La double fecondation chez les angiospermes

LA REPRODUCTION SEXUÉE

Anatomie de la fleur

La fleur est une structure complexe portant les organes reproducteurs : l’androcée est la partie mâle de la fleur, elle est composée d’étamines. Les étamines sont composées d’un filet surmonté d’anthères dans lesquelles les grains de pollen seront formés puis libérés une fois arrivés à maturité. Le gynécée ou pistil est la partie femelle de la fleur et comporte un ou plusieurs carpelles. Ce carpelle est composé de l’ovaire, d’un style surmonté d’un stigmate qui est le réceptacle sur lequel le pollen mature germera.

Les structures des stigmates et des styles varient selon les espèces et peuvent être classées en plusieurs catégories (Allen et al., 2010). Chez Arabidopsis thaliana (A. thaliana), les stigmates sont secs, et possèdent à la surface des papilles une fine pellicule hydratée de protéines, de glycoprotéines et de lipides (Tung et al., 2005 ; Allen et al., 2010 ; Lehner et al., 2010). Tandis que chez le tabac ou la tomate, les stigmates humides sécrètent une abondante quantité d’exsudats hydrophiles riches en sucre ou d’exsudats riches en lipides, jouant un rôle prépondérant pour diriger le tube pollinique en croissance (Mollet et al., 2007). Il existe également les stigmates semi-secs (stade intermédiaire entre les stigmates secs et humides). Les styles peuvent être creux ou pleins. A. thaliana, le tabac ou la tomate possèdent un style plein (Figure 3 A). Celui-ci est constitué de cellules spécialisées formant le tissu de transmission dans lequel les tubes polliniques se développent de façon intrusive (Lord, 2000). Le lys possède un style creux (Figure 3 B). Celui-ci est constitué d’un canal bordé par l’épiderme du tissu de transmission. Un exsudat est sécrété permettant entre autres le guidage et l’adhésion des tubes polliniques (Mollet et al., 2000 ; Lord, 2001).

Autour de ces organes reproducteurs se trouvent la corolle, ensemble des pétales, et le calice, ensemble des sépales formant une enveloppe protégeant la corolle, généralement de couleur verte.

La double fécondation chez les angiospermes

Chez les angiospermes comme A. thaliana, la reproduction sexuée commence par la pollinisation au cours de laquelle les gamétophytes mâles ou grains de pollen adhèrent aux papilles du stigmate (Zinkl et al., 1999) (Figure 4). La réhydratation des grains de pollen sur le stigmate due à l’absorption de l’eau permet la germination du grain. Durant cette hydratation des grains de pollen, les vacuoles turgescentes poussent le cytoplasme vers une des trois apertures du grain de pollen permettant la rupture de l’intine et/ou de l’exine : c’est le début de la croissance du tube pollinique (Lord et Russell, 2002).

Un tube pollinique se développe et croît à travers le tissu de transmission du style afin d’aller féconder les ovules. Pour cela, les tubes pénètrent la paroi des papilles, entrent dans le style court et grandissent dans l’apoplaste des cellules spécialisées du tissu de transmission enrichi en nutriment extracellulaire (Kandasamy et al., 1994 ; Lennon et al., 1998). A ce moment, le tube pollinique héberge trois noyaux distincts qui sont le noyau végétatif et les deux gamètes mâles fonctionnels. Le noyau végétatif contrôle la croissance du tube. La taille des tubes polliniques est très variable selon les espèces mais peut atteindre in-vivo une cinquantaine de centimètres chez les plantes à style long comme le maïs. Le tube pollinique est une cellule à croissance polarisée dont l’élongation se fait dans la zone apicale. Ainsi, afin de conserver un volume cellulaire relativement stable, la cellule végétative synthétise périodiquement, grâce aux callose synthases (Cai et al., 2011), des bouchons de callose permettant son maintien dans la zone apicale du tube. Lorsque le tube a atteint l’ovule, il éclate et libère les deux cellules spermatiques aboutissant à la double fécondation (Figure 4). Dès lors, l’œuf principal, qui résulte de la fusion entre un noyau spermatique et l’oosphère (fécondation vraie), prolifère en un embryon. La fusion du second noyau spermatique avec les deux noyaux polaires de l’ovule (pseudo-fécondation), donne naissance à l’albumen, destiné à servir de réserves nutritives à l’embryon. Cet albumen subsistera au cours de la maturation de la graine (graine albuminée) ou sera digéré par l‘embryon afin de stocker les réserves dans les cotylédons (graine exalbuminée).

