La découverte de l’ADN, 50 ans de travaux

LA DÉCOUVERTE DE L’ADN, 50 ANS DE TRAVAUX 

LES PRÉMICES DE LA DÉCOUVERTE

La découverte de ce polymère naturel qu’est l’ADN remonte au milieu du XIXème siècle et est due aux travaux de divers scientifiques dans le monde. Tout a commencé par les travaux du suisse Friedrich Miescher qui réussit à isoler une substance riche en phosphore dans le noyau des cellules qu’il nomma «nucléine». Par la suite, l’allemand Richard Altmann isola en 1889 une substance acide (l’acide nucléique) de la nucléine, découverte préalablement par Miescher. Albrecht Kossel découvrit, en 1896, les quatres bases azotées, l’adénine et la guanine (qui sont des bases puriques) ainsi que la thymine et la guanine (bases pyrimidiques). C’est en 1919 que la nucléine fut identifiée par l’américain Phoebus Levene comme l’association de trois entités : la base (A, T, C, G), un sucre, et un phosphate .

Au début du XXème, les scientifiques pensaient que les protéines détenaient l’information génétique. Le russe Nikolai Koltsov a postulé en 1927 que l’hérédité venait « d’une protéine géante » constituée de « deux brins miroirs l’un de l’autre qui se reproduiraient de manière semi-conservative en utilisant chaque brin comme modèle » . Il fallut attendre 1952, avec les biologistes américains Martha Chase et Alfred Hershey, pour confirmer que c’était l’ADN qui contenait l’information génétique et non les protéines.

La structure de l’ADN fut élucidée un an plus tard, en 1953, par le biologiste américain James Watson et le physicien anglais Francis Crick, ce qui leur valut les prix Nobel de physique et de médecine le 31 octobre 1962.

L’ÉLUCIDATION DE LA STRUCTURE DE L’ADN

Cependant, la détermination de cette structure n’a pu se faire qu’avec les travaux de Rosalind Franklin, qui a effectué une diffraction des rayons X d’un fragment d’ADN cristallisé en 1951, donnant ainsi le célèbre « cliché 51 » . C’est grâce à ce cliché que Watson et Crick ont pu aboutir à la structure de l’ADN telle que nous la connaissons actuellement .

Dans un premier temps, Watson et Crick ont observé la parfaite symétrie Nord/Sud et Est/Ouest du cliché, indiquant que l’ADN devait être une structure symétrique. Le « X » formé au centre de la photo par les taches noires, ainsi que l’espacement régulier qui est caractéristique d’une structure en hélice observée aux rayons X, ont permis de déduire que l’ADN est une structure hélicoïdale. La mesure de l’angle entre chaque résidu (tache) étant de 36° sur le cliché, a permis de déterminer que le pas de l’hélice d’ADN était de 34 Å, soit 10 résidus par tour, donc un résidu tous les 3,4 Å. La disparition du résidu sur la ligne « 4 » (cercle vert sur Figure 5) ne leur a pas échappé, indiquant un possible croisement de deux hélices en ce point. L’esprit de déduction de Watson et Crick les a conduit tout naturellement au fait que la structure de l’ADN devait être une double hélice disposant de deux sillons, un grand et un petit.

L’analyse du cliché 51 n’est pour autant pas finie . En effet, la présence de diamants de part et d’autre du « X » indique qu’il s’agit d’une structure continue à motifs répétés. Ces diamants disposés à l’Ouest et à l’Est du « X » sont légèrement plus sombres sur les extrémités extérieures, indiquant la présence « d’objets » à ces endroits. Les deux scientifiques en ont déduit qu’il s’agissait des groupements phosphodiesters, reliés aux oses. Ces derniers sont placés à l’extérieur de l’hélice permettant ainsi aux bases de se trouver à l’intérieur. Les bases se trouvent ainsi perpendiculaires aux groupements phosphates, contrairement à ce que pensait Pauling et Corey .

