La huntingtine sauvage

La huntingtine sauvage

Structure de la protéine

La htt sauvage est une protéine de haut poids moléculaire de 348KDa. Le gène HD a une expression ubiquitaire avec un niveau d’expression plus élevé dans le cerveau que dans les organes périphériques. Dans le cerveau, son expression est plus forte dans les neurones que dans les cellules gliales (DiFiglia et al., 1995). Les domaines qui composent la htt sont relativement bien connus (Figure3).
Le domaine NT17se situe dans les 17 premiers acides aminés de la partie Nterminale de la protéine. Il est hautementconservé pendant l’évolution et de nombreuses fonctions ont été récemment identifiées. Il permettrait la liaison de la htt aux membranes périphériques (Atwal etal., 2007; Rockabrand et al., 2007). Ce domaine interagit avec les protéines du pore nucléaire TPR (Transient Potential Receptor) qui exportent les protéines du noyau au cytoplasme (Cornett et al., 2005).
Le domaine polyGln (Q(n))commence aux dix-huitièmes acides aminés, il permet l’interaction avec de nombreuses protéines. Chez les vertébrés, il est suivi du domaine polyProline(P(n)) qui jouerait un rôle dans la solubilité de la htt. Le nombre de répétitions dans les domaines polyGln et polyP nécessaires au bon fonctionnement de la protéine est dépendant de l’espèce où elle est exprimée (Harjes and Wanker, 2003; Li and Li, 2004). Les 3 domaines HEAT(Huntington, Elongation Factor 3, PR65/A, TOR) sontlongs d’environ quarante acides aminés, chacun de ces domaines sont organisés en clusters. Ils sont structurés en deux hélices alpha anti-parallèles disposées autour d’un même axe. La signature du motifHEAT est la présence d’Aspartate et d’Arginine en position respective 19 et 25. On retrouve ce domaine dans des protéines dites « cargo » liées au transport (exportine, importine) et à la ségrégation des chromosomes. Le domaine NES (Nuclear export signal) pourrait indiquer l’implication de la htt dans l’exportation de protéine du noyau au cytoplasme (Xia et al., 2003). La htt a été aussi trouvé dans le noyau, elle possède donc un domaine NLS qui semblerait peu actif.
La htt a été la première protéine neuronale découverte comme substrat des caspases (Goldberg et al., 1996). Elle présente des sites de clivage pour la caspase 3 en 513 et 552, pour la caspase 2 en 552 et pour la caspase 6 en 586 (Wellington et al., 1998;Wellington and Hayden, 2000; Graham et al., 2010). La htt est aussi clivée par la calpaïne en 469 et 536 (Gafni and Ellerby, 2002). La htt peut subir des modifications post traductionnelles. Les lysines (K6, K9, K15) de son domaine NT17 peuvent être soient SUMOylées (Steffan et al., 2004) soient ubiquitinilées. La htt est phosphorylée sur la sérine 421 (Zala et al., 2008) et sur la sérine 434. Elle peut aussi être palmitoylée par la protéine HIP 14 (Huntingtin-Interacting Protein 14) (Huang et al., 2008).

Rôle

Embryogenèse et développement

La htt est indispensable pendant l’embryogenèse. La délétion de la htt dans les souris (hdh -/-) a pour conséquence une létalité in uteroentre E8.5-E10.5 (Nasir et al., 1995). À E6.5 les embryons deses souris KO ne présentent pas de différence avec des embryons de souris WT du même âge.À E7.5, ils présentent un retard et une désorganisation cellulaire ce qui ne les empêche pas d’entrer dans la phase de gastrulation. L’épiblaste présente alors un accroissement du phénomène  d’apoptose (Zeitlin et al., 1995). L’injection de cellules ES Hdh -/Hdh dans des souris sauvages au stade blastocyste (E4) permet une embryogenèse normale et une survie des souris au-delà de la naissance (Dragatsis etal., 1998). La htt est donc indispensable dans la partie très précoce de l’embryogenèse. Récemment, il a été montré que la htt possède un rôle déterminant dans la formation des faisceaux microtubulaires. La htt interagit avec le complexe dynactine/dynéine pendant la mitose permettant la bonne ségrégation des chromosomes. Elle participerait aussi à l’orientation de la cellule embryonnaire et à la neurogénèse (Godin et al., 2010). Les cellules souches embryonnaires de souris KO pour la htt présentent un défaut de localisation des organelles (mitochondrie, réticulum endoplasmique, appareil de Golgi (HilditchMaguire et al., 2000)).

