La décongélation des embryons

 La décongélation des embryons

Etude des facteurs de variation liés à l’embryon.

La réussite d’un transfert est mesurée le plus souvent par le taux de gestation des receveuses. Ce taux est le plus souvent calculé à partir d’un diagnostic de gestation obtenu par palpation transrectale ou par échographie entre 30 et 40 jours après le transfert. On considèrera qu’un transfert est réussi si le diagnostic de gestation est positif à ce stade, sans tenir compte d’un éventuel avortement tardif de la receveuse. Nous avons vu que les embryons pouvaient être soit transférés en frais, soit congelés et conservés pour un transfert ultérieur. Ces opérations permettant la conservation de l’embryon sont à l’origine de défauts de développement de l’embryon après décongélation. Bracke et Niemann (1995) ont ainsi observé une différence significative entre le nombre de cellules de blastocystes frais et de blastocystes congelés et décongelés. On constate également une dégradation des taux de gestation après transfert d’embryons frais ou transfert d’embryons congelés : un transfert en frais donne en général un taux de gestation de l’ordre de 70 à 80%, alors que des embryons congelés ne permettent pas de dépasser un taux de 60 à 70%. Spell et al (2001) ont ainsi obtenu un taux de gestation de 82,9% pour des embryons frais contre 69% pour des embryons congelés dans du glycérol (p=0,01). De la même façon, il est important de noter que les différentes techniques de congélation n’auront pas les mêmes résultats et qu’elles pourront conduire à des différences importantes dans le taux de gestation mesuré après transfert. On ne pourra donc juger de l’influence d’autres facteurs intrinsèques à l’embryon que pour un mode de transfert et de congélation donné. Ceci fera l’objet d’une première partie de l’étude bibliographique : nous présenterons l’influence de la qualité et du stade de l’embryon sur la réussite d’un transfert en frais.
Nous verrons dans une seconde partie comment les différentes techniques de conservation influencent la réussite d’un transfert d’embryons.

Facteurs liés aux caractéristiques de l’embryon.
Après la collecte, l’embryon est observé au microscope avant d’être mis en paillette pour un transfert immédiat ou pour être congelé. C’est au cours de cette phase qu’une évaluation est possible. Les seuls critères dont on dispose sur le terrain sont des critères morphologiques qui permettent d’évaluer son stade de développement et sa qualité, c’est-à-dire la disposition et l’aspect des cellules qui le composent. Après avoir présenté les critères permettant de les évaluer, nous présenterons leur influence sur le taux de gestation.

 Stade embryonnaire

a) Identification du stade
La morphologie générale des embryons bovins est la suivante : diamètre compris entre 150 et 190 µm dont une zone pellucide de 12 à 15 µm. Ce diamètre reste constant du stade zygote au stade du blastocyste épanoui. On donne l’âge de l’embryons en fonction du nombre de cellules qui le composent jusqu’au stade 16 cellules. Ensuite, le comptage des cellules devient plus difficile et d’autres critères morphologiques sont nécessaires. On distingue les stades suivants (l’âge est donné en prenant pour repère l’œstrus comme jour zéro) :
– Le stade morula (5 jours) où les blastomères sont difficilement identifiables. La masse des cellules occupe tout l’espace périvitellin. – Le stade morula compacte (6 jours) où des blastomères ont fusionné, formant une masse compacte. L’embryon n’occupe plus que 60 à 70% de l’espace périvitellin. – Le stade jeune blastocyste (7 jours) où une cavité commence à se former. Il est possible de voir une différence entre les cellules de la masse cellulaire interne et les cellules trophoblastiques (à l’extérieur).
– Le stade blastocyste (7 jours) avec une nette différence entre les cellule du trophoblaste et les cellules de la masse cellulaire interne, plus sombres. L’embryon occupe la presque totalité de l’espace périvitellin. – Le stade blastocyste épanoui (8 jours) où le diamètre total de l’embryon augmente beaucoup (de 20 à 50 %) avec un amincissement de la zone pellucide jusqu’à un tiers de son épaisseur initiale. Les embryons récoltés à ce stade sont en général aplatis à cause d’une disparition du blastocœle. – Le stade blastocyste éclos (9 jours) : l’embryon quitte ou a quitté sa zone pellucide. Il peut être plus difficile à reconnaître lors d’une collecte. Une récolte à un jour donné ne contient pas toujours que des embryons du même stade, il existe une certaine variabilité : six jours après les chaleurs, ce sont surtout des embryons au stade morula qui sont récoltés, mais il peut arriver que des blastocystes soient également récoltés à ce stade (Saha et al., 1983). L’aspect des pricipaux stades d’embryons transférables est présenté en annexe 3 (Le Guienne et al., 1990).

Influence du stade de développement sur la réussite du transfert.