Leurs connaissances en chimie leur ont permis d’émettre l’hypothèse que les oses étaient des β-D-désoxyriboses et non des riboses, puisque la présence de l’oxygène sur le carbone C2 de ce dernier empêcherait les liaisons de Van der Waals de se faire. Autrement dit, ils ont déterminé qu’à l’extérieur de l’hélice se trouvait une succession de groupements phosphates et de β-D-désoxyriboses, sur lesquels une base (A, T, C, G) était liée, pointant vers le cœur de l’hélice. Il ne restait alors qu’à élucider le mystère de la seconde hélice et de l’appariement des bases.

Ce problème fut résolu grâce aux travaux effectués par Erwin Chargaff entre 1940 et 1950. Il émit en effet deux principes primordiaux concernant les paires de bases de l’ADN, donnant ainsi les règles de Chargaff. Selon le premier principe, le pourcentage d’adénine et de thymine est le même, tout comme le pourcentage de cytosine et de guanine. Le second pincipe établit que la somme des proportions d’adénine et de guanine est égale à la somme des proportions de cytosine et de thymine. Ces deux principes indiquent que ces bases sont étroitement liées.

Grâce à ces travaux, Watson et Crick en ont déduit une complémentarité entre les différentes bases de l’ADN. Ils ont également émis l’hypothèse que l’équilibre cétoénolique/amino-imino des bases puriques et pyrimidiques devait favoriser la forme cétone/amine plutôt que la forme énol/imine. Ceci impliquait donc qu’une base purique était jointe à une base pyrimidique par liaison hydrogène et qu’il n’y avait qu’une seule option possible : l’adénine avec la thymine, et la guanine avec la cytosine .

Ils en ont ainsi déduit que l’ADN était complémentaire, c’est-à-dire que si l’un des deux brins d’ADN était connu, il était facile d’en déduire l’autre brin de par la complémentarité des bases. Leur conclusion fut donc que les deux hélices de l’ADN étaient antiparallèles l’une de l’autre .

Pour résumer, grâce aux travaux préalables de Rosalind Franklin et Erwin Chargaff, Watson et Crick ont pu déterminer que l’ADN était une macromolécule en double hélice dont les brins sont complémentaires, antiparallèles et reliés entre eux par leurs bases via des liaisons hydrogène (l’adénine liée à la thymine par deux liaisons hydrogène et la guanine liée à la cytosine par trois liaisons hydrogène). Les brins d’ADN sont constitués d’une succession de groupements phosphates et β-D-désoxyriboses portant les bases puriques ou pyrimidiques. Les deux biologistes ont ainsi pu créer le premier modèle d’ADN en utilisant des tiges métalliques .

Depuis l’avancée scientifique de ces deux chercheurs, les biologistes, chimistes et physiciens ont largement étudié l’ADN, et ont pu valider les hypothèses de Watson et Crick. De plus, de nouvelles découvertes ont été effectuées grâce à l’utilisation d’outils de plus en plus élaborés et puissants (comme les spectrophotomètres ou les microscopes électroniques), qui ont permis d’apporter des informations supplémentaires sur la structure de l’ADN.

L’ADN, SA STRUCTURE 

LA STRUCTURE DE BASE DE L’ADN

Comme l’ont montré Watson et Crick, l’ADN est composé de deux brins complémentaires et antiparallèles l’un de l’autre, orientés en 5’-3’ (selon le sens de synthèse de l’ADN) en formant une double hélice. Les brins d’ADN sont constitués d’une suite de groupements phosphates située à l’extérieur de l’hélice reliés au 2’-β-D-désoxyribose. Les bases azotées situées à l’intérieur de l’hélice sont reliées à cet ose. Ces bases s’apparient entre elles deux à deux par liaisons hydrogène entre une base purique et une base pyrimidique : l’adénine avec la thymine via deux liaisons hydrogène et la cytosine avec la guanine via trois liaisons hydrogène. Cet appariement a été qualifié de « canonique » par Watson et Crick .

Il a de plus été démontré que l’appariement entre les bases de l’ADN n’était pas seulement gouverné par les liaisons hydrogène mais également par des interactions de type Van der Waals (« stacking » ou empilement) entre bases adjacentes.

