La connaissance du risque microbiologique

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LE LABORATOIRE PROPREMENT DIT :

Le laboratoire doit disposer d’un espace lui permettant d’assumer la charge de travail précise sans compromettre la qualité, la sécurité du personnel et les soins prodigués aux patients. Il doit occuper une position centrale par rapport aux autres locaux annexes (salle de prélèvement, pièces de servitudes, secrétariat…) ; être suffisamment spacieux, tenant compte des appareils et de la nature du travail qui y sera envisagée
Le laboratoire doit être conçu de manière à assurer l’efficacité de son fonctionnement, à optimiser le confort de ses occupants à minimiser le risque de blessures et de maladies professionnelles.
Les murs, les plafonds et les sols doivent être lisses, faciles à nettoyer, imperméables aux liquides et résistants aux produits chimiques et aux désinfectants, le revêtement du sol doit être anti dérapant.
Les portes doivent être munies de panneaux transparents, avoir une résistance au feu et comporter un système de fermeture automatique, et des panneaux de mise en garde appropriés.
Les tables de travail ou paillasses sont caractérisées par :
– leur dimension [2] : les paillasses doivent être vastes, facilitant l’installation du matériel, le rangement des produits à examiner, sans gêner la manipulation. Profondeur 75 cm, largeur 130 cm par poste, hauteur 75 à 80 cm, pour permettre le travail en position assise. Les distances séparant les rangées de paillasses ne doivent pas être inférieures à 160 cm.
– la nature du revêtement des paillasses : le revêtement doit être imperméable à l’eau, incombustible, imputrescible, résistants aux désinfectants couramment utilisés, aux acides, aux bases, aux solvants organiques ; parfaitement plan.
– l’implantation : l’orientation des paillasses face à la lumière du jour est souhaitable, sauf pour les tables de microscopies disposées en sens inverse. Eviter à cause du courant d’air, l’installation des tables de manipulations sur les axes portes, fenêtres car le courant d’air, en balayant le plan de travail, peut être à l’origine de la formation d’aérosols infectieux.
– L’équipement des paillasses : le matériel servant à la manipulation doit se trouver en permanence sur la table
L’alimentation électrique doit être fiable et de puissance suffisante. Les paillasses doivent être pourvues de plusieurs prises de courant électrique à des intervalles de 1.5 à 2 m, toutes les prises doivent être mises à la masse.
L’éclairage doit être suffisant pour tous les types de travail, on évitera les reflets gênants et les lumières éblouissantes. Il faudrait disposer d’un groupe électrogène de secours.
L’alimentation en eau doit être fiable et de bonne qualité. Les paillasses doivent être pourvues d’une alimentation et d’une évacuation d’eau. Il ne doit y avoir aucune interconnexion entre le branchement destiné au travail du laboratoire et le réseau d’eau potable. Le réseau public d’adduction doit être protégé par un dispositif anti retour.
L’alimentation de gaz doit être fiable et suffisante, il est impératif d’assurer l’entretien de cette installation.
Les systèmes de sécurité doivent couvrir les risques d’incendies, les accidents d’origine électrique et comporter une douche de sécurité ainsi qu’une rince yeux.

LES ANNEXES DU LABORATOIRE :

Les annexes du laboratoire sont représentés par :
– les services administratifs : direction, secrétariat, salle de réunion, salle d’archive, réfectoire
– les pièces de servitudes :
+ La salle d’accueil et d’attente
+ La salle de prélèvement : des aménagements doivent êtres prévus pour le confort du patient et son intimité lors du prélèvement.
+ La chambre froide
+La chambre noire
+ Une petite pièce réservée aux matériels bruyants (centrifugeuses, broyeurs…)
+ Vestiaires pour les vêtements de ville en dehors des zones de travail
+ La salle de préparation souvent jumelée à la laverie, est l’annexe la plus importante du laboratoire de microbiologie. Les services de laveries et de préparation sont chargés de la stérilisation du matériel après usage et de la préparation des milieux de cultures. De la qualité du travail qui y est exécutée dépend la sécurité du personnel et l’interprétation des résultats. Le service de préparation doit être proche du laboratoire et doit avoir un accès facile aux armoires de stockages et aux chambres froides. Les aides de laboratoire doivent être conscients de l’importance des tâches qui leur sont confiées, il est indispensable de les faire participer dans la mesure du possible à la vie du laboratoire.

