La densité de répartition des brins d’ADN

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Propriétés de l’auto-assemblage

En général, l’auto-assemblage, déni comme la réalisation de l’ordre spontané dans un syst ème par [Boncheva 05], est un processus complexe du point de vue de la modélisation [Rothemund 00]. Dans le but de comprendre, de caractériser et de quantier ce processus, il est nécessaire d’identier ses propriétés fondamentales : la force de guidage, la stabilité et la spéci- cité.
Force de guidage : C’est une force externe appliquée au système pour augmenter les probabilités de rencontre entre les objets. A l’échelle moléculaire, la force de guidage est généralement due à l’agitation thermique et au mouvement brownien. A l’échelle microscopique, plusieurs approches sont envisageables comme le contrôle du ux uidique, la diélectrophorèse…
Stabilité : Il s’agit de la capacité d’un système d’objets à rester dans un état d’équilibre, en pré- sence de forces extérieures. Cet état correspond naturellement à un minimum d’énergie potentielle. Dans le cas d’un auto-assemblage microscopique, il s’agit du potentiel des forces magnétiques, capillaires ou biologiques, en fonction de la technique utilisée.
Spécicité : La spécicité désigne le caractère sélectif du processus d’auto-assemblage. Il dénit la reconnaissance mutuelle des objets avec un caractère particulier. Dans le cas général, et à l’échelle microscopique, la spécicité est souvent réalisée à partir de la complémentarité géométrique [Zheng 04]. An d’illustrer un processus d’auto-assemblage en particulier, la description d’un exemple biomoléculaire est détaillé ici. Ce type d’auto-assemblage met en jeu des forces avec des valeurs de l’ordre de l’énergie thermique entre un grand nombre de molécules. Ces forces sont principalement dues à des interactions ou des liaisons réversibles non-covalentes. L’assemblage résulte en la formation de complexes, à partir de molécules dont les conformations sont complémentaires.
La gure 1.3 illustre un exemple de structure tridimensionnelle, obtenue par cristallographie, d’un complexe biomoléculaire formé de deux molécules : Cd1d et C6ph de souris. La formation d’un tel complexe nécessite un très grand nombre de molécules an d’augmenter la probabilité de rencontre à partir de l’agitation thermique.

L’auto-assemblage microscopique inorganique

L’auto-assemblage inorganique désigne toute procédure d’auto-assemblage ne faisant intervenir aucun matériel biologique. Dans le tableau 1.1, les méthodes classiques sont classées selon les 3 éléments dénis dans l’analyse : la force de guidage, la stabilité et la spécicité. Cette classication est basée sur l’état de l’art publié par Morris et al. en 2005 [Morris 05]. Ainsi, plusieurs principes peuvent être utilisés pour réaliser chacun des trois éléments dénissant un processus d’auto-assemblage.
Pour la force de guidage, les principes les plus répondus sont les forces gravitationnelles, capillaires, électrostatiques, ou les propriétés hydrophobe/hydrophile des matériaux. D’autres procédés peuvent aussi être utilisés comme les champs de forces électriques ou magnétiques. L’assemblage parallèle n’est pas réalisé dans ces diérentes techniques puisque les composants sont introduits dans le milieu séquentiellement. Les travaux de O’Riordan et al. [O’Riordan 04b] illustrent ce problème. Il s’agit de l’assemblage de composants de l’ordre de 50m de diamètre spéciquement localisés, transportés, et déposés sur un substrat en silicium à partir d’un champ électrique. Les composants sont introduits séquentiellement dans le milieu par type de forme géométrique an de limiter le nombre d’erreurs. Le caractère parallèle de l’auto-assemblage n’est ainsi pas réalisé.
Un second problème concerne la spécicité. En eet, dans les processus d’auto-assemblage 2D les plus aboutis, avec la gravitation ou les forces capillaires comme force de guidage, le principe le plus utilisé est la reconnaissance de formes géométriques [Zheng 04]. Lorsque ce principe est appliqué à un processus 3D, le taux d’assemblage devient beaucoup plus faible et une perte de rentabilité apparait. L’évolution du 2D au 3D multiplie la complexité du processus de reconnaissance entre deux composants par le nombre de leurs faces. La probabilité de rencontre est donc amoindrie. En 2004, Zheng et al. [Zheng 04] réalisent l’auto-assemblage de microcomposants semi-conducteurs de l’ordre de 200m, où les composants sont introduits séquentiellement dans l’environnement liquide d’assemblage. Ils constatent que le taux d’assemblage reste assez faible.
Dans un processus 2D, un taux d’assemblage nettement plus élevé est publié par Stauth et al. en 2006 [Stauth 06] pour des composants du même ordre de dimension. Dans ce processus un assemblage à 97% de FETs (silicon eld-eect transistors) est obtenu sur un substrat en plastique avec un taux de 24 000 composants, de taille caractéristique 100m, par heure. Ces travaux sont illustrés sur la gure 1.4. La force de guidage est réalisée par des forces gravitationnelles, et la stabilité par des forces capillaires. L’apparition de ces forces est réalisée àpartir d’un alliage à bas point de fusion situé sur les sites de liaison du substrat et d’un bloc métallique positionné sur les sites de liaison des composants. Quand la forme d’un microcomposant correspond, avec un contrôle de la température de fusion de l’alliage des sites de liaison, le contact entre ces derniers et le bloc métallique positionné sur la surface du microcomposant est établi.
Après l’achèvement du processus d’A.A, la température est abaissée pour solidier l’alliage et établir les connexions mécaniques et électriques entre le micro-composant et le substrat.