Transcription

La htt interagit avec de nombreux facteurs de transcription dont CREB (cAmp response element) (McCampbell et al., 2000; Steffan et al., 2000), p53 (McCampbell et al., 2000; Steffan et al., 2000), le co-activateur CA150 (Holbert et al., 2001) et le co- répresseur CtBP (Kegel et al., 2002).
La protéine « RE1-silencing transcription factor » (REST) est cytoplasmique.
Lorsqu’elle migre au noyau,elle a la capacité de se lier à des facteurs de transcription (sin3A,coREST, HDAC) afin decréer un complexe capable de se fixer sur la séquence « Repressor Element 1 » (RE1) présent sur de nombreux gènes et ainsi inhiber leur transcription. La htt sauvage a la capacité de se lier à REST dans le cytoplasme. Cette liaison va empêcher sa translocation au noyau et son interaction à RE1 (Zuccato et al., 2003). Cet événement a pour conséquence de promouvoir la transcription des gènes régulés par RE1 tels que le Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF). La liaison de la htt à REST serait indirecte viases interactions avec la « Htt Associated Protein 1 » (HAP1) et la « Rab Interacting Lysosomal Protein » (RILP) (Shimojo, 2008). Le complexe répresseur N-cor et Sin3A réprime la transcription en se liant à des récepteurs nucléaires afin d’empêcher leur ligand de s’y fixer. La htt se fixe à ces protéines et lève l’inhibition (Boutell et al., 1999). La « Specificity Protein 1 » (SP1) est un activateur transcriptionnel dont la principale fonction est le recrutement du facteur de transcription « TBP Associated Factor 130 » (TAF4) à l’ADN pour activer la transcription de certains gènes. La htt jouerait le rôle de protéine de plateforme en permettant à Sp1 et à TAF4 de se fixer et ainsi d’agir positivement sur la régulation des gènes (Dunah et al., 2002; Li et al., 2002).

Rôle pro survie

Des expériences de transgénèse sur dessouris ont permis de démontrer in vivo la capacité de la htt à favoriser la survie. Des souris modèles de la MH (YAC) « Know out » (KO) pour la htt sauvage présentent des anomalies liées à la reproduction (infertilité, apoptose testiculaire massive suivie d’une atrophie). La recouvrance du gène htt dans les générations suivantes diminue la gravité du phénotype observé. La réexpression de la htt à l’âge adulte module négativement l’apoptose dans lescellules testiculaires (Leavitt et al., 2001).
L’apoptose est un processus de mort cellulaire génétiquementprogrammée qui intervient dans le développement. Après ce stade, elle est activée en réponse à des stimuli extérieurs toxiques. Les acteurs de l’apoptose sont principalement des protéases et plus particulièrement des caspases. Les caspases initiatrices (2, 8, 9,10) permettent l’initiation de la cascadeapoptotique réalisée par les caspases exécutrices (Figure 4)
La htt est probablement impliquée dans l’apoptose post-développementale. La surexpression de la htt sauvage in vitro prévient la mort cellulaire des neurones du striatum. Ces derniers soumisà des stimuli apoptotiques présentent une inhibition du clivage de la pro-caspase 9 en caspase active ce qui empêche l’activation de la caspase 3 et bloque la cascade apoptotique (Rigamonti et al., 2000; Rigamonti et al., 2001). Le complexe « Htt interacting protein1″(HIP1) – « Htt interacting protein1 » (HIPPI) est capable d’activer la caspase 8. La htt en interagissant avec HIP1 réduit la formation du complexe et l’activation de la voie apoptotique (Gervais et al., 2002).

Endocytose

L’endocytose est un processus de transport intracellulaire qui est présent chez toutes les cellules eucaryotes. Il existeplusieurs types d’endocytose correspondants à différentes molécules « cargo » à transporter. Je ne développerai que « l’endocytose clathrine dépendante ». L’endocytose clathrine dépendante permet le recyclage et le renouvellement des récepteurs à la membrane synaptique de la cellule. Les récepteurs sont transportés par le complexe adaptateur de la clathrine, « l’Adaptor Protein 2 » (AP2).La clathrine forme une structure en « triskélion » qui se lie à l’AP2. La membrane s’invagine alors jusqu’à fusion des 2 extrémités par l’action de la dynamine créant une vésicule intracellulaire. Le récepteur internalisé sera alors soit dégradé soit recyclé à la membrane (Figure 6).

