La lutte contre la bactérie

La lutte contre la bactérie

Les souches bactériennes

Pour cette étude, deux collections de souches de R. solanacearum ont été utilisées.

La collection de souches de la core-RS2

La collection mondiale Core-RS2 a été assemblée durant la thèse d’Aurore Lebeau (Lebeau et al., 2010) suite à l’inoculation de cultivars sensibles de tomate, aubergine et piment. Elle contient des souches réparties dans tout l’arbre phylogénétique et appartenant à 3 des 4 phylotypes (Tableau 3). A ces souches s’ajoutent deux souches émergentes : RUN 16 et RUN 18 (Wicker et al., 2007).

La collection de souches réunionnaises

La collection réunionnaise est composée de 35 souches appartenant aux phylotypes I, IIA, IIB et III, prélevées sur différents sites et différents hôtes de la Réunion (Tableau 4).

L’isolement des souches et l’extraction d’ADN

Les souches sont conservées à -80°C sur des billes microporeuses (Tubes Cryobank®). Sous hotte à flux laminaire, une bille est prélevée à l’aide d’une aiguille et placée dans un bouillon nutritif (Annexe I). Après 24h d’incubation à 28°C en agitation, 50µL sont prélevés et étalés sur du milieu Kelman (Annexe I) en boîte de Pétri selon la technique des « trois secteurs ». Après deux jours, des colonies isolées sont prélevées et étalées sur milieu Kelman. Après une croissance de 24 à 48h, les souches sont prélevées et mises en suspension. Deux types de suspensions sont préparés : les suspensions à environ 108 CFU.mL-1 (1 anse d’environ 1µL dans 1mL d’eau stérile) pour une utilisation directe en PCR et les suspensions concentrées (1 anse de 10µL dans 1mL d’eau) pour l’extraction d’ADN. L’extraction d’ADN est réalisée sur les suspensions concentrées à l’aide d’un kit Qiagen DNeasy® Tissue selon le protocole en annexe II. La quantification d’ADN est ensuite réalisée par spectrophotométrie au Nanodrop.

Le matériel végétal

Dans cette étude, les deux espèces considérées sont la tomate et l’aubergine. Les accessions choisies appartiennent à une collection appelée core-TEP, définie par Lebeau et al., 2010.

Aubergine (Solanum melongena): les accessions sensibles et résistantes

Dans cette collection, deux cultivars d’aubergines résistants (E1 : Accession MM853, E6 : MM960) et un sensible (E8 : MM738) ont été choisis (Tableau 5). MM853 est un cultivar provenant d’Asie et multiplié par l’INRA ; il accumule des résistances provenant de différentes sources. MM960 a été créé à l’INRA de Guadeloupe à partir d’un croisement entre une lignée résistante provenant de Turquie et de l’espèce apparentée sauvage Solanum aethiopicum. E1 a été choisie pour sa résistance à une large gamme de souches, et E6 et E8 sont les parents de la population dont la résistance est en cours de cartographie (Lebeau et al., 2010).

Tomate (Solanum lycopersicum): les accessions sensibles et résistantes

Un cultivar de tomate résistant (T5 : Hawaii 7996) et un sensible (T10 : L390) ont été utilisés pour les tests de pathogénicité (Tableau 5). Hawaii 7996 est le cultivar résistant le plus largement utilisé pour cartographier les gènes de résistance majeurs au flétrissement bactérien. La résistance de ce cultivar est sous le contrôle de plusieurs QTLs (Quantitative Trait Loci) cartographiés (Thoquet et al., 1996). La sélection des gènes T3Es et l’amplification par PCR, étude du génotype

