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La Demande Biologique en Oxygène (DBO5) : un paramètre important
Qu’est-ce que c’est ?
La Demande Biologique en Oxygène (DBO) est un indicateur historique très important et reconnu dans le domaine de la qualité de l’eau. Historiquement, elle a été utilisée pour la première fois en 1908 par la Royal Commission on River Pollution (Angleterre) pour mesurer la pollution organique des rivières [Royal Commission on Sewage Disposal, 1915]. Généralement, quand il s’agit de parler de qualité de l’eau, nous utilisons l’indicateur DBO5, ce suffixe ’5’ signifie : 5 jours. Cette traditionnelle période de 5 jours a été choisie pour ce test car il s’agit du temps nécessaire pour que l’eau de la rivière la plus longue d’Angleterre voyage de sa source jusqu’à l’estuaire. Par la suite, ce paramètre a été adopté par la American Public Health Association Standard Methods Committee (APHA) en 1936, en tant qu’indicateur de référence pour l’évaluation de la biodégradabilité des substances chimiques dangereuses pour l’environnement ou la santé [A.P.H.A. American Public Health Association and Greenberg, Arnold E and Trussell et al., 1986]. La dernière norme proposée à ce jour, concernant les rejets de stations d’épuration, est la norme NF EN 1899-1 adoptée depuis mai 1998 par la France. Cette norme s’inscrit dans une directive européenne (La directive cadre sur l’eau), qui vise à donner une cohérence à l’ensemble de la législation avec une politique communautaire globale dans le domaine de l’eau.
La Demande Biologique en Oxygène correspond à la quantité d’oxygène dissous nécessaire aux microorganismes aérobies de l’eau pour dégrader les Matières Organiques Biodégradables (MOB) dissoutes ou en suspension.
En quoi le paramètre DBO constitue-t-il un indicateur de la biodégradabilité d’une eau polluée ? Si l’eau analysée contient des matières organiques, elles vont être dégradées par voie biologique, ce qui va entraîner un développement de microorganismes aérobies. Cette prolifération provoquera une chute de l’oxygène dissous dans le milieu récepteur et conduira à l’asphyxie de la faune présente. Cette analyse permet donc de connaître l’impact du rejet dans le milieu récepteur. La concentration en oxygène dissous est donc mesurée à la prise de l’échantillon, puis une nouvelle fois 5 jours plus tard. La DBO se calcule par la différence des deux mesures et s’exprime en milligramme d’oxygène par litre. La norme NF EN 1899-1 permet de déterminer la DBO par dilution avec une eau saturée en oxygène afin que ce dernier ne soit pas un facteur limitant. L’échantillon à doser est donc dilué dans une quantité d’eau, telle qu’à l’issue de la mesure le taux d’oxygène résiduel reste supérieur à 50 % du taux initial. Deux mesures parallèles sont donc nécessaires, l’une mesurant l’oxygène dissous de l’échantillon, et l’autre mesurant l’oxygène dissous de l’eau ayant servi à diluer l’échantillon. La DBO réelle est obtenue par soustraction de la différence d’oxygène de l’eau de dilution à celle de l’échantillon .
Méthodes standards et outils pour la mesure de la DBO5
La mesure de la DBO est traditionnellement effectuée selon une méthode normalisée actuellement nommée « essai en fiole fermée », décrite dans les normes internationales ISO 5815-1 : 2003 et ISO 5815-2 : 2003 intitulées « Qualité de l’eau — Détermination de la demande biochimique en oxygène après n jours (DBOn) ». La première partie de la norme concerne la mesure de la DBO par la méthode de dilution (« Partie 1 : Méthode par dilution et ensemencement avec apport d’allylthiourée »), tandis que la seconde concerne la mesure des eaux non diluées (« Partie 2 : Méthode pour échantillons non dilués »). Pour imiter la diversité microbienne présente dans l’environnement, ces tests sont basés sur des échantillons microbiens généralement prélevés dans l’environnement (diversité microbienne inconnue, densité cellulaire ≈ 10⁵ cellules/ml) [OCDE, ].
Le protocole indiqué dans ces normes consiste à mettre les échantillons potentiellement contaminés par des matières organiques dans des bouteilles, à les aérer afin de saturer l’échantillon en oxygène, puis à les ensemencer avec une population bactérienne. Les flacons sont alors fermés hermétiquement et mis en incubation dans une chambre noire à 20°C. L’oxygène dissous est mesuré, pour tous les échantillons, avant et après incubation de n jours pour estimer la DBO. Les normes précisent que la mesure de l’oxygène doit être effectuée soit par la méthode iodométrique (Winkler’s method) (ISO 5813 :1983 Qualité de l’eau – Dosage de l’oxygène dissous – Méthode iodométrique) [James H., 1965] soit par la méthode de la sonde électrochimique (ISO 5814 :2012 Qualité de l’eau – Dosage de l’oxygène dissous – Méthode électrochimique à la sonde).
Une version commercialisée semi-automatique est disponible [WTW, ] . Une sonde électrochimique est insérée dans le flacon, de manière hermétique, pour mesurer la concentration en oxygène dissous dans l’échantillon en temps réel. Cette amélioration technique permet de mesurer la cinétique de dégradation de la matière organique dans les conditions d’analyse imposées par la norme.