La huntingtine mutée

Concept gain /perte de fonction

La mutation de la htt entraîne à la fois uneperte partielle des fonctions de la protéine sauvage et un gain de fonction toxique pour la htt-m. Son expansion de polyGln modifie les interactions protéiques et perturbe la protéolyse de la protéine ainsi que de nombreuses fonctions cellulaires qui sont développées ci-dessous dont la transcription et le transport.

Neurogénèse

La htt-m, tout comme la forme sauvage, est indispensable au bon développement et à la viabilité de l’embryon (Dragatsis et al., 1998). La perte de fonction de la htt sauvage engendre des modifications du réseau microtubulaire lors de la mise en place de la polarité dans lenéocortex (Godin et al., 2010). Les souris modèles de la MH (R6/1, R6/2) présentent un défaut de neurogénèse au niveau du gyrus denté, du bulbe olfactif et de l’hippocampe sans affecterle striatum (Gil et al., 2005; Lazic et al., 2006).

Transcription

L’expansion polyGln de lahtt-m modifie sa liaison avec ses partenaires protéiques en perturbant l’affinité d’interaction.
De nombreux facteurs de transcription (Sp1, p53, TBP, TAF4, CBP) ayant une affinité accrue pour la htt-m due à son expansion polyGln, se retrouvent séquestrés dans les inclusions intranucléaires formées parla htt-m, les empêchant ainsi de jouer leur rôle dans la transcription (Dunah etal., 2002; Li et al., 2002; Sugars and Rubinsztein, 2003). De cettemanière, la htt-m diminue le pool de facteurs de transcription disponible et réprime ainsi latranscription. L’association Sp1/TAF4 est très fortement diminuée dans les extraitsde cerveaux de patients symptomatiques et asymptomatiques comparés à des sujets sains (Dunah et al., 2002).
La htt-m interagit avec la protéine CBP (CREB binding protein) viason domaine acétyltransférase et polyGln. L’expansion de son domaine polyGln augmente son affinité pour CBP. CBP, liée à la htt-m, ne peut alors plus jouer son rôle ce qui a pour conséquence de réprimer la transcription liée à CRE et médiée par CBP (Nucifora 2001). L’expression des gènes liés à la régulation de la séquence CRE est diminuée dans la MH chez l’Homme (Glass et al., 2000).
Des travaux récents présentent des résultats opposés chez la souris double transgénique pour la htt-m et la CRE-βgalactosidase (Obrietan and Hoyt, 2004). Les niveaux de CREB phosphorylé et des gènes régulés par CREB sont élevés ce qui suggère que la htt-m faciliteraitla transcription CRE dépendante. L’expansion polyGln diminue l’interaction de la htt-m avec REST. REST est alors libre de migrer au noyau où il s’accumuleet exerce sa fonction d’extinction de gènes neuronaux, dont celui du BDNF (Zuccato et al., 2003).
La transcription est également perturbée par la modification du « modelage » de la chromatine. Les histones sont acétylées par des Histones AcétylTransférases (HAT) ce qui permet une conformation ouverte de la chromatine qui devient accessible aux facteurs de transcription. Elles peuvent aussi être déacétylées par des Histones Déacétylases (HDAC) qui favorisent une compaction de la chromatine réprimant ainsi la transcription. Les HAT et les HDAC ontaussi pour substrat des protéines non histones telles que la tubuline, p53, Sp1 et STAT1 (pour revue (Langley et al., 2005). Dans le contexte de la MH, l’acétylation des histones est diminuée alors que le phénomène de méthylation est accru favorisant ainsi la déacétylation des histones etla repression de la transcritption. L’utilisation d’inhibiteurs des HDAC améliore les symptômes moteurs observés dans des modèles de la MH: chez la drosophile (httex1p) (Steffan et al.,2001; Pallos et al., 2008) et chez les rongeurs (R/2 et N171-82Q) (Hockly et al., 2003). Ils permettent un recouvrement de la transcription, une amélioration du phénotype moteur et une augmentation du transport microtubulaire en particulier celui du BDNF (Dompierre et al., 2007) et un gain pour la survie.