Réalisation d’une liste de gènes orthologues aux T3Es candidats

Des couples d’amorces doivent être déterminés pour amplifier les T3Es pendant la PCR. Pour cela, il faut chercher des zones consensus dans des familles de T3Es afin d’être certain d’amplifier le gène ciblé dans les différentes souches. Des familles de gènes orthologues ont été définies à partir des séquences des T3Es présents dans les différents génomes complets et regroupés dans l’interface Web MaGe (Magnifying Genomes, http://genoscope.cns.fr/microscope/.mage) sur la plateforme MicroScope. Sur la plateforme MAGE, la recherche d’orthologues aux gènes candidats déjà répertoriés est réalisée en définissant les paramètres suivants : – L’identité entre les gènes doit être supérieure à 80% – Les rapports de recouvrement minimaux (MinLrap) et maximaux (MaxLrap) entre les gènes doivent être supérieurs à 90%. La liste des T3Es et de leurs orthologues est synthétisée dans le tableau 2 (d’après Remenant et al.,2010).

Détermination d’amorces

Les séquences des groupes de gènes orthologues sont enregistrées au format fasta et multifasta par le logiciel Seqverter (Genestudio, www.genestudio.com). Un alignement des gènes est ensuite effectué sous Jalview (Waterhouse et al., 2009) avec le programme d’alignement ClustalW (Annexe III). Après alignement, on identifie les zones consensus dans lesquelles vont être dessinées les amorces. L’identification de ces zones permet d’éviter de dessiner les amorces dans des zones polymorphes. Celles-ci risqueraient de ne pas être amplifiées ensuite. Sur certains gènes de grande taille, plusieurs paires d’amorces ont été définies pour pouvoir les amplifier en plusieurs parties. Le design d’amorces a été réalisé avec le programme Primer 3  55 couples d’amorces ont donc été définis en s’efforçant de garder les températures de fusion (Tm) proches de 60°C, les tailles de 18 à 25 nucléotides (nt) et d’autres paramètres présentés en annexe IV. Le polymorphisme observé sur certaines séquences a également conduit à dessiner des amorces dégénérées.

Amplifications par PCR

Les amplifications par PCR ont été réalisées dans le but de déterminer la présence ou l’absence desT3Es dans les différentes souches. L’ADN de toutes les souches a été soumis à l’analyse PCR via l’utilisation des amorces spécifiques des T3Es. Pour certains gènes tels que GALA3, AWR6 (Annexe IV), un couple d’amorces amplifie la séquence universelle du gène (la plus longue commune au groupe de gène d’orthologues) tandis qu’un autre couple amplifie la séquence du gène le plus long, ceci afin de déterminer la présence de polymorphisme de taille au sein d’un gène. Les mix ont été préparés selon le dosage présenté dans le tableau 6, auquel sont ajoutés 2µL d’ADN. Les amplifications par PCR (Tableau 7) ont été répétées au moins deux fois pour obtenir des résultats reproductibles.

Les tests de pathogénicité : étude du phénotype

Les tests de pathogénicité ont eu lieu en chambre climatique dans un local de Niveau de Sécurité 3 (NS3) en raison de l’utilisation d’une souche émergente (RUN 17).

Les conditions de croissance des plants

Les graines d’aubergines et de tomates sont semées en serre respectivement 4 semaines et 3 semaines avant inoculation. Le repiquage des plantules en pots a lieu une semaine après le semis. Les graines sont traitées au Prévicur® contre la fonte des semis et un engrais foliaire (Mairol®) est appliqué chaque semaine après repiquage. Au stade 3-4 feuilles, les plants sont transférés en chambre climatique (rotoplant) deux jours avant l’inoculation afin qu’ils soient bien adaptés aux conditions de la chambre. Dans la chambre climatique, l’humidité est réglée à 90%, la température est de 30°C le jour et 24°C la nuit, pour une photopériode de 12h. Un engrais foliaire est pulvérisé chaque semaine.

Le dispositif d’expérimentation

Les plants étant placés sur un plateau tournant, ils sont soumis aux mêmes conditions (Figure 13). Chaque combinaison souche x cultivar est testée sur deux répétitions de 15 plants placés dans une même terrine (Figure 13). Dans chaque sous jardinière sont placées 2 terrines contenant des plants inoculés par la même souche, pour éviter les contaminations croisées. Si cela n’est pas possible, chaque terrine est isolée à l’aide d’un sac plastique (Figure 14).