LES EQUIPEMENTS ET LE MATERIEL DE LABORATOIRE

Dans ce chapitre nous abordons l’impact des équipements de laboratoire dans la biosécurité, sachant d’une part que le matériel couramment utilisé au laboratoire (pipettes, tubes à essai, éprouvettes, thermomètres, fioles coniques, ballons, flacons de toutes sortes…) peut entraîner des accidents très graves par coupure ou par sectionnement, pouvant occasionner l’inoculation de microorganisme; d’autre part certains équipements tels que les enceintes de sécurité microbiologiques peuvent contribuer à la sécurité du biologiste, de l’environnement, et le cas échéant, du produit manipulé.

LE MATERIEL DE LABORATOIRE :

L’emploi de certains instruments et appareils comporte un risque microbiologique qui peut être amoindri par une bonne connaissance théorique et une technique satisfaisante.

LA QUALITE DU MATERIEL

La verrerie : elle doit être de bonne qualité, solide, résistante aux variations de température, non teintée, sans stries ni bulles
Les aiguilles : la pointe doit permettre une pénétration de l’aiguille immédiate et indolore. Sa force et son acuité doivent être constantes, le canon doit permettre une traversée tissulaire facile.
Les seringues : le corps ou cylindre doit être résistant aux chocs et aux différences de températures, parfaitement transparent.

LES CONDITIONS D’UTILISATION DU MATERIEL DE LABORATOIRE

Le matériel ne doit être utilisé que par des personnes autorisées. Des manuels pour l’utilisation et la maintenance doivent être disponibles. Le matériel défectueux doit être mis hors service jusqu’à ce qu’il ait été réparé et que son étalonnage et sa vérification permettent de prouver qu’il remplit les critères d’acceptation spécifiés.

LES EQUIPEMENTS DE SECURITE

LES ENCEINTES DE SECURITE MICROBIOLOGIQUE

Les Enceintes de Sécurité Microbiologique (ESM) ou postes de sécurité microbiologique sont des chambres de manipulation utilisées pour assurer la sécurité du manipulateur et de l’environnement lors de manipulations susceptibles de générer des aérosols infectieux.
En effet les aérosols se produisent lors de toute manipulation qui communique de l’énergie à un produit liquide ou semi liquide (secouer du liquide contenu dans un tube, ensemencer en stries une plaque de gélose, inoculer des flacons pour culture cellulaire, homogénéiser ou centrifuger un liquide…)
Ces aérosols de diamètre compris entre 5 à 100 µm sont invisibles à l’œil nu et peuvent être responsables à l’insu de l’opérateur d’un risque d’inhalation ou provoquer la contamination croisée du plan de travail. [1]
En pratique, une ESM doit être choisie en fonction de la protection nécessaire: protection du « produit » et/ou protection du personnel contre les micro-organismes de la classe de risque 1 à 4.
La protection du personnel contre les composés toxiques volatils et les radionucléides ou une combinaison des deux doit aussi être envisagée.
Dans tous les cas de figure la protection de l’environnement sera assurée.
Le tableau I présente le type d’ESM recommandé pour chaque usage.

LES TECHNIQUES MICROBIOLOGIQUES

LES TECHNIQUES DE BASE

Une mauvaise technique, un mauvais emploi des équipements et appareils sont à l’origine de la plupart des accidents que l’on rencontre dans les laboratoires microbiologiques. Il est nécessaire d’acquérir une gestuelle bien maîtrisée, pour éviter la création d’aérosols autant que possible en manipulant au calme et le cas échéant en milieu confiné. L’observation stricte des bonnes techniques microbiologiques permettra de réduire le risque infectieux

