37 du génome humain en utilisant les outils TopHat (v.2.0.10), développé à l’université Johns Hopkins, et bowtie2 (v.2.1.0) [162, 165]. Il a ensuite été possible d’extraire le nombre de comptes de chacun des gènes séquencés avec l’outil htseq-count (v.0.6.1) [166].

Une normalisation du compte de chacun des gènes a été faite. Ceci permet de ramener les valeurs selon la taille totale de la librairie (nombre de comptes total). Ceci a été possible grâce à l’outil DeSeq2 sur l’environnement R [167]. Une fois les données normalisées, un dernier tri a été fait avant de pouvoir procéder aux analyses.

Les gènes ayant moins de 10 lectures pour tous les échantillons étaient considérés comme non exprimés par les cellules. Par conséquent, ceux-ci ont été exclus des analyses. Les données de séquençage ont donc pu être obtenues pour 173 échantillons et ont par conséquent servi aux étapes subséquentes.

Données génétiques

Les données génétiques utilisées dans la présente étude étaient disponibles pour 1214 individus faisant partie de la cohorte familiale d’asthme du SLSJ. Ces données ont été générées à partir d’échantillons de sang complet prélevés lors du recrutement initial des participants à la fin des années 1990. L’ADN génomique (ADNg) de ces échantillons sanguins a été extrait avec le Blood and Cell Culture Midi kit de Qiagen et vérifié pour le contrôle de la qualité des échantillons (pureté et concentration). Le génotypage a ensuite été fait pour chaque échantillon grâce à la puce Illumina 610K Quad array.

L’utilisation de cette puce a permis le génotypage simultané de plus de 582 000 SNP dans chaque échantillon. Comme ces données ont été obtenues il y a plusieurs années, celles-ci ont ensuite été imputées afin d’inclure les nouvelles variations du génome répertoriées après la fabrication de cette puce. Cette imputation permet d’inférer statistiquement les haplotypes de chaque échantillon à des positions non couvertes par la puce d’origine en se basant sur des bases de données répertoriant les variations du génome connues à ce jour [168]. Ceci a permis de considérer un nombre encore plus élevé de SNP répartis sur tout le génome pour un total d’environ 7 millions.

Le logiciel SHAPEIT2 a d’abord été utilisé pour la phase d’estimation des haplotypes des données génétiques [169]. La phase d’imputation a ensuite été performée grâce au logiciel IMPUTE2 en utilisant les banques de données du 1000 Genomes Project et du UK10K Project comme informations de références pour l’imputation [170]. Les données génétiques imputées ont ensuite été filtrées selon certains critères de qualité : 1) taux de génotypage ≥ 95%; 2) individual call rate ≥ 95%; 3) fréquence de l’allèle mineur ≥ 0,01; 4) valeur p de l’équilibre d’Hardy-Weinberg ≥ 0,0001.

Analyses

Méthylation

Les associations entre le niveau de méthylation des CpG et les phénotypes ont été calculées en utilisant un modèle linéaire généralisé pour les phénotypes d’asthme et d’asthme allergique. Il s’agit d’un type d’approche permettant de considérer des données non numériques, comme les pourcentages de méthylation dans ce cas-ci [171].

Ce modèle a pu être appliqué dans l’environnement R. Les covariables incluses dans ce modèle sont l’âge lors du prélèvement sanguin, le sexe, le statut tabagique (fumeurs/ex-fumeur et non-fumeurs), des variables substituts (SV, ou surrogate variables) et la proportion des cellules CD4+. Les SV sont des variables importantes à prendre en compte dans l’analyse de la grande quantité de données générées par les technologies à haut débit. En effet, le calcul de ces variables permet de prendre en compte dans le modèle l’effet de l’hétérogénéité technique de l’expérimentation et de lui attribuer une valeur. Ainsi, combinées aux autres co-variables, les SV pourront permettre d’obtenir un modèle fidèle et des données corrigées plus représentatives de la réalité. Ces SV ont été calculés dans l’environnement R en utilisant l’outil sva [172].

La proportion des cellules CD4+ a quant à elle été calculée afin de prendre en compte la pureté de chaque échantillon et de pouvoir ainsi l’intégrer au modèle. Pour se faire, une méthode développée par Houseman sur l’outil RnBeads dans l’environnement R a été utilisée [173]. Cette méthode permet de comparer la méthylation d’un certain nombre de CpG à des données de méthylation références provenant de bases de données. Pour le calcul de la proportion des CD4+, des données provenant de 10 types différents de cellules ont été utilisées (CD4+, CD8+, CD14+, CD19+, éosinophiles, granulocytes, neutrophiles, PBMC et un mélange de globules blancs).