Formation des gamétophytes

Formation des ovules

La gamétogenèse femelle est une succession d’étapes ayant lieu dans la partie ovarienne de la plante. Le mégasporocyte, cellule initiale, subit une division méïotique aboutissant à la formation de 4 cellules haploïdes (Figure 4). Sur l’ensemble de ces cellules, trois vont dégénérer tandis que la quatrième cellule (le mégaspore) va subir trois mitoses successives et produire le gamétophyte femelle encore appelé le sac embryonnaire. Celui-ci, destiné à devenir le siège de la future fécondation, se trouve au centre du nucelle recouvert superficiellement par les téguments.

Le sac embryonnaire est composé de 8 noyaux répartis dans 7 cellules de taille inégale et de rôle distinct : une vaste cellule centrale pourvue de deux noyaux (noyaux polaires), trois cellules situées au voisinage de l’orifice de l’ovule, le micropyle (une cellule médiane (oosphère) entourée par deux cellules appelées synergides) et trois cellules autour du pôle opposé au micropyle (cellules antipodales) (Figure 4) (Bewley et al., 2000 ; Yadegari et Drews, 2004 ; Boavida et al., 2005).

Formation du pollen

La gamétogenèse mâle se déroule dans les anthères (Figure 5). Les grains de pollen, ou gamétophytes mâles, sont issus d’une méïose du sporocyte et seront libérés des anthères après leurs maturations (Twell et al., 1998 ; Honys et Twell, 2004). La cellule mère initiale (microsporocyte) subit une méïose qui donne 4 cellules filles haploïdes (microspore) en tétrade. Durant la prophase I, un dépôt massif de callose (β-1,3-glucane) apparait entre les différents microsporocytes (Figure 5 D). Les microspores sont séparés les uns des autres par la formation d’une paroi de callose. Par la suite, les microspores sont libérés de la tétrade par l’action conjointe d’enzymes comme des glucanases, des polygalacturonases (PGases) et des pectines méthylestérases (PMEs) issues du tapis staminal, couche cellulaire bordant les locules de l’anthère (Figure 5 E, F) (Hird et al., 1993 ; Rhee et al., 2003 ; Francis et al., 2006). Cette séparation permet ainsi l’expansion et la maturation de chaque microspore.

