La lignocellulose et sa dégradation

La lignocellulose et sa dégradation 

La lignocellulose est un macropolymère produit par les végétaux ; la lignocellulose est en effet le composant principal de la paroi cellulaire et peut représenter jusqu’à 90% du poids sec (Faraco, 2013). Elle est ainsi le biopolymère le plus abondant sur Terre. Sa principale fonction est d’assurer la résistance mécanique et physique permettant la turgescence des cellules végétales. Cette résistance est rendue possible par la composition et la structure de la lignocellulose, même si celles-ci varient en fonction des espèces végétales (Vassilev et al., 2012), des conditions locales, climatiques et écologiques. La résistance et la complexité de la lignocellulose la rendent également difficile à dégrader, ce qui présente des intérêts écologiques pour les plantes en termes de défenses et de maintien de leur intégrité, mais est un obstacle pour son utilisation comme source de carbone renouvelable (Chen et al., 2008). Pourtant, l’agriculture et les industries forestières produisent de larges quantités de déchets lignocellulosiques riches en carbone, principalement polysaccharides et composés aromatiques, qui peuvent être valorisés sous forme de biocarburants, bioplastiques et autres dérivés chimiques (synthons) d’intérêt industriel. La conversion de la lignocellulose en produits chimiques à haute valeur ajoutée est donc l’un des enjeux majeurs de notre siècle pour remplacer le flux des matières d’origine pétrolière par des ressources renouvelables et durables.

Constituants de la lignocellulose 

La lignocellulose est principalement composée de trois polymères : cellulose, hémicellulose et lignine. Ceux-ci sont associés en une matrice hétérogène dont la cohésion est assurée à la fois par la résistance des différents composants et par des liaisons entre eux.

Fraction cellulosique

La cellulose est le constituant structural des cellules végétales. Son abondance varie entre 35 et 60% en fonction de l’espèce végétale ou de l’organe concerné, ce qui en fait le composant majoritaire de la lignocellulose. La cellulose est une macromolécule linéaire constituée de monomères de cellobiose, l’association de deux molécules de glucose liées par une liaison covalente en β1-4. Son degré de polymérisation, qui peut être extêmement variable, a un effet important sur ses propriétés et sa dégradabilité. La liaison en β1-4 permet des liaisons hydrogène intra et inter-chaînes , ce qui confère une grande résistance aux chaînes et surtout aux assemblages de chaînes, nommés microfibrilles (de 20 à 300 chaînes) et fibres (plus de 300 chaînes). Ces liaisons peuvent être à l’origine d’agencements ordonnés ou désordonnés, on parle alors de cellulose cristalline ou de cellulose amorphe. Le niveau de cristallinité de la cellulose a une influence sur l’accessibilité du substrat aux cellulases, et la cellulose amorphe présente des niveaux de dégradation 70% plus élevés que la fraction cristalline (Jeoh et al., 2007).

La conversion des fibres de cellulose en monomères de glucose requière trois types de cellulases, ou glycoside hydrolases. Les endoglucanases permettent hydrolyser des liaisons osidiques à l’intérieur des chaînes de cellulose, les exoglucanases ou cellobiohydrolases libèrent du cellobiose (un dimère de glucose) à partir des extrémités réductrices libres, et enfin les β-glucosidases hydrolysent le cellobiose en deux molécules de glucose .

Fraction hémi-cellulosique

L’hémicellulose diffère de la cellulose par son hétérogénéité biochimique. En effet, elle n’est pas constituée d’un monomère unique mais est un assemblage d’hétéropolymères constitués de pentoses (xylose, arabinose), d’hexoses (mannose, glucose, galactose) et d’acides glucuroniques. Les proportions de chaque composant peuvent varier d’une lignocellulose à l’autre. Alors que les bois tendres sont plutôt composés de glucomannanes, l’hémicellulose des plantes herbacées est souvent dominée par le xylose qui forme des chaînes liées en β1-4 appelées xylan. La composition plus hétérogène de l’hémicellulose et son organisation en chaînes latérales courtes, d’une plus grande accessibilité (Laureano-Perez et al., 2005), en font une molécule plus facilement hydrolysable que la cellulose. Néanmoins, du fait de son hétérogénéité, son hydrolyse requière une plus grande diversité d’enzymes, capables de s’attaquer aux différentes combinaisons de monomères et de liaisons.

La chaîne principale, composée de xylan dans le cas des plantes herbacées, peut être attaquée à l’intérieur de la chaîne par des endoxylanases, et les extrémités de chaînes peuvent libérer du xylobiose avec l’action d’exoxylanases. Les chaînes latérales doivent être également hydrolysées pour permettre l’accès au squelette de xylan. En fonction de la composition de ces chaînes latérales, différents types d’enzymes peuvent être impliquées, dont les plus fréquentes α arabinofuranosidases, acetylxylan esterases ou α-glucuronidases. Une fois des dimères libérés, ceux-ci sont alors hydrolysés en monomères par des enzymes spécifiques, dont des βxylosidases pour le xylobiose .

