Soutenance mémoire
Une diversité importante des systèmes de vision s’est développée dans le règne animal au cours de l’évolution. Les différences morphologiques, anatomiques et moléculaires de l’œil permettent à chaque espèce d’extraire de manière unique et adaptée les informations sur les caractéristiques spatiales, temporelles, chromatiques (relatives aux couleurs) ou achromatiques (relatives à la luminosité) de la lumière qui lui sont nécessaire pour interagir avec son environnement (Lythgoe, 1979). Chez l’homme par exemple, la rétine est composée de cônes et de bâtonnets (Osorio et al, 2008). Les premiers sont sensibles aux couleurs et les seconds sont sensibles à la luminosité et sont utilisés essentiellement dans la vision crépusculaire (Jacobs et al, 2003 ; Jacobs et al, 2009 ; Fujun et al, 2012). Les humains ont une vision diurne trichromatique, c’est-à-dire que les couleurs sont perçues à l’aide de trois types de cônes dans une gamme d’onde allant de 400 nm à 700 nm (figure 1) (Jacobs, 2007). Chez les arthropodes, la vue est basée sur un système d’ommatidies. Les ommatidies contiennent un ensemble de cellules photoréceptrices entourées par des cellules de soutien et des cellules pigmentaires. Ces cellules sont rassemblées autour d’un axe principal appelé rhabdome (Briscoe et Chitkka, 2001). Les arthropodes peuvent avoir des visions dichromatiques, trichromatiques et même tétrachromatiques (Osorio et al, 2008). Certaines espèces sont capables de percevoir des longueurs d’ondes invisibles pour l’œil humain et de détecter un signal chromatique dans l’ultraviolet (UV) ou dans l’infrarouge (IR) (Andersson et Amudsen, 1997). A notre connaissance la vision la plus développée du règne animal est celle des crevettes-mantes du genre Stomatopoda. Leur œil, composé de trois pupilles interdépendantes, contient 16 types de photorécepteurs lui permettant d’être sensible de l’UV jusqu’à l’IR. De plus certains de ces photorécepteurs sont utilisés pour visualiser séparément les différents types de polarisation de la lumière (rectiligne, elliptique ou circulaire). Stomatopoda est le seul genre du règne animal à ce jour identifié comme possédant de telles caractéristiques (Cronin, 1989, 2001 ; Marshall, 1988, 1999 ; Mazel, 2004).
La fluorescence est une émission de lumière spontanée provoquée lors d’un processus de désexcitation d’une molécule ayant absorbée un photon (annexe 1). Ce terme est introduit par Stokes G.G. en 1853 (Stokes, 1853) cependant les premières observations de ce phénomène par Monardes remontent à 1565 (Monardes, 1565). Il s’agit de l’infusion de Lignum nephriticum, un diurétique traditionnel dérivé du bois de deux espèces d’arbres : le narra (Pterocarpus indicus) et le kidneywood Mexicain (Eysenhadtia polystacha) (Muyskens, 2006) (annexe 2). La réaction chimique de formation de la molécule fluorescente, la matlaline (figure 2), a été décrite récemment (Ulises Acuna et al, 2009). Son rendement quantique est de 100 %. Depuis d’autres familles de molécules fluorescences ont été isolées dans la nature (figure 2). Notons que certaines de ces structures sont découvertes pour la première fois par voie chimique et elles seront identifiées quelques années après en milieu naturel. Les molécules de la famille des coumarines et des fluorescéines sont des métabolites biosynthétisés respectivement par les scorpions et par les bactéries Pseudomonas fluorescens (Fet et Selden, 2007 ; Palleroni, 1984). Ces structures sont particulièrement connues pour leur utilisation comme sonde médicale dans diverses applications en biologie telles que la microscopie à fluorescence, la cytométrie en flux etc. (Chen et al, 2013 ; Yan et al, 2013). Les molécules de la famille des xanthones, constituants des plantes de la famille des Clusiaceae et des Bonnetiaceae, sont notables de part leur fluorescence en milieu aqueux. Cette propriété est très recherchée dans le domaine médical notamment pour une utilisation dans les milieux biologiques (Heinz et al, 2006). Les pigments des végétaux tels que les chlorophylles ou les bétaxanthines (Gandia-Herrero et al, 2004; Gandia-Herrero et al, 2010 ; Maxwell et al, 2000) ont également été identifiés tout comme la quinine issue de l’écorce d’arbres de Cinchona. Certains flavonoïdes sont fluorescents et cette propriété est couramment utilisée en physiologie végétale (Buer et al, 2010). Cependant la faible intensité du signal de fluorescence nécessite l’utilisation de DAPI (4’,6’-diamidino-2-phénylindole) et DPBA (dérivé boré). Ces molécules créaient des liaisons chimiques avec les flavonoïdes pour former des complexes dont l’émission est bien plus intense que celle des flavonoïdes seuls .