Afin de décrire précisément l’architecture de l’ADN, plusieurs niveaux structurels ont été définis. La structure primaire de l’ADN correspond à sa suite de paires de bases, aussi nommée séquence et sa structure secondaire correspond à l’appariement entre les deux brins de l’ADN formant la double hélice. Cependant ces deux niveaux ne rendent pas compte des différentes conformations spatiales que peut adopter l’ADN.

Table des matières

1. Introduction générale
1.1. La découverte de l’ADN, 50 ans de travaux
1.1.1. Les prémices de la découverte
1.1.2. L’élucidation de la structure de l’ADN
1.2. L’ADN, sa structure
1.2.1. La structure de base de l’ADN
1.2.2. La structure tridimensionnelle de l’ADN
1.2.3. Les sillons de l’ADN
1.2.4. Les structures non canoniques de l’ADN
1.2.5. Le niveau de condensation maximal de l’ADN : Le chromosome
1.3. L’ADN centre de commande de la cellule, son rôle et ses protéines
1.3.1. La régulation de l’ADN
1.3.2. La réplication de l’ADN
1.3.3. La transcription de l’ADN
1.3.4. La préservation de l’ADN
1.4. Les structures complexes de l’ADN
1.4.1. Les G-quadruplex
1.4.1.1. Leurs structures
1.4.1.2. Leurs fonctions
1.4.1.2.1. Les télomères
1.4.1.2.2. La réplication
1.4.1.2.3. La transcription
1.4.2. Les zones riches en adénine et thymine de l’ADN
1.4.2.1. Une structure favorisant les interactions
1.4.2.2. Une séquence cosmopolite et multitâche
1.4.2.2.1. L’initiation de la transcription, la boîte TATA et ses protéines
1.4.2.2.1.1. DNA unwinding elements
1.4.2.2.2. Les séquences longues en adénine et thymine
1.4.2.2.2.1. Les sites fragiles
1.4.2.2.3. La grande diversité de protéines régulant les zones riches en AT
1.4.2.2.3.1. Les HMGs
1.4.2.2.3.2. Les protéines STABs
1.5. Les ligands de l’ADN
1.5.1. Les différents modes de liaison
1.5.1.1. Interactions électrostatiques
1.5.1.2. Intercalations entre les paires de bases
1.5.1.3. Interactions avec les sillons de l’ADN
1.5.1.4. Intercalants à liaison métallique
1.5.2. Les ligands
1.5.2.1. Le Grand sillon de l’ADN
1.5.2.1.1. Aflatoxine
1.5.2.1.2. Azinomycines
1.5.2.1.3. Neocarzinostatine
1.5.2.2. Les Intercalants
1.5.2.2.1. Doxorubicine
1.5.2.2.2. Camptothécine
1.5.2.2.3. Bromure d’éthidium
1.5.2.3. Le Petit sillon de l’ADN
1.5.2.3.1. Duocarmycine et ses dérivés
1.5.2.3.2. Diarylamidines
1.5.2.3.3. La famille Hoechst, bis-benzimidazole
1.5.2.3.4. Les triphénylamines
1.6. Conclusion
1.7. Vers une nouvelle sonde polyfonctionnelle
1.8. Conception de la sonde
2. Synthèse de la sonde polyfonctionnelle
2.1. Le piège à protéine
2.1.1. L’epicocconone, une azaphilone profluorescente piégeant les protéines
2.1.2. Synthèse du piège à protéines, l’analogue naphtyle de l’épicocconone
2.1.2.1. Synthèse de l’alcool désaromatisé
2.1.2.2. Synthèse de la β-céto-dioxinone, précurseur d’acyl-cétène
2.1.2.3. Réaction d’acylfuranonisation
2.2. Le ligand de l’ADN
2.2.1. Les TP-Ox-PY, une famille de ligands des zones riches en AT particulière
2.2.2. Synthèse du ligand de l’ADN, un analogue du TP-Ox2Py
2.2.2.1. Première voie de synthèse
2.2.2.1.1. Synthèses linéaires