Lignine

La lignine est un polymère de molécules à cycles aromatiques dérivés de la phénylalanine, un acide aminé aromatique, comme les alcools p-coumaryliques, coniféryliques ou sinapyliques. Hormis cette composition à base de 3 principaux dérivés aromatiques, il n’existe pas de réelle unité dans ce qu’on regroupe sous le terme de lignine, les lignines pouvant être très variables entre espèces et même au sein d’une même espèce. Leurs fonctions principales sont de conférer imperméabilité, résistance mécanique et protection contre les attaques microbiennes. Sa structure complexe et variable, son hydrophobicité et sa très forte stabilité du fait de ses cycles aromatiques et la variété des liaisons qu’elle peut établir en font un obstacle très fort à l’hydrolyse des fibres de lignocellulose qui en sont imprégnées (Hendriks and Zeeman, 2009).

De fait, la lignine est difficilement dégradable pour la plupart des microorganismes, à l’exception notable de champignons (Ascomycètes et Basidiomycètes principalement). Ceuxci sécrètent des enzymes, regroupées sous le nom de ligninases, classifiées principalement en phénol-oxydases (ou laccases), peroxydases à hème et enzymes accessoires.

Les laccases sont une famille d’oxydoréductases dont le mode d’action repose sur le couplage entre la réduction d’O2 en H20 avec l’oxydation de substrats comme les phénols ou la lignine. Les laccases connues partagent une structure tridimensionnelle commune en 3 domaines, le site actif contenant des ions cuivre, intervenants centraux de la réaction redox. Les peroxydases à hème se divisent en plusieurs catégories, lignine peroxydases, manganèseperoxydases et versatile peroxydases. Elles sont toutes H2O2 dépendantes et sont capables d’oxyder des substrats aromatiques phénoliques ou non phénoliques. L’optimum d’activité de la plupart d’entre elles se situe à un pH très acide.

Les enzymes accessoires ne sont pas directement impliquées dans la dégradation de la lignine mais interviennent dans des activités nécessaires en amont de l’action des ligninases, ou permettant de réduire les composés dérivés de la lignine. Elles incluent notamment des oxydases permettant la production de peroxyde d’hydrogène dont sont dépendantes les peroxydases.

Structure

La lignocellulose résulte donc du mélange, en proportions variables selon l’espèce de plante et les tissus végétaux, de ces trois composants majeurs mais également d’autres composants minoritaires (pectines, protéines). Leur organisation complexe est mise en place lors de la construction de la paroi végétale et peut varier selon les différents tissus végétaux (parenchymes, tissus vasculaires, tissus de soutien…). L’entrecroisement des fibres et la présence d’imprégnations de lignine liées de manière covalente aux autres composants confèrent à la lignocellulose des propriétés de résistance supérieures à celles des composants pris individuellement, et en font un des polymères biologiques les plus résistants. Ces propriétés sont fondamentales pour la plante puisqu’elles permettent la turgescence cellulaire et donc le port dressé de la plante, mais sont également primordiales pour l’imperméabilité ou la défense face aux agressions extérieures.