REGLES POUR LA GESTION DES PRELEVEMENTS

Le but des analyses est d’aider au diagnostic, au traitement et à la prévention des maladies infectieuses. Les conditions dans lesquelles ces analyses sont réalisées sont définies par « le guide de bonne exécution des analyses » publié au journal officiel français.
– La phase pré analytique de l’examen comprend la prescription, le prélèvement, la collecte de renseignement qui doivent accompagner le prélèvement et les conditions dans lesquelles il est conservé et acheminé jusqu’au laboratoire.
– La phase analytique consiste à réaliser l’analyse selon les procédures préalablement définies
– La phase post analytique comporte l’expression, l’interprétation et la transmission des résultats.
La traçabilité doit être respectée à toutes les étapes de façon à pouvoir retrouver à posteriori les conditions dans lesquelles chaque acte a été effectué. L’ensemble de ces actes réalisés lors des différentes phases doit faire l’objet de procédures écrites et de contrôle de qualité.
™ La prescription doit être rédigée selon la terminologie de la nomenclature des actes de biologie médicale. Cette formulation est rarement suffisante et doit être accompagnée de divers renseignements permettant d’identifier le contexte clinique.
™ Les renseignements concernant le prescripteur doivent comporter le nom et la qualité du prescripteur ainsi que ses coordonnées (adresse, téléphone, fax, email…).
™ Les renseignements concernant le patient : nom, prénom ; sexe, date de naissance, adresse ou service d’hospitalisation, numéro du lit.
™ Les renseignements concernant la prescription :
– le but de l’examen qui est souvent implicitement contenu dans la prescription
– la demande de recherche de micro-organismes particuliers
– certains renseignements : diagnostic, antécédents, facteurs de risque
– degré d’urgence du résultat : pour orienter le choix technologique
™ Le prélèvement : c’est le biologiste qui assure la responsabilité du prélèvement et de son transport. La qualité du prélèvement influence beaucoup la pertinence des résultats de l’examen, il est donc important qu’il soit effectué correctement.
™ Le préleveur est le biologiste lui-même ou une personne habilitée (technicien, infirmier) qui opère sous sa responsabilité. Il doit respecter les règles d’hygiène pour éviter d’infecter le patient, de contaminer le prélèvement avec des germes exogènes ou de se contaminer lui-même.

LE REJET DES PRELEVEMENTS INAPPROPRIES

Les causes les plus fréquentes de rejet de prélèvement par le laboratoire sont les suivantes :
– échantillon dont l’étiquetage ne permet pas l’identification du malade
– échantillon visiblement contaminé ou reçu dans des récipients endommagés
– échantillon reçu trop longtemps après le prélèvement et mal conservé
– échantillon inapproprié aux analyses prescrites.
Dans certains cas le biologiste pourra s’efforcer de compléter les informations manquantes et de rendre acceptable le prélèvement, mais il devra se garder de trop de connaissances en acceptant de travailler sur des échantillons de mauvaises qualités et de prendre le risque de rendre un résultat qui nuirait le patient.

CONSERVATION ET TRANSPORT DES ECHANTILLONS

L’échantillon prélevé doit être transmis au laboratoire dans un récipient adéquat à usage unique, stérile et étanche. L’étiquetage doit comporter le nom, le prénom, la date de naissance du patient, la nature et le site du prélèvement, la date et l’heure du prélèvement.
Les bactéries pathogènes sont souvent peu résistantes lorsqu’elles sont hors du tissu infecté. Elles sont souvent sensibles au froid, à la dessiccation, à l’oxygène (anaérobie). La croissance des bactéries contaminantes est généralement 10 à 100 fois plus rapide dans les échantillons que la croissance des bactéries pathogènes. C’est pourquoi l’échantillon prélevé doit être acheminé au laboratoire dans les 30 minutes qui suivent le prélèvement ou être acheminé dans un milieu de transport.
La conservation pendant un temps limité à quelques heures est possible pour certains prélèvements : urine, selle. Elle est contre indiquée si le prélèvement est susceptible de contenir des espèces sensibles au froid (liquide céphalorachidien, prélèvement pulmonaire…)
Tous les prélèvements doivent être considérés comme potentiellement infectieux. Il faut donc les manipuler en évitant les fuites (récipients étanches), la contamination de parois extérieures et la projection notamment à l’ouverture des flacons. On les manipule avec des gants, lunettes et masques. Des procédures de désinfection et de traitement des personnes victimes d’un accident contaminant doivent être prévues.
Si le prélèvement, le transport et la réception des échantillons ne sont pas effectués correctement il existe un risque d’infection pour le personnel.
Les conteneurs à échantillon peuvent être en verre ou de préférence en matière plastique. Ils doivent être solides, l’extérieur du conteneur doit être propre. Les conteneurs doivent être correctement étiquetés pour faciliter l’identification. Les conteneurs sont placés dans des enveloppes séparées résistant à l’eau. Pour éviter qu’il ait des fuites ou du matériel répandu accidentellement on utilise les conteneurs secondaires qui peuvent être en métal ou en matière plastique mais doivent être autoclavables, résistants au désinfectant chimique. Ils seront régulièrement décontaminés.