Après la méïose II, la formation de la paroi du pollen commence notamment avec le dépôt de fibrilles de cellulose (primexine) qui est renforcée par des protéines et des lipides. Le dépôt final de sporopollenine (composant principal de l’exine) donnera la taille et la forme du grain de pollen (Piffanelli et al., 1998) (Figure 5 G, H et Figure 6). Un nombre important de facteurs de transcription participant à la formation de l’exine a été récemment décrit. AtMYB103/MALE STERILE 188 (MS188) est un facteur de transcription qui est spécifiquement exprimé dans les anthères et les trichomes d’A. thaliana (Li et al., 1999 ; Higginson et al., 2003). Zhang et al., (2007) ont décrit que AtMYB103/MS188 régulait directement l’expression d’un gène précédemment décrit comme impliqué dans la formation de l’exine (MS2) ainsi que le gène callase-related A6. L’étude du mutant Knock-Out (KO) pour le gène AtMYB103/MS188 a montré une dégénérescence précoce du tapis staminal ainsi que des microspores anormaux (Zhang et al., 2007). Le gène MALE STERILE 1 (MS1)/HACKLY MICROSPORE (HKM), codant pour une protéine leucine zipper-like, est également impliqué dans la fonction du tapis staminal (Ariizumi et al., 2005 ; Vizcay-Barrena et Wilson, 2006 ; Ito et al., 2007 ; Yang et al., 2007). Les analyses phénotypiques du mutant ms1 indiquent que MS1 est impliqué dans la formation de la primexine, la synthèse de la sporopollenine ainsi que dans le développement du tapis staminal (Ito et al., 2007). L’étude du gène codant EFD (EXINE FORMATION DEFECT) a montré qu’il était aussi nécessaire pour la formation de la primexine et que l’absence d’expression de celui-ci induisait un défaut de fertilité du pollen chez A. thaliana (Hu et al., 2014). D’autres résultats ont aussi démontré que le gène MS1 est exprimé dans les cellules du tapis staminal (Yang et al., 2007). D’ailleurs, c’est à partir du tapis qu’une partie de l’exine se développe (Quilichini et al., 2014). Un autre facteur de transcription impliqué dans la formation de l’exine, a été identifié par Gibalová et al., (2009) qui ont démontré que les mutants Atbzip34 présentaient des défauts dans la structure de l’exine.

A la fin de la maturation du grain de pollen, l’exine est complète. Elle est composée de deux couches : la sexine (à l’extérieur) et la nexine (à l’intérieur) (Figure 6) (Paxson-Sowders et al., 1997). La sexine est majoritairement composée de sporopollenine (Lou et al., 2013). En plus de l’exine, le grain de pollen possède une paroi interne, l’intine, partiellement exposée à l’environnement via les apertures (Figure 6) et composée principalement de polysaccharides comme la callose, la cellulose et les pectines (Hesse et al., 2009).

La dernière étape de maturation du grain de pollen est la déshydratation. Cette étape est accompagnée de la mise en place du manteau pollinique, puis, d’un ralentissement progressif du métabolisme. En parallèle au cours de la maturation du pollen, le noyau subit une division mitotique asymétrique, donnant la cellule végétative et la cellule génératrice (Figure 5 G). Cette dernière subit une seconde mitose qui aboutira à la formation des deux cellules spermatiques (Twell, 2011). Cette mitose aura lieu avant l’anthèse chez les espèces trinucléées (A. thaliana ou le maïs) ou après la germination du grain de pollen chez les espèces bi-nucléées (le lys, le tabac ou la tomate) (Twell et al., 1998; Edlund et al., 2004; McCormick, 2004; Twell, 2006; Takeda et Paszkowski, 2006).