La méthode d’inoculation des plants

Les bactéries sont mises en culture une semaine avant inoculation selon le même protocole qu’au point I.3. Pour chaque souche et pour une inoculation de 150 plants, l’amas bactérien obtenu est distribué et étalé sur 20 boîtes de milieu Kelman. Après 24h de mise en culture, les pâtés sont prélevés jusqu’à obtention d’une suspension de concentration approximativement égale à 108 CFU/mL dans 750mL de tampon Tris. Cette suspension, dont on évalue les concentrations exactes par suspension dilution, est ensuite utilisée comme inoculum (Tableau 8). L’inoculation est réalisée par ajout de 5mL d’inoculum en surface du substrat de culture des plants après scarification des racines au scalpel (Figure 15).

Les données génotypiques : présence et polymorphisme des gènes candidats

Le protocole utilisé pour les PCR est celui présenté au point III.3. de la partie matériel et méthodes. Ce protocole a parfois été modifié quand les amplifications entraînaient l’apparition de bandes aspécifiques lors des révélations (Figure 19). Pour augmenter la spécificité d’appariement des amorces, nous avons testé des températures croissantes d’hybridation (PCR gradient) et lorsque cela était nécessaire, nous avons également diminué le nombre de cycles pendant la PCR ou utilisé des suspensions de cellules à 108 CFU.mL-1 à la place de l’ADN extrait (Annexe 4). Certains couples d’amorces n’ont pas permis d’amplifier certains gènes ou fragments de gènes. Dans ce cas, les informations dont on dispose sont données par les couples d’amorces pour lesquels l’amplification a fonctionné. Par conséquent, pour certains effecteurs (PTO1326, BA7003, RSc1800, RSc1801, RSp0296, PTO1391, RSc0868, PTO7001) les données portent sur seulement un fragment de gène et pas le gène entier. Aucune information n’a pu être obtenue pour le gène candidat PTO1808.

Mise en évidence de la présence des gènes étudiés dans la collection de souches

L’évaluation de la présence/absence des gènes candidats au sein des collections de souches permet de comprendre la distribution des effecteurs. Certains effecteurs comme RSp0099, RSc2775, RSp0854 et RSp0847 ont été détectés chez toutes les souches étudiées tandis que d’autres sont présents dans un nombre restreint de souches (Tableau 10). La comparaison des répartitions théoriques et réelles des effecteurs dans les phylotypes révèle que le gène RSc0826 est significativement associé au phylotype I, les gènes RSp1460 et RSc1801 se retrouvent plutôt associés au phylotype III tandis que les gènes PTO1391, PTO1326, PTO1265, BA7003 et PTO7001 sont significativement liés au phylotype IIB. Les gènes RSp1582, RSp1130, RSc1800, RSc1723 et RSp1384 sont retrouvés à la fois dans le phylotype I et le phylotype III. Etude des gènes présents : polymorphisme de longueur allélique Lors de l’amplification des gènes candidats, du polymorphisme de longueur a pu être détecté . Ce polymorphisme a différentes sources : – Un unique couple d’amorce permet d’amplifier des fragments de longueurs différentes selon les souches. C’est le cas de RSc0868 (PopP2) pour lequel la longueur attendue était de 980bp et des amplifications à 900bp ont été observées pour certaines souches. Le polymorphisme de longueur observé pour BA7003 est aussi expliqué par ce phénomène. – Pour les gènes amplifiés par plusieurs amorces, le polymorphisme de longueur s’explique par l’amplification par certaines amorces et pas par d’autres. Par exemple, deux couples d’amorces ont été dessinés pour amplifier PTO3560 : un couple amplifie le plus long fragment du groupe d’orthologues et un autre couple amplifie un fragment plus court (Figure 20, Annexe 4). Selon la souche, l’amplification a eu lieu pour un couple uniquement (noté 1) ou pour l’autre (noté 3) ou pour les deux (noté 4). L’absence de l’effecteur est notée 2 (Cf Matériel et méthodes V.1.). Les gènes candidats RSp0847 (popW), RSc2775 (AWR4) et RSp0028 (GALA3) présentent aussi du polymorphisme de longueur dû au dessin de plusieurs couples d’amorces. Les gènes RSc2775 et RSp0847 détectés chez toutes les souches (Cf

