La génomique au service du dépistage d’affections génétiques

Le « re-séquençage » des espèces animales

La séquence de référence des différentes espèces ainsi déterminée, des variations interindividuelles de séquence (polymorphismes) peuvent être détectées en alignant des séquences d’individus ou de mélanges d’individus de populations différentes sur cette séquence de base. Les différences détectées dans ce contexte sont majoritairement de type SNP, mais peuvent aussi être des InDels (courtes insertions ou délétions nucléotidiques), des CNV, etc.. Bien que la plupart des polymorphismes n’aient pas ou peu de conséquences phénotypiques, leur étude fine par le re-séquençage permet d’une part de détecter puis de préciser les régions du génome impliquées dans l’expression de caractères phénotypiques, et d’autre part de comprendre l’histoire des populations naturelles ou sélectionnées. On peut ainsi identifier des régions du génome ayant subi des pressions de sélection importantes, au point d’entraîner une diminution locale de la variabilité (Vignal, 2011).

Le projet 1000 génomes illustre parfaitement ce concept : initié en 2008 et finalisé en 2015, ce programme de caractérisation du large spectre géographique et fonctionnel de la variabilité génomique humaine fournit une base solide d’aide à la compréhension de la contribution génétique aux maladies chez l’Homme. Cette description exhaustive des variations du génome humain a pu être réalisée grâce au séquençage « tout-génome » à basse couverture, au séquençage d’exomes et au génotypage dense par biopuces (ces termes seront précisés par la suite) de divers groupes d’individus issus de multiples populations. Deux articles récapitulant les différentes étapes et résultats du projet ont été publiés à son stade final, analysant les données issues du génotypage de 2 504 individus de 26 populations différentes (provenant de 5 régions

Les données épigénomiques (l’épigénome)

On abordera de manière succincte les données épigénomiques, puisqu’elles n’interviennent pas directement dans cette thèse ; leur présentation est tout de même justifiée en ceci qu’elles sont également intégrées dans les études et analyses, au même titre que les autres données « omiques ».

L’épigénomique est une science « omique » récente et en plein essor : il s’agit de l’étude des modifications réversibles et héritables de l’ADN qui régulent l’expression génomique, telles que la méthylation des cytosines, la modification post-traductionnelle (méthylation, acétylation, phosphorylation notamment) des extrémités amino-terminales des histones, protéines intimement liées à l’ADN, le remodelage des nucléosomes (complexe nucléoprotéique formé d’un ensemble de protéines histones structurant l’ADN en un premier niveau de compaction ; il représente l’unité de base de la chromatine), les variations d’architecture tridimensionnelle de la chromatine et toute autre modification ayant pour conséquence un changement d’accessibilité de l’ADN. Les modifications des histones sont une des « voies » épigénétiques les plus étudiées (Kouzarides, 2007) ; toutes ces modifications biochimiques, quelle que soit leur nature, influent sur la transcription de l’ADN, certaines affectent la réparation de l’ADN, ou sa réplication ; la condensation de l’ADN est, quant à elle, impactée uniquement par l’acétylation et la phosphorylation des histones (Kouzarides, 2007).

L’épigénomique regroupe donc un ensemble de mécanismes aboutissant à des modifications phénotypiques sans modification de la séquence d’ADN mais avec des changements de structure du génome. Des mécanismes de nature épigénétique contribuent à la régulation de différents phénomènes biologiques, comme par exemple l’« empreinte génomique » (aussi appelé « empreinte parentale », phénomène épigénétique par lequel certains gènes peuvent être exprimés de manière « parent-spécifique »), l’inactivation du chromosome X, le développement de l’embryon et la reprogrammation cellulaire, etc. ; de nombreuses modifications épigénétiques induites par l’environnement ont également été décrites, certaines étant

Encart : les micro ARN

L’importance toute particulière des miARN dans le cadre de la partie expérimentale de cette thèse justifie leur présentation de manière détaillée dans cet encart. Ce sont une des trois classes de petits ARN simple brin non codants, constitués de 20 à 24 (ou 21 à 23, selon les sources) nucléotides, assurant la régulation post-transcriptionnelle de l’expression génétique en se liant aux protéines de la famille argonaute. L’étude de ces petits ARN particuliers est à l’origine d’une science à part entière : la microtranscriptomique ou microRNomics, sous-discipline de la génomique fonctionnelle et de la transcriptomique, se concentrant sur l’identification des miARN et l’analyse de l’expression, la biogenèse, la structure, les cibles, ainsi que les fonctions biologiques des miARN à une échelle génomique, ainsi que leur rôle dans la régulation de l’expression génomique. L’expression des miARN est tissu-spécifique.

Cette spécificité associée à la possibilité de les mesurer dans le sang circulant, ainsi que leur stabilité (liée à l’association à des complexes particulaires ou protéiques assurant leur protection contre les RNases) en font de bons biomarqueurs (la notion de biomarqueur sera développée par la suite). Depuis Juin 2014, 28 645 miARN sont répertoriés dans la base de données miRBase (version miRBase 21) (http://www.mirbase.org/).

