Soutenance mémoire
DÉNOMINATION – TAXONOMIE – MORPHOLOGIE
Aythya innotata, de son nom scientifique, est désormais appelé fuligule de Madagascar pour le nom vernaculaire en français, Madagascar pochard en anglais, Onjy en malagasy pour les hautes terres ainsi que Fotsimaso dans la région Sofia. La dénomination Aythya innotata a été attribuée par Salvadori en 1894 (11). La position systématique est la suivante (12) :
Règne : ANIMAL
Embranchement : VERTEBRES
Sous-embranchement : GNATHOSTOMES
Super-classe : OISEAUX
Classe : CARINATES
Ordre : ANSERIFORMES
Famille : ANATIDAE
Sous-famille : ANATINAE
Genre : Aythya
Espèce : innotata
Les fuligules de Madagascar sont des canards plongeurs de taille moyenne, mesurant en moyenne 45cm et pesant environ de 685g (12). Ils possèdent un plumage de couleur brun-noire sur les parties supérieures du corps tandis que la moitié supérieure du ventre est de châtain-sombre. Les sous caudales sont blancs. Les ailes sont brun-noirs avec une barre alaire blanche très visible pendant le vol. Les pattes sont de couleurs grises foncées (11, 13). Le mâle se distingue de la femelle par sa taille plus grande mais surtout par son iris blanc, qui ne le confond avec aucune espèce, d’où son appellation « Fotsimaso ». Par contre, les femelles sont caractérisées par son iris brun et son plumage plus sombre et terne (11 – 15).
MENACES ET ACTIONS DE CONSERVATION
Selon la liste rouge de l’UICN, en 1988, l’espèce a été dans la liste des espèces menacées. De 1994 à 2004, l’espèce a été classée critiquement En Danger et puis, probablement éteinte en 2006 (23, 24). Les Aythya innotata figurent actuellement parmi les espèces critiquement En Danger d’extinction (5). Depuis la redécouverte de l’espèce dans le petit lac de Bemanevika (7), des gardes permanents ont été placés sur place et la population semble se trouver en situation de stabilité en nombre, ce qui suggère que la chasse peut être une menace. Et étant donné que c’est une petite population, elle fait face à un risque significatif d’événements stochastiques et de facteurs génétiques, notamment la dépression et la consanguinité (25 – 27). Les baisses de la population de fuligules de Madagascar antérieures ont été surtout conférées à la perte généralisée de l’habitat par l’envasement et la conversion des lacs en zone d’agriculture. Ce qui a contribué à l’épuisement des ressources alimentaires essentielles pour l’espèce. Mais à partir des années 1950, la croissance significative de la population de Rattus rattus a augmenté la prédation des nids. Puis, l’introduction d’espèce de poisson exotique telle que les Tilapia « Oreochromis macrochir » et les Fibata « Ophicephalus striatus » a accru le taux de mortalité de juvéniles par prédation. La chasse et le piégeage des adultes pour nourriture, et la mort à travers l’enchevêtrement dans les filets, sont aussi considérés comme ayant contribué au déclin de cette espèce (22 – 24, 28). Les mesures de conservations prises, en plus du programme d’élevage en captivité, sont les suivantes :
¾ Continuer les recherches pour les populations existantes, avec un accent particulier autour de haut-plateaux où Aythya innotata ont été observés dans le passé
¾ Continuer les activités de conservation communautaires et les programmes de sensibilisation pour la protection des zones humides (lac Bemanevika et autres sites potentiels pour les fuligules de Madagascar)
¾ Mener des recherches plus poussées pour déterminer la taille de la population existante
¾ Effectuer l’inventaire des zones humides près de la population restant pour identifier les sites potentiels et les sites de réintroduction des oiseaux élevés en captivité et d’évaluer la nécessité de la restauration des habitats (29)
DEFINITION-ETIOLOGIE-PATHOGENICITE
La maladie de Newcastle (MN), dénommée également pseudo-peste aviaire ou pesta en malagasy, est une maladie de grande contagiosité et dévastatrice, affectant un grand nombre d’espèces de volailles domestiques et sauvages (51). Cette maladie a été répertoriée dans le territoire malagasy depuis 1946 (52). L’agent responsable est appelé virus de la maladie de Newcastle (Newcastle Disease Virus, NDV) ou Paramyxovirus aviaire de type -1 (Avian paramyxovirus type 1, APMV-I). Le NDV est un virus enveloppé qui fait partie du genre Avulavirus et de la famille des Paramyxoviridae (53 – 55). Cette famille de virus se caractérise par une capside de symétrie hélicoïdale et par un ARN monocaténaire non segmenté de polarité négative. Neuf sérotypes ont été identifiés au sein des Paramyxovirus aviaires (APMV1 à APMV-9). Le NDV présente de grandes diversités génétiques, ces dernières étant associées à l’origine spatio-temporelle ainsi qu’à l’espèce hôte des différentes souches (56 – 58). Récemment à Madagascar, de nouveaux sérotypes ont été découverts (59). La virulence de NDV ainsi que les signes cliniques de la ND varient fortement selon l’espèce hôte et son statut immunitaire, la souche virale impliquée, les infections par d’autres micro-organismes et les stress environnementaux (53, 55). Selon les signes cliniques apparents, les tropismes et la virulence des souches, on distingue (60, 61) :
¾ Les souches velogènes, très virulentes
¾ Les souches mesogènes ou modérées
¾ Les souches lentogènes, moins pathogènes
Transport et stockage des sérums
Les sérums obtenus, après centrifugation, ont été mis dans des tubules (Eppendorfs) de 0.5ml, puis, dans de l’azote liquide pour stockage temporaire et pour transport à partir du centre d’élevage jusqu’au laboratoire national de diagnostic vétérinaire (LNDV). Dans le laboratoire, les échantillons étaient stockés sous congélation à moins 20 degrés Celsius.