Table des matières

I. INTRODUCTION
I. 1. INTRODUCTION GÉNÉRALE
I. 2. LA REPRODUCTION SEXUÉE
I. 2. A. ANATOMIE DE LA FLEUR
I. 2. B. LA DOUBLE FECONDATION CHEZ LES ANGIOSPERMES
I. 2. C. FORMATION DES GAMETOPHYTES
2. c. 1. Formation des ovules
2. c. 2. Formation du pollen
I. 2. D. LA POLLINISATION ET LA CROISSANCE DU TUBE POLLINIQUE
2. d. 1. Les systèmes d’incompatibilité génétique
2. d. 2. L’implication de l’eau dans la germination du pollen
2. d. 3. L’implication des ions
2. d. 4. Les différents signaux de guidage
I. 2. E. LA CULTURE IN-VITRO DES TUBES POLLINIQUES
I. 3. LA PAROI VÉGÉTALE
I. 3. A. LA PAROI PRIMAIRE
I. 3. B. LES PROTEINES PARIETALES
3. b. 1. Les glycoprotéines riches en hydroxyproline (HRGP)
3. b. 2. Les protéines riches en proline (PRP)
I. 3. C. LES Β-GLUCANES
3. c. 1. La cellulose
3. c. 2. La callose
I. 3. D. LES HEMICELLULOSES
I. 3. E. LES PECTINES
3. e. 1. Le rhamnogalacturonane de type I (RG-I)
3. e. 2. Le rhamnogalacturonane de type II (RG-II)
3. e. 3. Le xylogalacturonane
3. e. 4. Les homogalacturonanes
I. 3. F. LES PROTEINES DE REMODELAGE DE LA PAROI
3. f. 1. L’expansion cellulaire : remodelage des xyloglucanes et de la cellulose
3. f. 2. Les pectines lyases
3. f. 3. Les glycosides hydrolases
I. 4. LES PECTINES MÉTHYLESTÉRASES : PMES
I. 4. A. STRUCTURE DES PMES
I. 4. B. LES MODES D’ACTIONS DES PMES
I. 4. C. LES DIFFERENTS GROUPES DE PME
I. 4. D. LA REGULATION DES PMES PAR LES PMEIS
4. d. 1. Les PMEIs
4. d. 2. Les PMEIs / Inhibiteurs d’invertases
I. 4. E. IMPLICATION DES PMES ET DES PMEIS DANS LE REMODELAGE DES HGS LORS DE LA CROISSANCE DU TUBE POLLINIQUE
OBJECTIF DU SUJET DE RECHERCHE
II. MATÉRIELS ET MÉTHODES
II.1. MATÉRIELS UTILISÉS
II. 1. A. LE MATERIEL VEGETAL
II. 1. B. LES SOUCHES BACTERIENNES
Escherichia coli
Agrobacterium tumefaciens
II. 1. C. LES VECTEURS PLASMIDIQUES
II. 2. MÉTHODOLOGIE EXPÉRIMENTALE DES CULTURES
II. 2. A. CULTURE ET TRANSFORMATION DES PLANTES
Stérilisation des graines
Mise en culture des plantes
Transformation des plantes avec A. tumefaciens par « floral dip »
II. 2. B. RECOLTE ET CULTURE DU POLLEN
Culture in-vitro du pollen en milieu liquide
Culture in-vitro du pollen sur milieu solide
Culture in-vitro du pollen en milieux modifiés
Culture du pollen in-vivo
Impact de la mutation sur les siliques et la production de graines
II. 2. C. MANIPULATION DES SOUCHES BACTERIENNES
Cultures bactériennes
Transformation d’E. coli par choc thermique
Transformation d’A. tumefaciens par choc thermique
II. 3. BIOLOGIE MOLÉCULAIRE
II. 3. A. EXTRACTION ET PURIFICATION D’ADN
Extraction d’ADN génomique
Extraction d’ADN plasmidique
II. 3. B. ANALYSE DE L’ADN
Amplification par la réaction de polymérisation en chaîne (PCR)
Digestion enzymatique des produits de PCR et des plasmides
Electrophorèse d’ADN
Séquençage de l’ADN
II. 3. C. ETUDE DE L’EXPRESSION DU PROMOTEUR DE LA PME48 : PROPME48
Clonage et purification de la séquence du promoteur du gène PME48
Principe de la technique LIC et insertion dans le vecteur pPLV (LIC compatible)
Obtention de l’expression stable chez A. thaliana
Sélection des plantes transformées
II. 3. D. SELECTION DES LIGNEES HOMOZYGOTES MUTANTES
Amplification par PCR