Réalisation de groupes de souches au contenu similaire en T3E

Une analyse multivariée a permis de regrouper les souches selon leur répertoire d’effecteurs afin de pouvoir choisir des souches représentatives de la diversité du contenu en effecteurs pour l’inoculation. Cette analyse tenant compte du polymorphisme de longueur est réalisée sans a priori sur la contribution des effecteurs dans la virulence. Six groupes ont été retenus pour leur représentativité de la diversité et leur relative homogénéité en contenu d’effecteurs (Figure 21). Les groupes 1 et 2 ont une composition similaire en effecteurs mais ont été séparés car le groupe 2 rassemble des souches qui possèdent certains effecteurs d’avirulence comme RSp1384 et RSc0868. Au contraire, les groupes 3 et 4 regroupent des souches au contenu en effecteurs quasiment opposé (mis à part les gènes présents chez toutes les souches), c’est-à-dire que les gènes absents chez un groupe sont présents chez l’autre. L’intérêt de cette distinction sera de vérifier si les souches contenues dans ces groupes ont des phénotypes opposés.  Relation entre le répertoire d’effecteurs et le phylotype des souches Les groupes de souches réalisés selon leur contenu en effecteurs peuvent être comparés aux groupes phylogénétiques (Tableau 12). Les groupes réalisés associent des souches de même phylotype en général : le groupe 1 est composé des trois souches émergentes de Martinique appartenant au phylotype IIB séquévar 4 NPB (Non Pathogenic on Banana). Le groupe 2 regroupe toutes les souches du phylotype IIA. Le groupe 3 rassemble le reste des souches du phylotype IIB et une souche du phylotype III. Le groupe 4 est composé de souches du phylotype III uniquement tandis que le groupe 5 contient des souches du phylotype I. Le groupe 6 associe une souche appartenant au phylotype I et une du phylotype III.

Choix des souches pour les inoculations

Compte tenu des restrictions spatiales liées à l’utilisation d’un local de Niveau de Sécurité 3 (NS3), nous avons uniquement pu utiliser 11 souches pour les inoculations. Ces souches ont donc été choisies dans les 6 groupes pour la représentativité de leur répertoire d’effecteurs et leur diversité phylotypique.

Les données phénotypiques : taux de flétrissement, indice de colonisation, aire sous la courbe de développement de la maladie (AUDPC)

Reproductibilité des données des deux inoculations

Les plants témoins

A chaque inoculation, des plants témoins ont été placés dans la même chambre climatique que les plants inoculés afin de détecter d’éventuelles contaminations. Les plants témoins ont aussi présenté des feuilles flétries sans pour autant être colonisés par la bactérie. Dans l’analyse qui suit, seules les notations 3 et 4 (flétrissement complet) ont donc été retenues.

La comparaison des données répétées aux deux dates

Les inoculations ont été réalisées à deux dates différentes. Afin de pouvoir comparer l’agressivité de l’ensemble des souches utilisées, il est nécessaire de vérifier que la date d’inoculation n’a pas d’effet significatif sur les résultats de maladie. L’effet date a donc été testé sur les données de maladie provoquées par RUN17, souche inoculée sur les mêmes cultivars aux deux dates. La comparaison des taux de flétrissement, taux de colonisation et des valeurs de l’AUDPC indique que les résultats ne sont pas significativement différents d’une date à l’autre (Probabilité critique > 5%)  Nous avons donc pu regrouper les données d’inoculation aux deux dates pour l’analyse.