Examen sérologique par le test ELISA
Les analyses de laboratoire ont été effectuées au sein du Laboratoire National de Diagnostic Vétérinaire, sis à Anosimasina Itaosy, Antananarivo. Des tests ELISA ou Enzyme Linked Immunosorbent Assay indirects ont été réalisés pour détecter les niveaux d’anticorps sériques circulants contre la maladie de Newcastle et choléra aviaire chez Aythya innotata en captivité. ELISA est un test immuno-enzymatique utilisé pour détecter et évaluer la présence d’anticorps dans un sérum donné. Si l’anticorps recherché est présent dans le sérum, il se lie avec l’antigène immobilisé dans la plaque et l’ensemble forme le « complexe immun ». Une antiglobuline, le « conjugué », marquée par une enzyme peroxydase est ensuite ajoutée au complexe immun formé. L’addition d’un substrat chromogène produit un signal de coloration de la réaction Anticorps-Antigène (Ac-Ag), permettant ainsi le dosage d’anticorps par spectrophotométrie. Les Kits ProFLOK® PM ELISA et ProFLOK® PLUS NDV ELISA (SYNBIOTICS® USA) ont été utilisés pour détecter les anticorps contre P.multocida et PMV-1 chez Aythya innotata. Cela consiste en une méthode quantitative et qualitative sur sérum. Les tests ELISA indirects se font en plusieurs étapes:
Première étape : Dilution des sérums : Les échantillons (sérums) sont d’abord décongelés, puis, 300ul de Buffer de Dilution sont ajoutés dans des cupules de microplaques non sensibilisées. Par la suite, 6ul de chaque échantillon de sérum à tester sont additionnés pour avoir une dilution de 1 :50. Les solutions sont laissées sur un mélangeur dans une température ambiante pendant 5 minutes pour que la dilution puisse s’équilibrer.
Deuxième étape : Fixation des anticorps à doser : Après dilution, 50ul de chaque échantillon dilué et 50ul de Buffer de Dilution sont distribués dans des cupules déjà sensibilisées sur lesquelles sont déjà fixés les antigènes (Ag). Après 30 minutes d’incubation dans une température ambiante, des complexes Ac-Ag devraient se former si éventuellement, les anticorps recherchés sont présents dans les échantillons à tester. Les restes d’échantillons non fixés sont enlevés par lavage. Des sérums de contrôle positif et normal sont prêts à utiliser et à mettre dans les cupules correspondantes après une dilution de 1 :50 avec le Buffer de Dilution.
Troisième étape : L’ajout de conjuguées, de substrats et de solution d’arrêt : Après la formation des complexes Ac-Ag, 100ul de solution de conjuguée diluée sont ajoutés dans les cupules. Les plaques sont ensuite incubées pendant 30 minutes dans une température ambiante. Le processus de lavage permet d’éliminer les excès d’anticorps non fixés. Les cupules sont vidées et lavées trois fois de suite. Le processus de lavage est une étape très cruciale pendant le test ELISA. Après lavage, 100 ul de solution de substrat sont ensuite versés dans les cupules, suivis d’une incubation de 15 minutes. 100ul de solution d’arrêt diluée sont enfin additionnées dans les cupules pour stopper toutes réactions.