II. 3. E. ÉTUDE DE L’EXPRESSION DES GENES PAR QRT-PCR
II. 4. MÉTHODOLOGIE EN IMAGERIE CELLULAIRE
II. 4. A. ENRESINEMENT AU METHACRYLATE ET COUPE AU MICROTOME
Le méthacrylate
Coupes semi-fines
II. 4. B. MARQUAGES CYTOCHIMIQUES
Coloration GUS
Coloration à l’aniline bleue des tubes polliniques in-vivo
Test de viabilité au FDA (Fluorescein Di Acetate)
II. 4. C. IMMUNOMARQUAGES
Immunomarquage de surface
Immunomarquage sur coupes semi-fines
II. 4. D. MICROSCOPES, ACQUISITION ET TRAITEMENT D’IMAGES
II. 5. ANALYSES BIOCHIMIQUES
II. 5. A. EXTRACTION ET DOSAGE DES PROTEINES
Dosage protéique
II. 5. B. DOSAGE DE L’ACTIVITE PME
II. 5. C. FOCALISATION ISOELECTRIQUE ET ZYMOGRAMME
II. 5. D. ESTIMATION DU DEGRE DE METHYL-ESTERIFICATION DES HGS PAR SPECTROSCOPIE EN INFRA-ROUGE PAR TRANSFORMEE DE FOURRIER
II. 6. ANALYSE IN SILICO ET TRAITEMENTS STATISTIQUES
Analyse phylogénétique
Statistiques
III. RÉSULTATS
III. 1. ANALYSE DE L’EXPRESSION DES PMES DANS LES GRAINS DE POLLEN ET LES TUBES POLLINIQUES
SAUVAGES
III. 1. A. ANALYSES BIOINFORMATIQUES
III. 1. B. ANALYSE DES NIVEAUX D’EXPRESSION DES PMES PAR RT-QPCR
III. 1. C. CINETIQUE D’EXPRESSION DES PROMOTEURS
Analyse de l’expression de PROPPME1, PROPME48 et PROPME23 avec le gène rapporteur GUS
Analyse de l’expression du PROPME48 avec le gène sYFP
III. 2. SÉLECTION DES LIGNEES MUTANTES HOMOZYGOTES PAR PCR/RT-PCR
III. 2. A. CRIBLAGE GENETIQUE DES MUTANTS PME48-1 ET PME48-2
III. 2. B. CRIBLAGE GENETIQUE DE PPME1
III. 2. C. CRIBLAGE GENETIQUE DE PME23-1
III. 3. CARACTERISATION DU MUTANT HOMOZYGOTE PME48-1
III. 3. A. ANALYSES PHENOTYPIQUES ET BIOCHIMIQUES DU MUTANT HOMOZYGOTE PME48-1
III. 3. B. ANALYSE PAR QRT-PCR DES TRANSCRITS DES 14 PMES SPECIFIQUES DU POLLEN CHEZ PME48-1
III. 4. CARACTERISATION DES MUTANTS HOMOZYGOTES PPME1, PME48-2 ET PME23-1
III. 4. A. IMPACT DE LA MUTATION SUR LA FECONDATION ET LA PRODUCTION DE GRAINES
Croissance in-vivo des tubes polliniques mutants
Taille des siliques et production de graines
III. 4. B. ANALYSES PHENOTYPIQUES DES GRAINS DE POLLEN MUTANTS
La viabilité des grains de pollen ppme1 est sensiblement la même que celle du pollen sauvage
Le nombre de noyaux dans les grains de pollen mutants est conforme à celui du pollen sauvage
La longueur des grains de pollen secs est plus petite chez les mutants
Les grains de pollen mutants présentent un retard de germination in-vitro dépendant du type de milieu de culture
Les tubes polliniques des mutants pme48, ppme1 et pme23 sont instables
L’imbibition des grains de pollen ppme1 est perturbée
Les taux de germination des grains de pollen ppme1 sont améliorés en augmentant la concentration en CaCl2 dans le MG
III. 4. C. ETUDES IMMUNOCYTOCHIMIQUES DES GRAINS DE POLLEN ET DES TUBES POLLINIQUES PPME1 ET PME23-1 : Immunomarquages des HGs fortement méthyl-estérifiés avec LM20
III. 4. D. ANALYSE PAR QRT-PCR DES TRANSCRITS DES 14 PMES CHEZ PPME1
III. 5. EFFET DE L’AJOUT EXOGENE DE PME ET PMEI SUR LA GERMINATION ET LA CROISSANCE DES TUBES POLLINIQUES
III. 5. A. UTILISATION DE LA PME D’ORANGE
III. 5. B. UTILISATION DU PMEI DE KIWI
IV : DISCUSSION
CONCLUSION

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