Soutenance mémoire
La détection et l’identification de bactéries pathogènes revêt une grande importance dans de nombreux domaines tels que la santé et l’industrie agroalimentaire.
En microbiologie clinique La microbiologie doit répondre à des enjeux de santé publique majeurs tels que le développement des résistances bactériennes ou l’apparition de nouveaux pathogènes. Les échantillons cliniques peuvent être de nature très variable : prélèvements sur une plaie, nasal, vaginal etc. à l’aide d’écouvillons ou prélèvements de sang ou d’urine. Les pathogènes ciblés sont très divers et les charges bactériennes sont souvent faibles (par exemple, la concentration bactérienne moyenne dans une hémoculture est de quelques cfu/mL). Un isolement sur un milieu gélosé permet d’une part de séparer les bactéries pathogènes de la flore locale et/ou des cellules du patient. D’autre part, il permet d’augmenter la biomasse, en effet, les tests actuels d’identification requièrent un grand nombre de cellules. A partir de cet isolement, l’espèce est identifiée grâce à des tests biochimiques qui reposent sur certains caractères phénotypiques. En parallèle du test d’identification est réalisé un test de susceptibilité aux antibiotiques (ou « antibiogramme »).
En microbiologie industrielle Dans des domaines comme l’industrie pharmaceutique ou cosmétique des tests de stérilité sont souvent nécessaires. Dans l’industrie agroalimentaire, de multiples micro-organismes (bactéries, virus, parasites) sont susceptibles de contaminer les denrées alimentaires et d’engendrer diverses pathologies. [1] Les intoxications alimentaires dues à la présence de microorganismes représentent un réel enjeu de santé publique. Certaines espèces sont particulièrement recherchées . En plus des enjeux sanitaires, il existe de réels enjeux économiques puisqu’un rappel de lots en cas de contamination est très coûteux. Dans ce domaine, la difficulté repose sur le fait de séparer les pathogènes de la flore locale qui peut être abondante. Les méthodes de détection se déroulent en trois étapes : une première étape d’enrichissement dans un milieu non sélectif a pour but d’augmenter la concentration de tous les micro-organismes. La deuxième étape est un enrichissement sélectif dans un milieu spécifique pour favoriser la croissance du pathogène recherché par rapport à la flore dite « locale » (i.e. naturellement présente dans l’aliment). Enfin, à partir de cette culture, un isolement est réalisé sur un milieu gélosé en général sélectif lui-aussi, suivi de tests de confirmation (biochimiques ou sérologiques).
Pour des espèces comme Escherichia coli, une charge bactérienne seuil est acceptée ; un comptage (ou « numération ») est alors nécessaire et aucun enrichissement préalable à la numération ne peut avoir lieu. En revanche, pour d’autres espèces comme Salmonella ou des souches à toxines comme Escherichia coli O157 H7, la charge bactérienne acceptée est nulle. On peut alors dans ce cas procéder à un enrichissement puisque l’information de la charge bactérienne initiale dans l’aliment n’a aucune valeur.
Méthodes de détection
On distingue les tests de stérilité qui consistent à déterminer la présence ou l’absence de micro-organismes viables, et les tests de détection d’une espèce en particulier.
Les tests de stérilité sont notamment courants dans l’industrie pharmaceutique ou dans le domaine des dispositifs médicaux. Les hémocultures qui ont pour objectif la détection de pathogènes dans le sang sont aussi un exemple de tests de stérilité. Avant l’apparition d’automates, les échantillons étaient incubés dans un milieu nutritif, en conditions aérobies et anaérobies, et observés une fois par jour pendant au minimum dix jours. L’apparition d’un trouble dû à une concentration élevée en bactéries était le signe d’une pousse. Aujourd’hui, de nombreux automates ont vu le jour pour effectuer des tests de stérilité, et ont permis de diminuer le temps de détection des micro-organismes. Ces techniques sont souvent basées sur la détection de produits du métabolisme (détection du CO2 ou détection en impédance de petites molécules chargées). D’autres méthodes permettent de cibler une espèce en particulier, c’est le cas de la résonance plasmonique de surface où une molécule (protéine, anticorps ou bactériophage) se lie de façon spécifique avec le micro-organisme recherché.
Détection colorimétrique du CO2 La détection du CO2 est une méthode de choix puisque qu’il s’agit d’un métabolite rejeté par tous les micro-organismes. Depuis les premiers automates d’hémoculture à la fin des années 70, plusieurs appareils automatisés sont commercialisés et basés sur différentes techniques. Par exemple, dans les flacons commercialisés par BioLumix, le CO2 émis par les micro-organismes diffuse dans une matrice solide polymère située dans le fond du flacon. Le CO2 forme alors de l’acide carbonique H2CO3 qui acidifie le milieu ; une sonde chromophore de pH dans la matrice solide change alors de couleur. C’est aussi le principe du BacT/Alert 3D de bioMérieux, la matrice solide devient plus claire lorsque le pH diminue et la quantité de lumière réfléchie augmente.
Détection en impédance L’impédance est la résistance que subit un courant alternatif pour traverser un milieu conducteur. Elle peut être écrite comme : Z = R + i X. La partie réelle R est la résistance, responsable de l’effet Joule. La partie imaginaire X est la réactance, responsable du déphasage entre la tension et l’intensité.