Enfin, la structure du fluorophore de la Green Fluorescent Protein (GFP) a été découverte en 1962 dans la méduse Aequorea victoria (Shimomura, 1962), ce qui valut un prix Nobel à l’équipe responsable de cette découverte.
Extraction des composés fluorescents
Les anthères sont ajoutées dans un erlenmeyer de 250 mL contenant 200 mL de méthanol. L’erlenmeyer est bouché à l’aide d’un coton et d’un film paraffine et la solution est mise sous agitation à température ambiante pendant plusieurs jours. Le coton alors obtenu après plusieurs jours en présence des vapeurs de la solution méthanolique possède une fluorescence intense. Il est utilisé dans le test N°3. La solution est ensuite versée dans un ballon monocole de 500 mL de façon délicate afin de ne pas introduite le matériel végétal solide. Un volume de 200 mL est à nouveau introduit dans l’erlenmeyer afin de réaliser une deuxième extraction. Trois extractions successives sont généralement nécessaires et la solution n’est plus fluorescente à partir de la quatrième extraction. Le méthanol est évaporé à l’aide d’un évaporateur rotatif et l’opération est arrêtée quand un volume de 50 mL est atteint. La solution est prélevée à l’aide d’une seringue de 20 mL qui une fois remplie est surmontée d’un filtre circulaire de 0,45 µm. Le filtrat est introduit dans un ballon monocole de 50 mL puis le solvant est évaporé pour obtenir la masse de l’extrait sec.
Séparation des composées sur colonne chromatographique de silice
Le produit est dissout dans le méthanol et 1 g de silice (Merck 60-F) par gramme d’extrait sec est introduit dans le ballon. Après évaporation totale du solvant la silice imprégnée d’extrait est ajoutée à un gel de silice (80 à 100 g/g d’extrait sec) dans colonne chromatographique préremplie. L’éluant utilisé est constitué d’un mélange éthanol, acétate d’éthyle et éther de pétrole, dans les proportions respectives suivantes : 20%, 30% et 50%. La fraction fluorescente jaune/verte est suivie lors de son élution avec une lampe UV et elle est récoltée en une seule fois dans un ballon monocole de 500 mL pour ensuite être évaporée à l’évaporateur rotatif. Le produit sec est suspendu de nouveau dans quelques mL de méthanol et il est introduit dans un speed vacuum jusqu’à évaporation totale du solvant pour obtenir une masse de produits fluorescents purifiés prête pour de nouvelles purifications (CCM préparative ou HPLC) ou pour analyse RMN.
Chromatographie sur couche mince (CCM)
La fraction fluorescente est déposée sur une plaque de silice afin de réaliser cette fois une purification par chromatographie sur couche mince (CCM) préparative. La migration des produits sur la plaque de silice est réalisée avec différents éluants afin d’obtenir une séparation optimale. Les ratios des différents mélanges de solvants sont inspirés de la littérature (Bilia et al, 1994 ; Atta et al, 2011). Les bandes fluorescentes sont prélevées en grattant délicatement la silice. Cette dernière est mise en suspension dans le méthanol afin de solubiliser les produits élués. Après filtration à l’aide d’un filtre circulaire de 0,45 µm la solution est introduite dans un speed vacuum jusqu’à évaporation totale du solvant pour obtenir une masse de produits fluorescents purifiés. Trois plaques successives sont réalisées pour obtenir une masse de produits suffisante pour l’analyse RMN.
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Table des matières
INTRODUCTION
MATÉRIEL ET MÉTHODE
Sites et méthode d’échantillonnage
Modèles d’étude
Élevage
Test de choix
Analyses statistiques
Préparation des anthères
Extraction des composés fluorescents
Séparation des composées sur colonne chromatographique de silice
Chromatographie sur couche mince (CCM)
Analyses par HPLC (High Pressure Liquid Chromatography)
Hydrolyse par reflux acide
Tests pH métriques
RMN (Résonance Magnétique nucléaire)
Analyses photophysiques
RESULTATS
Elevage
Tests comportementaux
Rendements d’extraction
Purification
Hydrolyse
CCM
RMN
Préparation des anthères
Spectres d’émissions
DISCUSSION
Elevage
Test comportementaux
Phytochimie / Photophysique
CONCLUSION
BIBLIOGRAPHIE