Table des matières

Introduction bibliographique

I. Ralstonia solanacearum, une bactérie responsable du flétrissement bactérien et présente sur une large gamme d’hôtes
1. La gamme d’hôtes
2. Le flétrissement bactérien : symptômes, cycle infectieux
II. L’agent pathogène Ralstonia solanacearum 
1. Présentation de la bactérie : structure et formes
2. Taxonomie et phylogénie de la bactérie
3. Les facteurs de virulence chez Ralstonia solanacearum
III. La lutte contre la bactérie
1. Les moyens de lutte disponibles : lutte réglementaire, lutte prophylactique, lutte culturale, lutte
physique et chimique
2. La lutte génétique : sélection et utilisation de variétés résistantes
IV. Les effecteurs de type 3 expliquent-ils les phénotypes de virulence ou d’avirulence sur
plants ?
1. Présentation des effecteurs de type 3 (T3Es)
2. Etat des connaissances sur la distribution des T3E chez Ralstonia solanacearum
3. Avancées des recherches sur la détermination du phénotype de virulence par les T3Es chez
d’autres organismes
V. Le contexte et la problématique du stage
1. Le contexte, démarche initiale
2. La problématique et les objectifs
B. Matériel et méthodes
I. Les souches bactériennes
1. La collection de souches de la core-RS2
2. La collection de souches réunionnaises
3. L’isolement des souches et l’extraction d’ADN
II. Le matériel végétal
1. Aubergine (Solanum melongena): les accessions sensibles et résistantes
2. Tomate (Solanum lycopersicum): les accessions sensibles et résistantes
III. La sélection des T3Es et l’amplification par PCR, étude du génotype
1. Réalisation d’une liste de gènes orthologues aux T3Es candidats
2. Détermination d’amorces
3. Amplifications par PCR
IV. Les tests de pathogénicité : étude du phénotype
1. Les conditions de croissance des plants
2. Le dispositif d’expérimentation
3. La méthode d’inoculation des plants
4. L’évaluation du développement de la maladie
V. L’analyse des données
1. Réalisation des groupes de souches aux contenus en effecteurs similaires
2. Reproductibilité des données des deux dates d’inoculation
3. Distinction des valeurs des taux de flétrissement, taux de colonisation et AUDPC entre
4. Typologie phénotypique des souches utilisées pour l’inoculation
5. L’analyse factorielle des correspondances entre les phénotypes et les effecteurs              Résultats
I. Les données génotypiques : présence et polymorphisme des gènes candidats
1. Mise en évidence de la présence des gènes étudiés dans la collection de souches
2. Etude des gènes présents : polymorphisme de longueur allélique
3. Réalisation de groupes de souches au contenu similaire en T3Es
4. Relation entre le répertoire d’effecteurs et le phylotype des souches
II. Les données phénotypiques : taux de flétrissement, indice de colonisation, aire sous la courbe
de développement de la maladie (AUDPC)
1. Reproductibilité des données des deux inoculations
2. Analyse des données obtenues sur plants sensibles (T10 et E8)
3. Analyse des données obtenues sur plants résistants (T5, E1 et E6)
4. Réalisation de groupes de souches au phénotype similaire
III. Confrontation des données phénotypiques et génotypiques
1. Comparaison des classifications phénotypiques et de la classification génotypique
2. Identification des effecteurs les plus associés aux phénotypes
D. Discussion
I. La distribution des effecteurs se structure en six profils
II. Certains effecteurs sont associés à des phénotypes tranchés sur les cultivars étudiés
III. Bilan sur la méthodologie adoptée
1. Reproductibilité des données des deux inoculations
2. Les apports du séquençage des gènes présents à la fois chez des souches virulentes
IV. Originalité de cette étude et le bilan sur les effecteurs de type 3 connus
1. L’originalité et les apports de cette étude
2. Bilan sur les gènes connus
V. Perspectives de l’étude
Références bibliographiques
Liste des annexes

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