Au cours du métabolisme bactérien, des nutriments du milieu sont dégradés en molécules plus petites, plus mobiles et avec une charge plus élevée. Par exemple, des protéines sont dégradées en acides aminés et des polymères osidiques en lactates. Au cours de la multiplication bactérienne, cette production d’ions devient suffisante pour provoquer une modification significative de la conductance du milieu. On distingue deux types de mesures d’impédance. La première, est une mesure directe des variations d’impédance du milieu : les électrodes sont plongées dans le milieu de culture même. La deuxième est une mesure indirecte utilisée lorsque les milieux sont très concentrés en sels. C’est le cas par exemple du Rappaport-Vassiliadis (milieu pour l’enrichissement sélectif de Salmonella) qui contient une grande quantité de chlorure de magnésium (MgCl2). Dans ce cas, les électrodes ne sont pas au contact direct du milieu, mais d’une solution de soude. Une partie du CO2 produit par les microorganismes se volatilise dans le volume mort puis se dissout dans la solution de soude. Il se forme alors des ions carbonates, d’où une modification de l’impédance de la solution. [5][6] Quatre systèmes sont disponibles commercialement : Le Bactometer (bioMérieux), le BacTrac (Sy-Lab), le Malthus (Malthus Instruments) et le RABIT (Rapid Automated Bacterial Impedance Technique, Don Whitley Scientific).
Détection cantilever Il est aussi possible de mettre en évidence la présence de micro-organismes grâce à leur masse en utilisant une micro-poutre cantilever dans laquelle passe un canal avec un flux de solution. Une fréquence de résonnance est imposée à la poutre ; lorsqu’un microorganisme passe dans le canal, la masse sur la poutre augmente et provoque une diminution de la fréquence. La résolution est telle, qu’il est possible de détecter un changement de masse de l’ordre du femtogramme (10⁻¹⁸ g). Avec une telle sensibilité, il est possible de détecter le passage d’une cellule unique sur la poutre. Il est aussi possible de réaliser un comptage en connaissant le volume total de solution passant dans le canal. Cependant, ce système connait des limitations, en particulier dans des applications où de gros volumes doivent être traités, puisque le débit dans le canal est de 100 nl/min.
|
Table des matières
INTRODUCTION GENERALE
CHAPITRE 1. PROBLEMATIQUE : LA DETECTION ET L’IDENTIFICATION DE MICRO-ORGANISMES PATHOGENES
1. PROBLEMATIQUE ET CONTEXTE
2. NOTRE APPROCHE : LES COMPOSES ORGANIQUES VOLATILS MICROBIENS (MCOV)
3. DETECTION OPTIQUE DE COV DANS DES XEROGELS
4. LES SUBSTRATS ENZYMATIQUES
5. LES SUBSTRATS ENZYMATIQUES OSMOGENES
6. PRESENTATION DU SUJET DE THESE
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
CHAPITRE 2. DETECTION DE COMPOSES SOUFRES VOLATILS (CSV)
1. PERTINENCE DES CSV POUR LA DETECTION DE MICRO-ORGANISMES
2. METHODES DE DETECTION DES VSC, EN PARTICULIER H2S
3. CHOIX DE LA MOLECULE SONDE
4. ETUDE DE LA REACTION ENTRE LE REACTIF D’ELLMAN ET LES VSC EN MILIEU AQUEUX
5. SYNTHESE ET CARACTERISATIONS DES CAPTEURS DOPES AU DTNB
6. EXPOSITION DES CAPTEURS A DES VSC GENERES CHIMIQUEMENT
7. MISE EN ŒUVRE DANS LA DETECTION DE VSC BACTERIENS
CONCLUSION
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
CHAPITRE 3. DETECTION D’UNE AMINE AROMATIQUE VOLATILE EXOGENE: LA β-NAPHTHYLAMINE
1. LES COV EXOGENES : GENERALITES
2. CHOIX DE L’AMINE VOLATILE EXOGENE : LA NAPHTHYLAMINE
3. DETECTION DE LA Β-NAPHTHYLAMINE EN ABSORBANCE APRES REACTION AVEC UNE MOLECULE SONDE
4. DETECTION DE LA NAPHTHYLAMNINE EN FLUORESCENCE
CONCLUSION
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
CHAPITRE 4. DETECTION DE PHENOLS VOLATILS EXOGENES
1. CHOIX DU COV
2. SYNTHESE ET CARACTERISATION DE XEROGELS POUR LA DETECTION DU 2-NITROPHENOL
3. DETECTION DU 2-NITROPHENOL DANS UNE MATRICE SIMPLE : L’EAU TAMPONNEE
4. DETECTION DU 2-NITROPHENOL DANS DES MATRICES COMPLEXES
5. SUIVI DE LA PRODUCTION DE 2-NITROPHENOL PAR HYDROLYSE DE SUBSTRATS ENZYMATIQUES DANS DES MILIEUX SIMPLES
6. DETECTION EN PHASE GAZEUSE DE 2-NITROPHENOL ISSU D’UNE HYDROLYSE ENZYMATIQUE DANS UN MILIEU COMPLEXE
CONCLUSION
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
CHAPITRE 5. MISE EN FORME DES XEROGELS POUR UNE LECTURE EN REFLEXION
1. LES RETROREFLECTEURS « COINS DE CUBE »
2. LE MOULAGE DES XEROGELS
3. FORMULATION DES GELS : AJUSTEMENT DE L’INDICE DE REFRACTION
4. EXPOSITION DES RETROREFLECTEURS A DU 2-NP GENERE CHIMIQUEMENT
5. SUIVI DE LA CAPTURE DE 2-NITROPHENOL GENERE PAR LA DEGRADATION D’UN SUBSTRAT ENZYMATIQUE
CONCLUSION
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
CONCLUSION GENERALE
ANNEXES