Clivage de la htt-m

L’expansion polygGln modifie la protéolyse de la htt-m. Difiglia et collaborateurs ont découvert dans les extraits de cerveaux de patients des fragments de htt-m de différentes tailles (DiFiglia et al., 1997). Le clivage de la htt-m est dû à l’action de plusieurs protéases. Les caspases 3 et 6 seraient responsables de son clivage dans sa partie N-terminale et génèreraient des fragments de 70,75 et 80 KDa (Wellington and Hayden, 2000; Graham et al., 2006). Seuls les fragments issus du clivage par la caspase 3 ont été observés dans les cerveaux des patients de la MH (Goldberg et al., 1996; Wellington et al., 1998).
Les calpaïnes sont des cystéines protéases dépendantes du calcium et sont enrichies dans les neurones. Il existe 2 isoformes majoritaires dans le cerveau : la mcalpaïne et la µ-calpaïne. Les calpaïnes µ etm peuvent cliver la htt-m (Kim et al., 2001) aux résidus 469 et 536 (Gafni et al., 2004). La calpaïne µ est responsable des fragments les plus petits observés (40-60kda) (Mende-Mueller et al., 2001).
L’expression de la calpaïne µ est induite fortement dans les souris transgéniques de la maladie (YAC128) (Cowan et al., 2008) et dans le noyau caudé de patient (Gafni and Ellerby, 2002). Dans un modèle pharmacologique de la pathologie utilisant l’acide 3 nitropropionique (3NP), le niveau de la calpaïne µ activée est élevé dans le striatum de rats et est corrélé à une amplification de la mortcellulaire (Bizat et al., 2003). De plus, l’inhibition pharmacologique de la calpaïne a un effet neuroprotecteur sur le striatum (Bizat et al., 2003). Il existe une corrélation entre la longueur de l’expansion glutamine et le niveau de protéolyse de la htt-m in vitro par les protéases (Cammarata et al., 1993).
Des fragments de la htt-m observés dans deslignées cellulaires exprimant la htt-m, ne correspondent pas à l’action deprotéases connues. C’est le cas des fragments « cp-a » et « cp-b » générés par la coupure de la htt respectivement entre 104 -144 aminés et 146 -214 acidesaminés (Lunkes et al., 2002).
Les métalloprotéases (MMP) sont des endopeptidases dépendantes du Zinc.
La htt-m est clivée par la MMP-10 en position 402. Le niveau de MMP10 activée est fortement accru dans les souris modèles de la MH (YAC128, R6/2) (Miller et al., 2010). L’augmentation d’activité de laMMP10 observée est positivement proportionnelle à l’âge des souris (Miller etal., 2010) et donc évolue avec l’avancée de la pathologie.
Ces fragments de htt-m clivés N-terminaux sont toxiques et conduiraient à la mort cellulaire (Cooper et al., 1998; Martindale et al., 1998). Les fragments Nterm correspondants à l’exon 1 sont plus toxiques que la forme entière dans les expériences in vitro,les modèles animaux et chez les patients (DiFiglia et al., 1997;Lunkes et al., 1998; Saudou et al., 1998; Li et al., 2000). L’invalidation des sites de clivage des 5 caspases (caspase 1, 3, 6, 7, 8) sur la htt-m diminue la mortalité cellulaire observée in vitro(Wellington and Hayden, 2000). L’inhibition du site de coupure de la caspase 6 sur la htt-m ralentit la pathogénicité de la protéine in vivo (Graham et al., 2006). L’inhibition de MMP-10 diminue la mort neuronale dans la lignée murine Hdh 111Q/111Q et diminue les déficits moteurs des drosophiles exprimant la Htt336 128Q (Miller et al., 2010).
Les mécanismes par lesquels la htt-m clivée nuirait à la viabilité de la cellule restent mal compris. Les fragments N-terminaux clivés peuvent se transloquer dans le noyau. C’est le cas des fragments « cp-a » que l’on retrouve majoritairement dans le noyau sous forme d’inclusions (Lunkes etal., 2002). La translocation de la htt-m clivée est régulée par le niveau de phosphorylation des fragments. La phosphorylation de la htt-m sur la sérine 13 etde manière déterminante sur la sérine 16 augmente la quantité de fragments dans le noyau (Gu et al., 2009; Havel et al., 2011). La phosphorylation sur le sérine 16 diminue fortement l’interaction de la htt-m avec la protéine TPR impliquée dans l’export de protéine du noyau au cytoplasme (Cornett et al., 2005). Ces deux phénomènes concomitants permettraient l’accumulation des fragments N-terminaux de la htt-m au noyau qui est une étape clé pour la mort neuronale dans la MH (Saudou et al., 1998).