REGLES POUR LA MANIPULATION DES ECHANTILLONS

Les laboratoires qui reçoivent un grand nombre d’échantillons devront réserver une pièce ou une zone particulière à cet effet. Le personnel qui reçoit et défait l’emballage doit connaître le risque qu’il court, il doit respecter les précautions d’usage et avoir à sa disposition un désinfectant approprié.
En séchant les échantillons d’expectoration on s’efforcera d’éviter la formation d’aérosols.
Les échantillons et les cultures destinés à être autoclavés ou éliminés seront placés dans des conteneurs étanches ; par exemple sacs de poubelle de laboratoire, il faut fermer l’extrémité avec du ruban adhésif autoclavable avant l’élimination.
Les tubes à échantillon contenant des caillots de sang où autre destinés à être éliminés seront rebouchés avec leur capuchon et placés dans un récipient étanche approprié dans lequel ils seront autoclavés et incinérés.

REGLES D’UTILISATION DES PIPETTES ET DES DISPOSITIFS DE PIPETTAGE

Pour le remplissage, la pipette doit plonger suffisamment dans le récipient pour éviter les bulles d’air. Il ne faut jamais souffler dans les pipettes. Les pipettes pour les quelles la lecture est faite immédiatement peuvent être retirées aussitôt après leur utilisation.
On utilisera toujours un dispositif de pipetage, le pipetage à la bouche est formellement interdit. Les pipettes doivent être cotonnées pour réduire la contamination du dispositif. Les pipettes à deux traits sont préférées aux autres puisqu’on n’est pas obligé d’y souffler pour les vider. On ne doit pas utiliser des seringues munies d’une aiguille hypodermique pour pipeter.
Pour éviter la dispersion du matériel infectieux qui tomberait accidentellement de la pipette on placera sur le plan de travail un matériel absorbant qui sera ensuite éliminé selon la procédure applicable aux déchets infectieux.
Les pipettes contaminées seront complètement immergées dans un désinfectant approprié placé dans un récipient incassable. On les laissera tremper suffisamment longtemps avant de les éliminer.

REGLES D’UTILISATION DES CENTRIFUGEUSES

Le bon fonctionnement mécanique des centrifugeuses est un élément indispensable à la sécurité microbiologique.
La centrifugeuse sera placée à une hauteur telle que l’opérateur puisse voire à l’intérieur de la cuve pour disposer correctement les godets (ou les pots ou nacelles selon le cas) sur les tourillons. Les tubes à centrifuger ainsi que les récipients contenant les échantillons devront être en verre épais ou de préférence en matière plastique et ils devront être inspectés avant usage à la recherche de défaut éventuel
En aucun cas les bouchons de cotons ou de caoutchouc ne doivent être utilisés. Ils seraient précipités au fond des tubes sous l’action de la force centrifuge. Les godets doivent être remplis, équilibrés, fermés et ouverts au mieux dans une enceinte de sécurité microbiologique. Les pots (godets ou nacelles) fixés sur les tourillons seront appariés d’après leur poids et correctement équilibrés une fois les tubes en place.
Si on utilise des rotors angulaires il faut veiller à ce que les tubes ne soient pas trop remplis pour éviter les risques de fuite.
Comme tous les appareils en rotation les centrifugeurs doivent comporter des systèmes de protection en raison des dangers que peuvent représenter leur utilisation. Cette sécurité est assurée par un carter métallique comportant un couvercle rabattable ou pivotant. Le couvercle fermé, l’appareil est branché sur le serveur, il convient de rappeler qu’une prise de terre est obligatoire. Si l’appareil comporte une minuterie, elle est réglée sur le temps de centrifugation exigé.
Une bonne technique de centrifugation et l’utilisation des tubes soigneusement fermés offrent une protection satisfaisante contre les aérosols infectieux et les particules en suspension.

REGLES D’UTILISATION ET D’ENTRETIEN DES CONGELATEURS

L’utilisation efficiente et l’entretien périodique des congélateurs, réfrigérateurs participent à la biosécurité et à un travail de qualité compétitif.
Les congélateurs, les réfrigérateurs et les enceintes à dioxydes de carbone solides (carboglace) seront dégivrés et nettoyées périodiquement (les tubes et les ampoules cassées seront retirés). On portera une protection faciale et des gants en caoutchoucs pour effectuer le travail. Après nettoyage les surfaces intérieures seront désinfectées.
Les récipients conservés dans le congélateur doivent être clairement étiquetés, en indiquant le nom scientifique du contenu, la date de stockage, et le nom de la personne qui les a stockés. Le matériel sans étiquette sera autoclavé et éliminé.
Il faut tenir un inventaire du contenu du congélateur. Les solutions inflammables ne doivent être conservées dans un réfrigérateur qui n’est pas antidéflagrant. Un étiquetage de mise en garde sera apposé sur la porte des réfrigérateurs.