L’auto-assemblage microscopique par processus biologiques

Cet auto-assemblage consiste à utiliser des molécules biologiques capables de former des complexes à partir de deux types de biomolécules (cf. section 2.1 page 8). Elles sont xées à la surface des microcomposants destinés à l’assemblage. Les principes de stabilité et de spécicité biomoléculaires propres à la nature des molécules utilisées sont alors mis en jeu dans un contexte populationnel avec plusieurs milliards de molécules xées en interaction.
Ces processus d’auto-assemblage biomoléculaires sont largement utilisés dans l’auto-assemblage nanoscopique. Par la transformation orientée des complexes biomoléculaires, ces processus engendrent des réalisations comme les moteurs moléculaires et d’autres structures nanomé- triques [Mann 09]. Pour parvenir à ces nouvelles structures, les fonctions premières sont dé- tournées de leur fonctionnement usuel et les conformations spatiales des molécules originelles sont exploitées.
La fabrication, les propriétés et les applications de nanostructures à base d’ADN sont décrites dans un état de l’art par R. Bashir en 2001 [Bashir 01] puis par Young Sun et Ching-Hwa Kiang en 2005 [You 05]. Le principe est de contrôler la conguration 3D de la molécule en jouant sur ses propriétés thermodynamiques et géométriques. Une liste non-exhaustive des applications possibles de l’ADN en nanotechnologies est proposée :
Nano-structure d’ADN pure [Seeman 83, Shih 04, Rothermund 06](gure 1.5), et les travaux les plus récents dans ce domaine sont des structures polyhedrale [Yu He 08].
Assemblage de nano-particules de métal à base d’ADN de Mirkin et al. [Mirkin 96].
Synthèse de semi-conducteurs en utilisant l’ADN de Coer et al. [Coer 92].
Les nanostructures à base de protéines sont naturellement présentes dans la nature. Les premiers prototypes [Hess 04] font l’objet de nombreuses études. Par exemple le moteur protéique 1.7 composé de myosine et de kinésie est un actionneur et transporteur in-vivo. Plus généralement, sur les nano-structures hybrides [Mann 09,Hamdi 09], il apparaît que la coordination, l’organisation et la transformation des nano-objets inorganiques sont des tâches réalisées à partir de biomolécules. Au sein de ces nano-objets hybrides (organiques-inorganiques), des niveaux d’organisation élevés peuvent être atteints. D’autres exemples d’auto-assemblage nanoscopique sont proposés sur les gures 1.5 et 1.6. L’ADN apparaît comme la molécule la plus exploitée dans ce domaine. En eet, les nanostructures articielles à base d’ADN sont plus évoluées que celles basées sur d’autres complexes biomoléculaires [Hess 04]. Ces propriétés potentielles des biomolécules sont ainsi une solution potentielle pertinente pour l’auto-assemblage microscopiques.
L’ensemble de ces processus biomoléculaires exploités dans l’auto-assemblage nanoscopique peuvent être utilisés dans l’auto-assemblage microscopique. En eet, collées à la surface des micro-composants, ces biomolécules pourraient réaliser la spécicité et la stabilité nécessaire à l’auto-assemblage microscopique. Dans la suite de ce document, ces biomolécules sont qualiées de « velcro biologique » puisque de façon similaire à une adhésion velcro, il s’agit d’une population de molécules xées aux surfaces des composants qui adhérents les unes aux autres de façon spécique. Il existe dans la Nature plusieurs processus pouvant servir de colle biologique pour l’auto-assemblage micro et nanoscopique.