Les agrégats

Les agrégats ou « inclusions» ont été mis en évidence par l’immunoréaction contre l’ubiquitine et la htt-m dans l’étude de souris transgéniques (R6/2) modèles de la maladie (Mangiarini et al., 1996; Davies et al., 1997) et dans l’étude post-mortem de cerveaux de patients (Roizin, 1979; DiFiglia et al., 1997) (Figure 7). Leur rôle dans la physiopathologie est toujours discuté, mais ils restent une signature de la MH. La protéolyse de la htt-m génère des fragments N-terminaux capables de  s’accumuler et de former des agrégats. Ils contiennent un grand nombre d’autres protéines en particulier l’ubiquitine. Le nombre d’agrégats augmente avec la progression de la maladie.

Apoptose

La htt-m subit une protéolyse dans son domaine N-terminal par notamment les caspases, principales protéines effectrices de l’apoptose. Chez les patients atteints de la MH, on note une élévation des niveaux de la caspase 1 (Ona et al., 1999), la caspase 8 (Sanchez et al., 1999) et la caspase 6 (Graham et al., 2010). En effet, le niveau de la caspase 6 activée est très élevé dans les extraits de striatum de patients en stade précoce et pré-symptomatique de la MH et en l’absence d’activation de la caspase 3 (Graham et al., 2010). Le niveau d’activation de la caspase 6 dans le striatum est corrélé avec le nombre de CAG porté par les patients de la MH (Graham et al., 2010). La caspase 6 active seraità l’origine d’un fragment de 586 acides aminés de la htt-m qui pourrait concourir à l’amplification de lacascade d’activation apoptotique. De plus, l’inhibition d’activation des caspases 6 et 3 dans les MSN de souris modèles de la MH (YAC128) diminuela mortalité observée suite à un stress excitotoxique (Graham et al., 2010). La caspase 6 bien que décrite comme une caspase effectrice serait impliquée précocement dans la MH alors que la caspase 3 le serait dans des stades avancés de la maladie (Hermel et al., 2004).
Les mécanismes par lesquels la htt-m peut déclencher l’apoptose sont peu connus. L’état de phosphorylation de la htt-m apparaît êtreun élément clé de cette régulation. L’Insulin Growth Factor 1 (IGF-1) est un facteur de croissance permettant la prolifération cellulaire. IGF-1 a un effet neuroprotecteur vis-à-vis du striatum dans le modèle excitotoxique du QA de la MH (Alexi et al., 1999; Escartin et al., 2007).
Cette protection serait due à l’action d’IGF-1 sur la voie PI3K/Akt. IGF-1 activerait Akt qui irait alors phosphoryler la htt-m sur la sérine 421. Cette phosphorylation diminuerait la capacité de la htt-m à déclencher la caspase apoptotique (Humbert et al., 2002).

Modélisation de la MH

Depuis la découverte de la mutation dugène responsable de la MH en 1993, de nombreux modèles génétiques ont été générés à différents niveaux de complexité de Caenorhabditis elegans au primate non humain. Les modèles murins sont les plus nombreux et les plus utilisés pour comprendre la physiopathologie de la MH. Chaque modèle développé reproduit en partie les symptômes moteurs, cognitifs et anatomopathologiques de lamaladie sans jamais la reproduire exactement. Parmi les très nombreux modèles animaux murins (Annexe II, pour revue (Menalled and Chesselet, 2002), je me focaliserai sur la description du modèle de la souris transgénique BACHD et sur les modèles viraux utilisés dans ce travail de thèse.