4eme étape : La révélation des anticorps fixés ou le dosage proprement dit : Des solutions révélatrices sont formées. Si la réaction est positive, c’est-à–dire, les anticorps recherchés sont présents, les substrats sont dégradés et se transforment en produit coloré. L’intensité de la coloration est proportionnelle à la concentration des anticorps à doser. Les témoins négatifs doivent rester incolores car les anticorps recherchés ne sont pas présents. La lecture se fait par spectrophotométrie en utilisant une bande monochromatique à 405 nm. Un test avec des résultats valides est obtenu lorsque la moyenne des valeurs de la densité optique (DO) des sérums de contrôles normaux est inférieure à 0.200 et que la valeur corrigée des contrôles positifs se trouvent entre 0.250 et 0.900. Si les valeurs des DO des sérums de contrôles ne tombent pas dans ces références, le test est considéré comme invalide et doit être répété (92 – 94). Dans les conditions optimales, la température ambiante est entre 21 – 24 dégrées Celcius. Ainsi, la DO suggérée est entre 0.060 et 0.080 pour les sérums de contrôles normaux et de 0.400 à 0.750 pour les sérums de contrôles positifs. Mais une valeur de DO supérieure à celles –ci ne veut pas dire que le test est non valide.
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Table des matières
INTRODUCTION
PARTIE I : GENERALITES ET CONTEXTE DE L’ETUDE
I. GENERALITES SUR LES AYTHYA INNOTATA
I.1. DÉNOMINATION – TAXONOMIE – MORPHOLOGIE
I.2. HISTORIQUE – DISTRIBUTION DANS LE MILIEU NATUREL
I.3. MENACES ET ACTIONS DE CONSERVATION
I.4. PROGRAMME D’ÉLEVAGE EN CAPTIVITÉ
II. GENERALITES SUR LE CHOLERA AVIAIRE ET LA MALADIE DE NEWCASTLE
II.1. LE CHOLERA AVIAIRE
II.1.1. DEFINITION–ETIOLOGIE- PATHOGENICITE
II.1.2. EPIDEMIOLOGIE – TRAITEMENT- PRÉVENTION
II.2. LA MALADIE DE NEWCASTLE
II.2.1. DEFINITION-ETIOLOGIE-PATHOGENICITE
II.2.2. EPIDEMIOLOGIE – TRAITEMENT-PRÉVENTION
III. GENERALITES SUR LA VACCINATION ET LA REPONSE VACCINALE
PARTIE II : MATERIELS ET METHODES
I. CADRE DE L’ÉTUDE
II. TYPE D’ETUDE
III. DUREE ET PERIODE DE L’ETUDE
III.1. Période étudiée
III.2. Durée de l’étude
IV. PARAMETRES D’ETUDE
IV.1. Choix des vaccins utilisés
IV.2. Mode de vaccination
IV.3. Examen physique individuel
V. POPULATION D’ETUDE
V.1.Unité cible
V.2.Unité d’échantillonnage
V.3.Critères d’inclusion
VI. LIMITES DE L’ETUDE
VII. SEROLOGIE
VII.1. Prélèvements sanguins
VII.2. Transport et stockage des sérums
VII.3. Examen sérologique par le test ELISA
VIII. TRAITEMENTS ET ANALYSES DES DONNÉES
VIII.1. Stockage et manipulation
VIII.2. Analyse des données
VIII.3. Analyse univariée
VIII.4. Analyses multivariées quantitatives
PARTIE III. RÉSULTATS
A. RÉPONSES VACCINALES CONTRE LA MALADIE DE NEWCASTLE CHEZ AYTHYA INNOTATA EN CAPTIVITÉ
1. Densité optique du test ELISA indirect des anticorps anti-NDV de chaque individu de Aythya innotata en captivité
2. Titre des anticorps anti-NDV de chaque individu de Aythya innotata en captivité
3. Analyses statistiques des titres d’anticorps anti-NDV chez Aythya innotata en captivité
B. RÉPONSES VACCINALES CONTRE LE CHOLÉRA AVIAIRE CHEZ AYTHYA INNOTATA EN CAPTIVITÉ
1. Densité optique du test ELISA indirect des anticorps anti-P.multocida de chaque individu Aythya innotata en captivité
2. Titre des anticorps anti-P. multocida de chaque individu Aythya innotata en captivité
3. Analyses statistiques des titres d’anticorps anti-P.multocida chez Aythya innotata en captivité
Partie IV: DISCUSSION ET RECOMMANDATIONS
IV.1. DISCUSSION
a. Titres d’anticorps vaccinaux anti-PMV-1
b. Réponses vaccinales anti-P.multocida
c.Stockage des échantillons
d. Kits ELISA PROFLOCK®
e. Challenge infection
f. Ring vaccination
IV.2. RECOMMANDATIONS
CONCLUSION
ANNEXE
BIBLIOGRAPHIE
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