Les valeurs p (p-value) générées ont ensuite été ajustées pour le false discovery rate (FDR). Cet ajustement est nécessaire pour les analyses comprenant des comparaisons multiples, comme dans le cas présent. Celle-ci permet d’avoir un p-value prenant en compte la probabilité d’obtenir des erreurs de type I, c’est-à-dire des associations faussement significatives (faux positifs) [174]. Par la suite, les valeurs de différence de méthylation (-meth) pour chaque site CpG significatif retenu (FDR≤ 0,05) ont ensuite été calculées en soustrayant la moyenne du pourcentage de méthylation des participants témoins (sans asthme ou sans asthme allergique) à la moyenne du pourcentage de méthylation des participants atteints du phénotype (asthme ou asthme allergique). Afin de classer les CpG selon leur localisation chromosomique, leurs positions ont été comparées aux positions chromosomiques de l’ensemble des gènes contenus dans l’ADN humain, et ce pour les CpG dont le FDR≤ 0,05 et le -meth≥5%. Il a ainsi été possible d’identifier la localisation des CpG soit 1) à l’intérieur d’un gène, 2) intergénique ou 3) dans le promoteur d’un gène (défini comme la région de 1000 pb en amont du TSS).

Table des matières

RÉSUMÉ 
TABLE DES MATIÈRES
LISTE DES FIGURES 
LISTE DES TABLEAUX 
LISTE DES ABRÉVIATIONS 
REMERCIEMENTS 
INTRODUCTION 
1. Asthme
1.1 Épidémiologie
1.2 Phénotypes
1.3 Physiopathologie
1.3.1 Sensibilisation à un allergène
1.3.2 Phase précoce de l’inflammation
1.3.2.1 L’épithélium bronchique
1.3.2.2 Réexposition
1.3.3 Phase tardive de l’inflammation
1.3.3.1 Lymphocytes T CD4+
1.3.3.2 Éosinophiles et neutrophiles
1.3.4 Le remodelage des voies respiratoires
2. Composante génétique 
3. Composante environnementale 
3.1 Épigénétique
3.1.1 Méthylation de l’ADN
3.3 Facteurs de risque
3.3.1 Âge et sexe
3.3.2 Obésité
3.3.3 Qualité de l’air
3.3.4 Tabagisme
4. Population à l’étude 
4.1 Historique
4.2 La cohorte familiale d’asthme du Saguenay−Lac-Saint-Jean
5. Hypothèse et objectifs 
CHAPITRE 1 – MÉTHODOLOGIE 
1.1 Recrutement des participants
1.2 Isolation des lymphocytes T CD4+
1.3 Données de méthylation
1.3.1 Séquençage (MCC-seq)
1.3.2 Alignement et contrôles qualités
1.4 Données d’expression
1.4.1 Séquençage de l’ARN
1.4.2 Alignement et contrôles qualités
1.5 Données génétiques
1.6 Analyses
1.6.1 Méthylation
1.6.2 Expression
1.6.3 Corrélations méthylation – expression
1.6.4 eQTL
CHAPITRE 2 – RÉSULTATS 
2.1 Niveau différentiel de méthylation
2.1.1 Asthme
2.1.2 Asthme allergique
2.2 Niveau différentiel d’expression
2.2.1 Asthme
2.2.2 Asthme allergique
2.3 Corrélations méthylation- expression
2.4 eQTL
CHAPITRE 3– DISCUSSION 
3.1 Différences de méthylation dans l’asthme
3.1.2 Implications de la famille de chemokine CXC dans l’asthme
3.2 Différences de méthylation dans l’asthme allergique
3.2.1 Implications de la voie de l’IL-17 et de l’IL-25 dans l’asthme allergique
3.3 Expression différentielle de gènes impliqués dans l’asthme et l’asthme allergique
3.4 Intégration des données
3.5 Le défi du séquençage de nouvelle génération
3.6 Limites de l’étude
CONCLUSION ET PERSPECTIVES 
1. Conclusion générale
2. Perspectives
BIBLIOGRAPHIE 
Annexe I 
Annexe II 

Télécharger le rapport complet