En ce qui concerne les transferts en frais, Lindner et al. (1983) n’observent pas d’influence significative du stade de développement de l’embryon sur la réussite du transfert. Pour les embryons congelés, Niemann et al. (1985) ont observé l’évolution de la morphologie d’embryons au stade morula ou blastocyste après dépôt dans une solution de glycérol 1,4M et équilibration une quinzaine de minutes. Après une forte diminution du volume des cellules, l’aspect redevenait similaire à celui que les embryons avaient avant l’immersion dans le glycérol. Cependant, les morulas ont montré plus de modifications à l’échelle cellulaire (zone pellucide endommagée, blastomères éparpillés) que les blastocystes, et le taux de gestation obtenus après congélation et décongélation était plus faible pour les morulas (46,2%) que pour les blastocytes (54,2%). Bracke et Niemann (1995) ont observé que la survie in vitro après décongélation dans un bain à 30°C était meilleure pour les blastocytes que pour les morulas (84,5% contre 49,5%, p<0,01). Par contre, le taux de gestation après transfert était comparable pour les deux stades d’embryons. Hasler (2001) n’a pas non plus trouvé de différence significative entre les taux de gestation obtenus après transferts d’embryons de différents stades, dans une étude réalisée aux Etats-Unis et portant sur plus de 14000 embryons transférés. Par contre, dans une autre étude qu’il a réalisée aux Pays-Bas, il a mis en évidence que les jeunes blastocytes donnaient un taux de gestation supérieur (p<0,05) à celui obtenu avec des morulas ou des blastocytes plus tardifs (59,7% contre 54,3 et 52,1%). Ces résultats ont été obtenus pour un même mode de congélation et décongélation utilisant du glycérol comme cryoprotecteur. Il semble donc que pour ce mode de conservation, le stade à privilégier est le stade du jeune blastocyste, même si toutes les études n’en apportent pas la preuve formelle.

Table des matières

Liste des Tableaux
Liste des Figures
Abréviations
Introduction
PREMIERE PARTIE : ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
I) Etude des facteurs de variation liés à l’embryon
A. Facteurs liés aux caractéristiques de l’embryon
1. Stade embryonnaire
a) Identification du stade
b) Influence du stade de développement sur la réussite du transfert
2. Qualité des embryons
a) Evaluation de la qualité des embryons
b) Influence de la qualité sur la réussite du transfert
B. Facteurs liés au mode de conservation de l’embryon
1. Le cryoprotecteur
a) Utilisation du glycérol
b) Utilisation du DMSO
c) L’éthylène glycol
i. Choix du glycol
ii. Concentration optimale en glycol
2. Le mode de congélation
a) Le refroidissement progressif
b) La vitrification d’embryons bovins
i. Choix des composants de la solution de vitrification
ii. Temps d’équilibration
3. Le mode de décongélation
II) Etude des facteurs de variation liés à la receveuse
B. La sélection des animaux
1. La race
2. Les antécédents des animaux
3. La parité
4. L’état général des animaux
5. L’examen de l’appareil génital
6. Aspect sanitaire
C. Le regroupement des animaux et leur préparation
1. La nutrition
a) L’apport énergétique
i. avant le transfert
ii. au moment du transfert
iii. en fin de gestation
b) L’apport azoté
c) L’apport de minéraux
d) Les apports en eau
e) La régularité des apports
2. L’environnement
3. Les critères de santé
4. Le mode de synchronisation des chaleurs
a) Différentes techniques
i. Une double injection de prostaglandines
ii. Utilisation des progestagènes
b) Influence du mode de synchronisation sur la réussite du transfert
c) Facteurs de réussite des traitements de synchronisation
d) Amélioration des résultats
i. Par des traitements complémentaires
ii. En améliorant la détection des chaleurs
D. Facteurs liés à l’évaluation des receveuses au moment du transfert
1. L’échographie
2. Le dosage de la progestérone
3. La synchronisation entre l’embryon et la receveuse
4. Traitement de la receveuse après transfert
a) Utilisation du GnRH
b) utilisation de l’hCG
DEUXIEME PARTIE : ETUDE EXPRIMENTALE RETROSPECTIVE
I) Matériel et Méthodes
A. Présentation de Charolais Embryons
B. Population d’étude
C. Protocole d’étude
1. Préparation des paillettes contenant les embryons
a) Matériel nécessaire
b) Méthode
i. Préparation pour transfert en frais
ii. congélation dans de l’éthylène glycol
iii. congélation dans du glycérol
2. La décongélation des embryons
a) Cas des embryons congelés dans du glycérol
i. matériel nécessaire
ii. technique de décongélation et de montage des paillettes de transfert
a) Cas des embryons congelés dans de l’éthylène glycol
3. La préparation des receveuses
4. Réalisation du transfert
B. Données recueillies
1. Par l’intermédiaire de l’éleveur
2. Lors du transfert
3. Après le transfert
C. Présentation des variables
1. Les variables concernant l’embryon
2. Les variables concernant la receveuse
3. Analyse statistique
a) analyse univariée
b) analyse multivariée
II) Résultats
A. Analyse univariée
1. Influence de l’embryon sur la réussite du transfert
a) Influence de la qualité de l’embryon
b) Influence du stade de l’embryon
c) Influence du mode de conservation de l’embryon
2. Influence de la receveuse sur la réussite du transfert
a) Age de la receveuse
b) Parité de la receveuse
c) Mode de synchronisation des chaleurs
d) Qualité du corps jaune
e) Mois de transfert
f) Etat d’engraissement
g) Rang de transfert
B. Analyse multivariée
III) Discussion.
A. Méthodologie
B. Résultats
1. Taux de gestation moyen
2. Facteurs de variation du taux de gestation
a) La qualité de l’embryon
b) Le mode de conservation de l’embryon
c) L’âge et la parité de la receveuse
3. Variables sans influence mise en évidence sur la réussite du transfert
a) Variables concernant l’embryon
b) Variables concernant la receveuse
Conclusion
Bibliographie
Annexes

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