Table des matières

Introduction
Première partie : Rappels Bibliographiques
Chapitre1 : L’hygiène et la sécurité au laboratoire
1 La conception du laboratoire
1-1/ Le laboratoire proprement dit
1-2/ Les annexes du laboratoires
2 Les équipements de laboratoire et les équipements de sécurité
2-1/ Le matériel de laboratoire
A- La qualité du matériel
B- Les conditions d’utilisation du matériel de laboratoire
2-2/ Les équipements de sécurité
A- Les enceintes de sécurité microbiologiques (ESM)
B- Les équipements et vêtements de protection individuelle
B1) Les blouses
B2) Les gants
B3) Les lunettes
B4) Les appareils et masques respiratoires
3 Les techniques microbiologiques
3-1/ Les techniques de base
A- Règles pour la gestion des prélèvements
B- Rejet des prélèvements inappropriés
C- Conservation et transport des échantillons
D- Règles pour la manipulation des échantillons
E- Règles d’utilisation des pipettes et des dispositifs de pipetage
F- Règles d’utilisation des centrifugeuses
G- Règles d’utilisation et d’entretien des congélateurs
3-2/ La décontamination
A- L’antisepsie
A1) Définition et généralités
A2) Modalités d’utilisation
B- La désinfection
B1) Définition
B2) Désinfection des locaux
B3) Désinfection du matériel
C- La stérilisation
C1) Stérilisation par la chaleur
a) Chaleur sèche
b) Chaleur humide
c) Vapeur fluente
d) température plus basse
C2) La filtration
3-3/ Gestion des déchets de laboratoire
A- Risques liés aux déchets
A1) Les risques sur la santé humaine
A2) Les risques sur l’environnement
B) – Les filières d’élimination
Chapitre 2 : La prévention
1 La connaissance du risque microbiologique
1-1/ La notion de risque
1-2/ Le risque biologique
1-3/ Les agresseurs biologiques
1-4/ Rappel des voies de pénétration
1-5/ Les expositions
A- Les expositions dites délibérées
B- Les expositions dites potentielles
C- Les expositions dites accidentelles
2 La prévention proprement dite
2-1/ Formation à la sécurité biologique et à l’information des travailleurs
2-2/ La prévention médicale
A- La vaccination et le contrôle médical
A1) La vaccination
A2) Le contrôle médical
B- L’installation de laboratoire de microbiologie
B1) Le niveau de confinement
B2) Le management de la qualité
2-3/ Les bonnes pratiques de laboratoire et les équipements de protection individuelle
A- La manipulation des matières infectieuses
B- Les équipements de protection individuelle
C- La manipulation des substances toxiques
C1) Etiquetage des substances toxiques
C2) Etiquetage des produits inflammables
C3) Substances risquant l’explosion par chauffage
C4) Substances toxiques par inhalation
D- Mesure de prévention contre l’incendie
D1) Stockage des produits inflammables
D2) Moyen de lutte contre l’incendie
2-4/ Les enceintes de sécurité microbiologiques (ESM)
2-5/ La décontamination et la gestion des déchets
2-6/ Le pictogramme de sécurité
2-7/ Le plan d’urgence
Deuxième partie : Travail personnel
CHAPITRE1 : CADRE D’ETUDE
CHAPITRE 2: METHODOLOGIE
1 Type d’étude
2 Matériels d’étude
3 Méthode d’étude
Chapitre 3 : Résultats
1 La Conception du laboratoire
2 L’installation en eau, gaz, électricité
2-1/ L’installation en eau
2-2/ L’installation en gaz
2-3/ L’installation en électricité
3 L’équipement de sécurité
3-1/ Les enceintes de sécurité microbiologique
3-2/ L’équipement de protection individuelle
4 Les techniques de base
5 Disponibilité de produits et consommables d’hygiène
6 La décontamination
7 Les produits chimiques
8 Les réfrigérateurs
9 Sécurité incendie
10 La gestion des déchets au laboratoire
11 Santé – Sécurité – Travail : Management de la qualité
CHAPITRE 4 : Discussion
1 La Conception du laboratoire
2 L’installation en eau, gaz, électricité
3 L’équipement de sécurité
3-1/ Les enceintes de sécurité microbiologiques
3-2/ L’équipement de protection individuelle
4 Les techniques de base
5 Disponibilité de produits et consommables d’hygiène
6 La décontamination
7 Les produits chimiques
8 Les réfrigérateurs
9 Sécurité incendie
10 La gestion des déchets au laboratoire
11 Santé – Sécurité – Travail : Management de la qualité
CHAPITRE 5 : Recommandations
Conclusion
Bibliographie

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