La souris BACHD

La lignée des BACHD exprime le chromosome artificiel bactérien (BAC) contenant la totalité de la htt humaine souscontrôle du promoteur humain de la htt avec des séquences flanquantes d’ADN génomique en 5′ et 3′ (20kb et 50kb respectivement). L’exon 1 sauvage a été remplacé par l’exon 1 muté contenant 97 CAA-CAG (Gray et al., 2008). La souris BACHD exprime deux allèles murins et un allèle humain de la htt. Deux sites LoxP ont été introduits dans la partie 5’ non traduite et dans l’intron 1 en aval de l’exon 1. Ainsi en présence de la recombinase Cre, l’exon 1 pourra être excisé. Les souris BACHD pourront ainsi être utilisées comme un modèle d’inactivation conditionnelle de la htt (Figure 12).

Table des matières
REMERCIEMENTS 
RESUMÉ
TABLES DES MATIERES
LISTE DES FIGURES
LISTE DES TABLES
ABRÉVIATIONS 
INTRODUCTION 
I. Le striatum 
I.1 ANATOMIE
I.1.1 Réseaux fonctionnels des ganglions de la base
I.1.2 Populations cellulaires du striatum
II. La maladie de Huntington 
II.1 HISTORIQUE
II.2 DESCRIPTION CLINIQUE
II.2.1 Symptômes /Étiologie
II.2.2 Observations neuro-pathologiques
II.3 Thérapie
II.4 GENETIQUE DE LA MH
III. La huntingtine sauvage
III.1 STRUCTURE DE LA PROTEINE
III.2 ROLE
III.2.1 Embryogenèse et développement
III.2.2 Transcription
III.2.3 Rôle pro survie
III.2.4 Transport
III.2.5 Endocytose
IV. La huntingtine mutée
IV.1 CONCEPT GAIN /PERTE DE FONCTION
IV.2 NEUROGENESE
IV.3 TRANSCRIPTION
IV.4 CLIVAGE DE LA HTT-M
IV.5 LES AGREGATS
IV.6 TRANSPORT
IV.7 DEREGULATION DE L’HOMEOSTASIE CALCIQUE:L’HYPOTHESE DE « L’EXCITOTOXICITE»
IV.7.1 Excitotoxicité directe
IV.7.2 Excitotoxicité indirecte
La mitochondrie
IV.8 DEGRADATION ET MORT CELLULAIRE
IV.8.1 Le système ubiquitine protéasome (UPS)
IV.8.2 Autophagie
IV.8.3 Apoptose
V. Modélisation de la MH
V.1 LA SOURIS BACHD
V.2 TRANSFERT DE GENES
VI. Vulnérabilité du striatum
VI.1 DOPAMINE
VI.2 LE RECEPTEUR A L’ADENOSINE DE SOUS TYPE A2A
VI.3 LE RECEPTEUR AUX CANNABINOÏDES DE TYPE 1 (CB1)
VI.4 RAS HOMOLOG ENRICHED IN STRIATUM (RHES)
V. Objectifs des études
VII.1 ST102 (2010001M06RIK OU WBSCR26)
VII.2 CRYSTALLINE µ (CRYM)
VII.3 GCOUPLED RECEPTOR 88PROTEIN (GPR88)
VII.4 CAPUCINE (TMEM90A)
VII.5 DOUBLE CORTIN LIKE KINASE 3 (DCLK3)
VII.6 PARADIGME EXPERIMENTAL
ARTICLES
In vivo assessment of Capucin as a potential modifier of mutantHuntingtin toxicity
Potential role of Double cortin like kinase 3 (Dclk3) in selective striatal
vulnerability in Huntington’s disease
RÉSULTATS PRÉLIMINAIRES
Gpr88 module l’expression de DARPP-32 en présence de la huntingtine mutée
LA CRYSTALLINE MU (CRYM)EST UN FACTEUR PRO-TOXIQUE DANS LA MALADIE DE HUNTINGTON
2010001M06RIK (ST102)DIMINUE LA SENSIBILITE DU STRIATUM VIS-A-VIS DE LA HUNTINGTINE MUTEE
DISCUSSION 
PERSPECTIVES 
ANNEXES
ANNEXE I :REVUE « MITOCHONDRIA IN HD »
ANNEXE II : TABLEAU RECAPITULATIF DES MODELES MURINS DE LA MH
ANNEXE III : REVUE SUR RHES
ANNEXE IV : METHODE SAGE
ANNEXE V : Vecteurs lentiviraux
ANNEXE VI : Matériels et Méthodes
ANNEXE VII : Clivage de Dclk3
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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