L’ADN pour l’auto-assemblage

L’utilisation de l’ADN suppose l’utilisation du processus biomoléculaire d’auto-assemblage propre à cette molécule. Ce processus est appelé hybridation. L’objectif de cette partie est de décrire l’ADN et les propriétés mises en jeu lors des phénomènes d’adhésion. Cette étude n’est pas exhaustive mais elle pose les fondements nécessaires à son application. De plus, quelques exemples d’utilisation sont donnés pour illustrer les possibilités de réalisation.

Structure de l’ADN

L’ADN se présente sous la forme d’un assemblage en double hélice composée de deux chaînes nucléiques complémentaires appelées brins. Les petites unités formant ces chaînes sont des nucléotides, dont la composition est un groupement phosphate lié à un sucre (désoxyribose), lui-même lié à une base azotée qui, pour l’ADN, peut être de quatre types : Adénine (A), Guanine (G), Cytosine (C), et Thymine (T). L’adénine et la guanine sont des purines, tandis que la cytosine et la thymine sont des pyrimidines. Par abus de langage, le terme base est souvent utilisé pour désigner un nucléotide. L’agencement des bases sur une même chaîne est orienté. Celui-ci est eectué à l’aide de l’orientation de leur sucre (gure 1.11). Ainsi, le phosphate relie le carbone 3 du premier sucre au carbone 5 du sucre suivant, qui à son tour associe son carbone 3, à travers un phosphate, au carbone 5 du sucre suivant, et ainsi de suite, de proche en proche. Cette propriété détermine une chaîne de nucléotides orientée de l’extrémité 3′ à l’extrémité 5′.

L’hybridation de l’ADN

Dans son contexte d’origine, l’ADN joue un rôle majeur dans la cellule vivante. Dans les cellules eucaryotes, l’ADN est contenu dans le noyau et une petite partie se trouve dans la matrice des mitochondries ainsi que dans les chloroplastes pour les cellules végétales. Dans les cellules procaryotes, l’ADN est contenu dans le cytoplasme. Certains virus possèdent également de l’ADN dans leur capside.
In-vivo, l’ADN intervient dans plusieurs phénomènes, notamment dans la réplication du matériel génétique de la cellule. Pendant ce processus, la cellule se divise dans le but de régénérer ou spécialiser des tissus. A partir de chaque brin de la molécule, un brin complémentaire est synthétisé, nucléotide par nucléotide. Ainsi, chaque nouvelle molécule est identique à la molécule d’ADN initiale. Un grand nombre d’enzymes interviennent dans le mécanisme moléculaire de la duplication de l’ADN formant le complexe enzymatique de réplication. Cette propriété nécéssite un apport considérable d’énergie pour faciliter la rencontre entre le nucléotide du brin initial et le nouveau nucléotide du brin formé.
Aujourd’hui, il est possible de synthétiser et d’utiliser l’ADN en dehors de son contexte in vivo. Par exemple, l’utilisation de l’ADN dans des conditions expérimentales ( in vitro ) est au c÷ur de la technologie des bio-puces à ADN [Erickson 03]. Cette technique de laboratoire est basée sur le principe de l’hybridation et a pour objectif de savoir si un gène est représenté dans une cellule. Ainsi, en s’inspirant du phénomène de réplication de l’ADN et de manière similaire à la réplication, l’hybridation met en jeu la complémentarité de Watson-Crick pour associer deux brins d’ADN complémentaires. Cependant, pour l’hybridation, il ne s’agit pas de construire des brins complémentaires, mais d’auto-assembler deux brin d’ADN entiers de sé- quences complémentaires. Cette association nécessite un apport d’énergie facilitant la rencontre entre les brins et l’assemblage a seulement lieu si les paires de bases sont complémentaires sur un même plan, en établissant des liaisons hydrogène (H).
Comme tout processus d’auto-assemblage, l’hybridation présente les 3 éléments clés précé- demment dénis : la force de guidage, la spécicité et la stabilité. La force de guidage est réalisée par le mouvement stochastique brownien dû à l’apport d’énergie par agitation thermique. Pour les deux derniers éléments, ils sont dus, d’une part à la reconnaissance moléculaire entre les paires de bases pour la spécicité, et d’autre part, aux liaisons hydrogène pour la stabilité.

La Composition du milieu

Sur chaque brin de la double hélice et pour chacun des nucléotides, le groupement phosphate est dirigé vers l’extérieur de la double hélice [Watson 53]. Chaque brin est donc chargé négativement. Dans un milieu aqueux, ces charges négatives sont équilibrées par la présence de cations monovalents tels que Na+ ou K+. Les bases azotées sont à l’intérieur de l’hélice et constituent la partie hydrophobe de la molécule. La concentration du milieu en cation agit sur la conguration spatiale de la chaîne nucléique [Sae 83]. Ainsi, la composition du milieu aqueux joue un rôle très important sur l’équilibre et la stabilité de la double hélice et donc sur le processus d’hybridation. La concentration ionique peut être considérée comme un paramètre de contrôle.