Les miARN sont impliqués dans de nombreux mécanismes essentiels à la vie cellulaire tels que le métabolisme et le cycle cellulaire, l’apoptose, le développement et la différenciation cellulaire, la réponse au stress et la signalisation hormonale. Toute variation qualitative ou quantitative de leur expression peut être associée au développement de nombreuses affections, ce qui explique en partie leur utilisation en tant que biomarqueurs (de cancers, de prédisposition à la résistance aux thérapeutiques, etc.). Les miARN sont des répresseurs post-transcriptionnels, c’est-à-dire qu’ils guident la dégradation ou la répression de la traduction en protéine des ARN messagers cibles en s’y appariant de manière spécifique par quelques bases : en s’associant à des protéines de la famille Argonaute (AGO), ils guident des complexes appelés RNA-induced silencing complexes (RISC) aux ARNm auxquels ils s’apparient, avec une spécificité absolue ou relative.

INTRODUCTION 
I. ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE 
1. L’intégration de différentes sources de données en vue d’une prédiction phénotypique
a. Les données phénomiques
i. Le phénotype et ses différentes échelles
ii. Le phénome et les approches phénomiques
iii. Des exemples illustrant les approches de phénotypage à haut débit
> Le Mouse Phénome Project (M.P.P.)
> Le Human Phenome Project (H.P.P.)
iv. Les implications des campagnes de phénotypages actuelles : standardisation des mesures et ontologie des caractères
b. Les autres données « omiques » et leur production
i. Les données génomiques (génome)
> La constitution d’un assemblage de référence dans les difféntes espèces (séquence de référence)
> Le « re-séquençage » des espèces animales
> Le développement d’outils de génotypage à très haut débit : puces SNP (SNP beadchips, analyse de la variabilité du génome), à distinguer des puces d’expression / puces de gènes (DNA microarrays,analyse de l’expression du génome)
> Des connaissances affinées grâce aux innovations dans le domaine du séquençage
ii. Les données épigénomiques (l’épigénome)
iii. Les données transcriptomiques et microtranscriptomiques (le transcriptome et le microtranscriptome)
> Le transcriptome
Encart : les micro ARN
> Les outils de la transcriptomique
iv. Les données protéomiques (le protéome)
v. Les données métabolomiques (le métabolome)
c. Un zoom sur les données de génomique, transcriptomique, et autres « omiques» équines, et leur application en médecine vétérinaire (génomique clinique et autres sciences omiques équines appliquées)
i. Les débuts de la génomique équine : séquence de référence, assemblage
ii. Les outils disponibles
iii. Les méthodes pertinentes pour utiliser ces outils biomoléculaires dans l’étude de caractères génétiques
iv. Les applications principales des outils génomiques chez le cheval
> La génomique au service du dépistage d’affections génétiques
o L’identification de gènes responsables d’affections monogéniques
o Un manque d’informations épidémio-génétiques
o L’opportunité du conseil génétique grâce au testage
> La génomique au service du diagnostic clinique et de la médecine personnalisée
o La prédisposition aux affections « complexes »
o Des outils de diagnostic et de pronostic
o Les outils thérapeutiques du futur ?
> La génomique au service de la gestion du cheval athlète
o La caractérisation des aptitudes
o Des biomarqueurs pour le suivi de l’état physiologique et le contrôle antidopage
o La nutrigénomique et l’optimisation de la nutrition
d. Quelques applications (exemples) d’utilisation des données « omiques » dans d’autres espèces que l’espèce équine
e. Les méthodologies statistiques utilisées pour l’intégration de différentes sources de données « omiques »
Encart : La biologie intégrative
2. La prédiction phénotypique appliquée aux performances sportives d’endurance
a. Chez l’Homme : à la recherche de biomarqueurs de l’effort d’endurance
i. Les effets d’un exercice physique intense de type « endurance »
ii. Les biomarqueurs de l’effort d’endurance, ou quand les –omiques se mettent au service (de la prédiction) des performances sportives d’endurance
iii. Un nouveau concept : la sportomique
b. Chez l’animal athlète : exemple du cheval
i. La détermination d’un phénotype sportif associé à l’endurance équine : les premiers pas du projet GenEndurance (2011-2014 ; C. Robert, E. Barrey)
– Présentation des objectifs et synthèse du projet
– Pertinence du cheval d’endurance comme modèle
– Déroulement des 3 étapes successives et complémentaires du projet
– Résultats préliminaires du projet
o Première étape
o Deuxième étape
o Troisième étape
ii. Etude sur les transcriptome (ARNm), microtranscriptome (miARN), métabolome (métabolites) et leurs liens lors d’un effort d’endurance chez le cheval
II. ETUDE EXPERIMENTALE
1. Introduction et objectifs de l’article
2. Article final publié dans Scientific Reports
3. Résultats, conclusion et perspectives
CONCLUSION 
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXES

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