Table des matières

INTRODUCTION
CHAPITRE I : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
I. La lignocellulose et sa dégradation
I.1. Constituants de la lignocellulose
I.1.1 Fraction cellulosique
I.1.2 Fraction hémi-cellulosique
I.1.3 Lignine
I.1.4 Structure
I.2. Procédés de valorisation actuels
I.2.1 Compostage et méthanisation
I.2.2 Plateforme des sucres
I.2.3 Plateforme des carboxylates
I.3. Prétraitements
I.3.1 Efficacité des prétraitements de la biomasse
I.3.2 Méthodes de prétraitement
I.3.3 Méthodes physiques de prétraitement
I.3.4 Méthodes chimiques de prétraitement
I.3.5 Méthodes physico-chimiques
I.3.6 Autres méthodes
II. Dégradation naturelle de la lignocellulose
II.1. Digestion de la biomasse chez les mammifères ruminants
II.2. Insectes
II.2.1 Les Termites
II.2.2 Termites inférieurs
II.2.3 Termites supérieurs
II.3. Études de la diversité associée à la dégradation de la lignocellulose
II.3.1 Exemple en système naturel : le rumen
II.3.2 Études en systèmes artificiels : bioréacteurs
.II.3.2.1 Enrichissements
.II.3.2.2 Évolution de la diversité au cours de la dégradation
.II.3.2.3 Effet des prétraitements
III. Méthodes et outils d’étude des communautés bactériennes
III.1. Gènes utilisés en écologie moléculaire
III.1.1 ARNr 16S
III.1.2 Autres marqueurs
III.1.3 Banques de données
III.2. Techniques de suivi
III.2.1 Les techniques sans séquençage
III.2.2 Techniques de séquençage
.III.2.2.1 Séquençage Sanger
.III.2.2.2 Le séquençage nouvelle génération (Next Genation Sequencing)
.III.2.2.3 Roche 454 system
.III.2.2.4 Illumina GA/HiSeq System
.III.2.2.5 Autres technologies
III.3. Analyse des données amplicon générés par NGS
III.3.1 Étapes clés et outils dédiés
.III.3.1.1 Nettoyage des données
.III.3.1.2 Déchimérisation
.III.3.1.3 Clustering
.III.3.1.4 Assignation taxonomique
III.3.2 Outils d’analyse de séquences généraux
.III.3.2.1 Mothur
.III.3.2.2 QIIME
III.4. Outils statistiques pour l’écologie moléculaire
III.4.1 Indices (diversité α)
III.4.2 Distances (diversité β)
III.4.3 Méthodes de projection et visualisation
CHAPITRE II : PROCEDURES EXPERIMENTALES
I. Origine des populations bactériennes
I.1. Rumen initial
I.2. Termites
I.2.1 Choix des espèces
I.2.2 Récolte et conditionnement
II. Dispositifs expérimentaux de culture en bioréacteur
II.1. Bioréacteurs du screening termites
II.1.1 Dispositif expérimental
II.1.2 Paramètres suivis
II.2. Bioréacteurs d’enrichissement rumen et termite
II.2.1 Dispositif expérimental
II.2.2 Paramètres suivis
II.2.3 Bioréacteurs paille stérile / non stérile (termites)
II.3. Bioréacteurs de cinétiques de caractérisation
II.3.1 Dispositif expérimental
II.3.2 Paramètres suivis
II.3.3 Prétraitements
II.3.4 Plan d’expériences
III. Analyses macrocinétiques
III.1. Mesure des matières volatiles résiduelles
III.2. Dosage des acides gras volatils produits
III.3. Dosage des sucres résiduels
III.4. Mesure des activités enzymatiques
IV. Outils moléculaires
IV.1. Méthode de co-extraction ADN/ARN
IV.2. Analyses par amplification de l’ADN 16S
IV.2.1 Dosage des copies 16S par qPCR
IV.2.2 Préparation des librairies MiSeq Illumina
.IV.2.2.1 PCR1 de préparation des librairies (amplification V3-V4)
.IV.2.2.2 PCR2 de préparation des librairies (ajout index et adaptateurs)
.IV.2.2.3 Lancement du séquençage sur MiSeq
V. Traitement des données de séquençage (pipeline IPS)
V.1. Formatage et création d’un fichier fasta unique
V.2. Nettoyage des données, pre-clustering, filtres de bruit et dé-chimérisation
V.3. Assignation taxonomique des séquences
V.4. Calcul des distances et clustering
V.5. Assignation taxonomique des OTUs et calcul de distance entre OTUs
V.6. Résultats, sorties graphiques et import R
VI. Analyse comparatives des dynamiques de communautés bactériennes
VI.1. Calcul des indices de diversité
VI.2. Statistiques exploratoires
VI.2.1 Analyses de projection de données (PCA et PLS)
VI.2.2 Méthodes de projections de distances
VI.3. Statistiques de test et classification supervisée
VI.3.1 ANOVA / PERMANOVA
VI.3.2 sPLS-DA
CHAPITRE III : VALIDATION DES METHODES DE TRAITEMENT DE DONNEES DE SEQUENCAGE
I. Introduction
II. Analyse de gros jeux de données 16S Illumina : impact d’un filtre de séquence singleton sur la description des communautés microbiennes
II.1. Abstract
II.2. Introduction
II.3. Results
II.3.1 Simulated datasets
II.3.2 Mock communities
II.3.3 Real datasets
II.3.4 Stress datasets
II.4. Discussion
II.4.1 Chimeras
II.4.2 Contaminants
II.4.3 Effect on community reconstruction
II.4.4 Rare filter
II.5. Material and methods
II.5.1 Simulated data
II.5.2 Sequencing
II.5.3 Data processing
II.5.4 Diversity analyses
II.6. Acknowledgments
II.7. References
II.8. Supplementary data
III. Conclusion du chapitre
CHAPITRE IV : STABILISATION ET CARACTERISATION D’UN INOCULUM ISSU DE RUMEN BOVIN
I. Introduction
II. Efficient anaerobic transformation of raw wheat straw by a robust cow rumen-derived microbial consortium
II.1. Abstract
II.2. Introduction
II.3. Material and methods
II.3.1 Lignocellulosic substrate and inoculum
II.3.2 Anaerobic reactors
II.3.3 Chemical analyses
II.3.4 Enzyme activity assays
II.3.5 Analysis of microbial diversity
II.4. Results and discussion
II.4.1 Enrichment: macro-kinetic and diversity analysis
II.4.2 Characterization of wheat straw degradation by consortium RWS
.II.4.2.1 Wheat straw degradadation and VFA production by RWS
.II.4.2.2 Effects of RWS activity on the physicochemical composition of wheat straw
.II.4.2.3 Enzymatic activity profiles along wheat straw degradation
II.5. Conclusion
II.6. Acknowledgements
II.7. References
III. Conclusion du chapitre
CONCLUSION

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