Paramètres intrinsèques

La composition en bases azotées [Matthias Rief 99], la longueur de séquence et le pourcentage des nucléotides G et C de la molécule d’ADN inuencent le processus d’hybridation. Le pourcentage en nucléotides G et C est un indice paramétrable de la force de liaison entre deuxbrins complémentaires (3 liaisons H). Ce pourcentage peut inuencer la spécicité du processus d’hybridation. Ainsi, si la séquence comporte deux segments complémentaires sur le même brin avec un très haut pourcentage en GC, par exemple, une épingle à cheveux peut être formée (gure 1.13).
La concentration en oligonucléotides inuence aussi la stabilité et la spécicité du processus puisqu’elle détermine la probabilité de rencontre entre deux brins.

Caractérisation des forces d’interaction de l’ADN

Dans le cas de la caractérisation des interactions des acides désoxyribonucléiques, plusieurs techniques existent. La technique de pression osmotique est la première utilisée pour mesurer l’interaction non spécique de condensation de l’ADN (il s’agit des interactions entre doubles hélices) [Rau 84]. Pour les interactions moléculaires plus nes, dans lesquelles l’adhésion et l’orientation interviennent, comme la reconnaissance moléculaire, une mesure directe est nécessaire.
Ainsi, des techniques comme les pinces magnétiques [Smith 92] ou optiques [Perkins 94] sont utilisées pour mesurer les propriétés individuelles d’élongation d’une double hélice de longueur 10 m. D’autre types de propriétés sont explorées comme l’ouverture d’une double hélice par déroulement. En utilisant la technique des micro-aiguilles souples, l’équipe de Roulet et al. [Essevaz-Roulet 97] obtient des forces allant de 10 à 15pN. En 2002, Bockelmann et al. [Bockelmann 02] conrme les résultats obtenus par ses prédécesseurs en utilisant une autre technique, le piégeage optique par interférométrie. Ils apportent un élément nouveau concernant la dépendance de la force d’interaction à la teneur en GC des séquences nucléotidiques. Ainsi, plusieurs études on été menées pour caractériser l’ouverture par déroulement des deux brins et les interactions non spéciques entre double hélices. Les informations issues de ces diff érents travaux sont d’une grande importance puisque la compréhension de la réponse de la molécule d’ADN à une perturbation mécanique externe est facilitée. Toutefois, la séparation des brins par une force appliquée dans le sens de l’axe hypothétique de la double hélice reste un phénomène inexploré. De plus, dans notre cas d’étude, le comportement collectif des brins d’ADN collés sur une surface prend toute son importance. Cet état constitue une diculté suppl émentaire à la caractérisation de la stabilité. En eet, il s’agit d’un système moléculaire de nature stochastique contenant des centaines de milliers de molécules. Par conséquent, la caract érisation des forces d’interaction nécessite l’utilisation d’une plateforme instrumentale dédiée et mesurant les interactions engenrées par une force appliquée dans le sens perpendiculaire au plan des surfaces.
Parmi les instruments de mesure des forces surfaciques existants, le microscope à force atomique (AFM) est l’instrument le plus approprié, en raison de sa sensibilité dans la mesure d’eort, de l’ordre de la centaine de piconewtons. Les conditions environnementales de l’autoassemblage microscopique peuvent être reproduites lors de la séparation de deux objets fonctionnalis és, telles que les forces de Van der Waals, électrostatiques, la traction hydrodynamique, les vitesses d’approche retrait, et l’application d’une force externe. Cet outil est choisi pour l’ensemble des expériences menées dans ce document.

Caractérisation de la stabilité

A l’échelle moléculaire, plusieurs méthodes existent pour l’estimation de l’énergie d’interaction, comme par exemple la modélisation moléculaire ou la modélisation de Monte carlo [Brandsdal 03]. En modélisation moléculaire, l’estimation de l’énergie est basée sur l’équation de Schrö- dinger.
H = E (2.1).
E = Ec + Ep (2.2).
avec H l’opérateur hamiltonien, E l’énergie composée de l’énergie cinétique Ec et potentielle Ep et la fonction d’onde. L’énergie d’interaction V qui caractérise l’interaction entre deux brins d’ADN est une composante de l’énergie potentielle Ep. Cette énergie dépend de la conformation et fondamentalement de la structure très particulière des deux brins en interaction. Une estimation quantique de l’énergie qui prend en compte l’ensemble des électrons de chaque atome constituant chacun des brins est une méthode très couteuse en temps de calcul.
Une évaluation par champs de forces est souvent préférable. L’estimation de l’énergie d’un atome, basée sur la notion de champ de forces, ignore les mouvements d’électrons et calcule l’énergie de l’atome comme une fonction de la position du noyau, en utilisant une méthode d’approximation, comme par exemple la méthode de Born-Oppenheimer [Leach 01].