2.2.2.1.1.1. Première approche de synthèse linéaire
2.2.2.1.1.2. Seconde approche de synthèse linéaire
2.2.2.1.1.3. Troisième approche de synthèse linéaire
2.2.2.1.2. Synthèse convergente
2.2.2.1.2.1. Synthèse des premiers fragments triphénylamine 66a et 66b
2.2.2.1.2.2. Synthèse des précurseurs oxazole-pyridine 65a et 65b
2.2.2.2. Seconde voie de synthèse, la C-H activation « on water »
2.2.2.2.1. La C-H activation, un accès rapide à des structures complexes
2.2.2.2.1.1. Les débuts de la C-H activation
2.2.2.2.1.2. Amélioration des conditions de C-H activation, utilisation de l’eau et l’effet « on water »
2.2.2.2.2. Arylation directe de différents hétérocycles azotés par C-H activation « on water »
2.2.2.2.2.1. Les thiazoles
2.2.2.2.2.2. Les oxazoles
2.2.2.2.3. L’importance de l’argent dans les couplages Pd/Ag
2.2.2.2.3.1. Le rôle de l’argent dans les couplages Pd/Ag
2.2.2.2.3.2. L’argent, médiateur de C-H activation
2.2.2.2.4. Obtention de la partie ligand de l’ADN par C-H activation « on water ».
2.2.2.3. Synthèse de nouveaux ligands de l’ADN
2.2.2.3.1. Synthèse des hétérocycles
2.2.2.3.1.1. Série Ox-5Py
2.2.2.3.1.2. Série Ox-2Py
2.2.2.3.1.3. Série Thia-2Py
2.2.2.3.2. Étape de C-H activation
2.2.2.3.3. Quaternarisation des noyaux pyridines
2.2.2.3.3.1. Série TP-2Ox-5Py
2.2.2.3.3.2. Série TP-2Thia-2Py
2.3. Synthèse de la sonde
2.3.1. Réaction de CuAAC : Travaux antérieurs au sein du laboratoire
2.3.2. Stratégie CuAAC, premier couplage
2.3.3. Nouvelle stratégie innovante : utilisation de la SPAAC
2.3.3.1. Travaux préliminaires de la SPAAC
2.3.3.2. Synthèse du linker de la sonde : La chimie du cyclo-octyne
2.3.3.2.1. Introduction de la fonction amine par couplage de Sonogashira
2.3.3.2.1.1. Couplage de Sonogashira sur le dérivé di-cationique
2.3.3.2.1.2. Couplage de Sonogashira sur le composé 67
2.3.3.2.2. Formation du di-cation pyridinium, et libération de l’amine nécessaire au couplage peptidique
2.3.3.2.3. Introduction du linker cyclo-octyne sur le ligand de l’ADN par couplage peptidique
2.3.3.2.3.1. Preuve de concept
2.3.3.2.3.2. Synthèse de la sonde
2.4. Conclusion
3. Évaluation des ligands synthétisés
3.1. Introduction
3.1.1. La titration fluorimétrique
3.1.2. Le FRET-Melting
3.1.3. Le FID : Fluorescent Intercalator Displacement
3.1.4. Le dichroïsme circulaire
3.1.5. Les séquences ADN d’intérêt pour cette étude
3.1.6. Imagerie cellulaire
3.2. Évaluation biologique des ligands synthétisés
3.2.1. Évaluation de la sonde 146
3.2.1.1. Expérience de FID
3.2.1.1.1. Séquence riche en G quadruplex
3.2.1.1.2. Séquence DS-26
3.2.1.2. Expérience de FRET-Melting
3.2.2. Évaluation des nouveaux ligands synthétisés
3.2.2.1. Propriété spectroscopique des ligands synthétisés
3.2.2.2. Titration fluorimétrique
3.2.2.3. Imagerie cellulaire
3.2.2.3.1.1. Les sondes TP-2Ox-5Py
3.2.2.3.1.1.1. La sonde 121
3.2.2.3.1.1.2. La sonde 120
3.2.2.3.1.2. Les sondes TP-2Thi-2Py
3.2.2.3.1.2.1. La sonde 122
3.2.2.3.1.2.2. La sonde 123
3.3. Conclusion
4. Conclusions

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