Il existe, classiquement, deux méthodes de mesure de l’oxygène dissous. La première, la méthode de Winkler, est une méthode de dosage en retour, par iodométrie, du dioxygène dissous en solution aqueuse. Le principe de cette méthode consiste à fixer l’oxygène dissous en ajoutant du chlorure de manganèse (MnCl2) dans l’eau, il se forme alors un précipité d’hydroxyde de manganèse (Mn(OH)3). Puis par l’ajout du réactif de Winkler (KI KOH), de l’iode est libérée en quantité proportionnelle à celle de l’oxygène dissous. Finalement, on dose l’iode grâce à du thiosulfate de sodium (Na2 S2O3). Cette méthode permet d’obtenir une valeur précise de la concentration en oxygène, mais le nombre d’opérations et de réactifs nécessaires à sa réalisation sont importants.
La seconde, la méthode électrochimique, consiste à utiliser un capteur d’oxygène électrochimique (par exemple : électrode de Clark) pour fournir une grandeur électrique mesurable proportionnelle à la concentration en oxygène dissous. Cette méthode est bien plus simple à mettre en œuvre que la méthode de Winkler, mais elle est souvent plus imprécise.
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Table des matières
Introduction générale
1 Contexte et positionnement de l’étude
1.1 La Demande Biologique en Oxygène (DBO5) : un paramètre important
1.1.1 Qu’est-ce que c’est ?
1.1.2 Méthodes standards et outils pour la mesure de la DBO5
1.2 Les bactéries : un outil pour l’évaluation de la qualité de l’eau
1.2.1 Description des bactéries
1.2.2 Modélisation de la croissance bactérienne
1.2.2.1 Modèle exponentiel
1.2.2.2 Modèle Logistique
1.2.2.3 Modèles avec temps de latence
1.2.3 Les bactéries dédiées à la mesure de la DBO
1.2.4 L’évaluation de la toxicité : bactéries ou algues ?
1.3 Les avancées dans le domaine de la DBO : état de l’art
1.3.1 Les méthodes standards modifiées
1.3.2 Bioluminescence bactérienne
1.3.3 Les piles à combustible microbiennes
1.3.4 Utilisation d’un médiateur redox pour la mesure de la DBO
1.3.5 Biocapteur à base de bactéries immobilisées sur électrode
1.3.6 Biocapteur basé sur des technologies de bioréacteurs ou chemostat
1.3.7 Un regard critique sur les systèmes actuels de DBO
1.4 La microtechnologie au service de l’environnement ; le projet Bioguard au cœur de la problématique
2 Conception du capteur
2.1 Cahier des charges du projet
2.2 Analyse du cahier des charges
2.3 Capteurs pour l’évaluation de la DBO
2.3.1 Un capteur d’oxygène dissous : l’optode
2.3.2 Un capteur réparti : la résazurine
2.4 Systèmes fluidiques « macro » et « micro »
2.4.1 Le système à macro-volume
2.4.1.1 Son architecture
2.4.1.2 Génération du gradient de concentration
2.4.1.3 La conception des réservoirs de mesure
2.4.2 Conception et dimensionnement de la version « micro » : la bio-puce
2.4.2.1 Les contraintes de conception des biopuces
2.4.2.2 Première génération de puce
2.4.2.3 L’amélioration de la puce : deuxième génération
2.5 Instrumentation et système de mesure
2.5.1 Instrumentation des capteurs
2.5.1.1 Lecteur optique de l’optode
2.5.1.2 Lecteur optique de la résazurine
2.5.2 Gestion du système et de l’environnement de mesure
2.6 Conclusion
3 Procédés technologiques et fabrication
3.1 L’automate de mesure en milli-volume
3.1.1 Fabrication et assemblage des réservoirs milli-volumiques
3.1.2 Intégration du capteur
3.1.3 Intégration de l’électronique de commande et contrôle de l’environnement
3.2 Des biopuces en technologie Verre-PDMS
3.2.1 Description des principales étapes de fabrication d’une biopuce
3.2.2 Les masques pour la photolithographie
3.2.3 Structuration de la SU8 par photolithographie
3.2.3.1 Préparation du substrat
3.2.3.2 Dépôt de la résine photosensible
3.2.3.3 Premier recuit (soft-bake)
3.2.3.4 Insolation de la résine
3.2.3.5 Post-exposure bake
3.2.3.6 Développement
3.2.4 Fabrication des dispositifs en PDMS d’épaisseur contrôlée
3.2.5 L’étape d’assemblage des puces
3.2.5.1 Intégration de l’optode et assemblage
3.2.5.2 Cas de la résazurine
3.3 Réalisation d’un banc expérimental pour la mesure de fluorescence de la résorufine
3.3.1 Le système de lecture optique
3.3.2 Sélection et caractérisation des composants
3.3.3 Connexions fluidiques
3.3.4 Électronique et programme de commande
3.4 Les technologies de la biologie : de la culture à l’expérimentation
3.4.1 Les milieux biologiques
3.4.1.1 Le milieu de culture LB
3.4.1.2 Le milieu minimum M9
3.4.2 Estimation de la population bactérienne
3.4.3 Protocole de préparation des bactéries
3.5 Conclusion
4 Résultats expérimentaux et interprétations
Conclusion générale