La densité de répartition des brins d’ADN

Le velcro à base d’ADN est constitué d’un nombre important de brins xés à la surface des micro-composants. Des méthodes pour la détermination de la densité de répartition des brins xés sur les surfaces existent comme par exemple la uorescence [Nom 07]. Ces méthodes nécessitent des équipements spécialisés et doivent faire l’objet d’une étude à part entière. Dans ce travail de thèse il n’a pas été possible de traiter cette question. En eet, nous ne disposions, ni des équipement, ni des connaissances ou du temps nécessaires pour analyser cette problématique en particulier.
En conséquence, même s’il est possible de résoudre le problème de l’élasticité à l’aide du modèle de la chaîne articulée, l’approche individuelle reste complexe et inappropriée à notre cas d’étude.

Table des matières

1 Problématique de l’auto-assemblage microscopique par processus biologiques 
1 Le micro-assemblage dans le projet Golem
2 L’auto-assemblage microscopique
2.1 Propriétés de l’auto-assemblage
2.2 Etat de l’art
2.2.1 L’auto-assemblage microscopique inorganique
2.2.2 L’auto-assemblage microscopique par processus biologiques
2.3 Choix d’un processus biologique
3 L’ADN pour l’auto-assemblage
3.1 Structure de l’ADN
3.2 L’hybridation de l’ADN
3.2.1 La Spécicité
3.2.2 La Stabilité
3.3 Les paramètres de contrôle de l’hybridation
3.3.1 Paramètres extrinsèques
3.3.1.1 La Température
3.3.1.2 La Composition du milieu
3.3.2 Paramètres intrinsèques
4 Problématique de la thése
4.1 Caractérisation des forces d’interaction de l’ADN
4.2 Plan de la thése
2 Etude des paramètres de contrôle de la stabilité 
1 Approche individuelle
1.1 Caractérisation de la stabilité
1.2 Problématique de l’estimation de la force
1.3 Discussion
1.3.1 L’élasticité de l’ADN
1.3.2 La densité de répartition des brins d’ADN
1.4 Conclusion
2 Approche populationnelle
2.1 Quantication de la stabilité
2.2 Modèle du plus proche voisin
2.2.1 Algorithme du modèle du plus proche voisin
2.2.2 Les paramètres intrinsèques
2.2.3 Les paramètres environnementaux
2.3 Estimation de la force d’interaction à partir de G
2.4 Récapitulatif
3 Conclusion
3 Caractérisation expérimentale de la stabilité 
1 L’AFM, les variables et les paramétres de mesure
1.1 Principe général de l’AFM
1.2 L’AFM pour les interactions biomoléculaires
1.3 Les variables de mesure et les paramétres expérimentaux
1.3.1 La force de rupture
1.3.2 Taux de chargement
1.3.3 Conlusion
2 Les protocoles expérimentaux pour la quantication de la stabilité
3 Extraction des données signicatives par analyse statistique
3.1 Méthode statistique pour l’identication des expériences signicatives
3.2 Identication des données exploitables
3.3 Moyennes et distributions des forces de ruptures
3.4 Conclusion
4 Analyse énergétique des données expérimentales
4.1 Variabilité de conguration et force de rupture
4.2 Etude des événements locaux de rupture
4.3 Discussion des résultats expérimentaux
5 Conclusions
4 Etude et caractérisation expérimentale de la spécicité 
1 Etat de l’art des méthodes de génération de séquences
2 Génération de séquence pour l’A.A microscopique
2.1 Principe de la génération de séquence
2.2 Algorithme de génération de séquence
3 Analyse théorique d’une séquence générée
4 Analyse expérimentale
4.1 Description des expériences
4.2 Analyse énergétique des événements de rupture locaux
4.3 Analyse expérimentale de la spécicité
4.3.1 Etude de la spécicité
4.3.2 Inuence de la vitesse sur la spécicité et la stabilité
4.3.3 Inuence du temps d’attente
4.4 Conclusion
5 Conclusions
Conclusion et perspectives
ANNEXE A 
1 Les séquences S1 et S2
2 Les séquences S3 et S4
ANNEXE B 
ANNEXE C 
Liste des symboles
Liste des abréviations
Liste des publications
Bibliographie

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