La lactate-déshydrogénase dans l’organisme

La lactate-déshydrogénase dans l’organisme

Méthodes de mesure de la LDH

Quelle que soit la méthode à laquelle on se réfère, la mesure de la LDH ne correspond pas à un dosage de l’enzyme elle-même, mais à une évaluation de son activité catalytique.

La méthode de référence

la spectrophotométrie La technique de mesure de référence pour la lactate déshydrogénase est la spectrophotométrie. En effet, lors de la transformation du lactate en pyruvate, du NADH est formé à partir de NAD+. Or, comme on peut le voir sur la Figure 7, NAD+ et NADH ont un spectre d’absorption différent. La zone d’intérêt se situe entre 300 et 400 nm, où l’absorption est nulle pour le NAD+ mais où le NADH présente un second pic d’absorption, lié au cycle nicotinamide. On note également que l’absorption est nulle pour le lactate et le pyruvate.
Cette méthode est applicable à la mesure de l’activité de la LDH sérique. Ainsi, le sérum est mélangé à une quantité connue de NADH. Le mélange réagit pendant un temps défini, pour que le pyruvate du sérum soit consommé. Une quantité définie de pyruvate est ensuite ajoutée, et la disparition du NADH est mesurée par spectrophotométrie selon la méthode décrite précédemment (Wroblewski & LaDue, 1955).
La réaction opposée (catalyse de lactate en pyruvate et de NAD+ en NADH) peut également être utilisée, mais les tests utilisant cette réaction sont moins fiables (Amador et al, 1963).

Autres méthodes de mesure

Une méthode alternative de mesure consiste à utiliser la fluorimétrie. Les molécules de NADH formées lors de la conversion du lactate en pyruvate présentent en effet une fluorescence propre (Lakowicz et al, 1992) : en solution, elles présentent un pic d’émission à 460 nm, avec une durée de vie à l’état excité de 0,4 ns. Une méthode de mesure plus récente, par ailleurs commercialisée sous forme de kits de test (https://www.abcam.com/lactate-dehydrogenase-ldh-assay-kit-fluorometric-ab197000.html), consiste à utiliser le NADH produit pour réduire une molécule non fluorescente en une molécule à fluorescence élevée, puis à mesurer cette dernière. Cette méthode implique l’ajout d’une enzyme catalysant cette réaction.A titre d’exemple, Larsen (2005) a montré qu’il était possible d’utiliser la résazurine (une molécule non fluorescente) et d’exploiter sa catalyse par la diaphorase (enzyme utilisant le NADH) en résorufine, une molécule hautement fluorescente. L’étude de la fluorescence permettra de déduire la quantité de NADH initialement disponible, et donc l’activité de la LDH en amont.Une autre méthode, décrite par Sulaiman et al. en 2014, consiste à évaluer la formation du NAD+ par polarographie à impulsion différentielle. L’étude a montré qu’en utilisant une électrode Ag-AgCl et une solution tampon de pyrophosphate (pH 7,5), à laquelle était ajoutée 0.1 ml de sérum, un pic polarographique bien défini apparaissait à -1.1 V. La sensibilité et la spécificité du test étant élevées, il serait donc applicable en médecine.Enfin, plusieurs méthodes de mesure colorimétriques existent, mais sont aujourd’hui plus anecdotiques car remplacées par des méthodes plus fiables. A titre d’exemple, le NADH peut être mesuré par la formation de formazan (Decker et al, 1988). Dans ce test, le NADH formé lors de la conversion du lactate en pyruvate est utilisé par la diaphorase pour former du FADH2 (forme réduite de la flavine adénine dinucléotide) à partir de FAD (forme oxydée). Le FADH2 va alors transférer des électrons à l’INT (2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5phenyl-2H-tetrazolium chloride), un sel de tétrazolium, ce qui donnera du formazan (Figure 9). La couleur rouge du formazan pourra être observée, mais aussi mesurée par spectrophotométrie à une longueur d’onde de 490 nm.

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Table des matières

REMERCIEMENTS
LISTE DES FIGURES
LISTE DES TABLEAUX
LISTE DES ABREVIATIONS
INTRODUCTION
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE : La lactate-déshydrogénase
1 – La lactate-déshydrogénase dans l’organisme
1.1 – Structure de la LDH
1.2 – Fonctions de la LDH dans l’organisme
1.3 – Synthèse et régulation de la LDH : exemple du gène LDHA
1.4 – Méthodes de mesure de la LDH
2 – Intérêts médicaux de la mesure de la LDH
2.1 – La LDH en médecine humaine
2.2 – La LDH en médecine vétérinaire
ÉTUDE EXPÉRIMENTALE
1 – Objectifs de l’étude expérimentale
2 – Matériels et méthodes
2.1 – Caractéristiques de l’exploitation
2.2 – Procédure expérimentale
2.3 – Qualification des vaches
3. Résultats et interprétations
3.1. Description de l’ensemble de l’échantillon étudié
3.2. Intérêt des alarmes mammites
3.3. Exploitation de la mesure de l’activité de la LDH
4. Discussion
4.1. Conditions expérimentales
4.2. Analyse des données
4.3. Bilan des résultats
CONCLUSION
BIBLIOGRAPHIE