Soutenance mémoire
La microbiologie
Les microbes sont partout : dans l’eau, dans l’air, sur le sol, sur la peau, sur les objets, dans le tube digestif, dans les aliments… On classe les microbes suivant leur taille :
• Moisissures
• Levures
• Bactéries
• Virus
Les microbes endossent souvent une mauvaise réputation et beaucoup pensent qu’ils sont tous nocifs. S’il est vrai que certains microbes sont dangereux, la plupart sont utiles pour l’homme. Ainsi, les microbes sont utilisés pour la fabrication d’aliments (bière, fromages, pain…) mais aussi dans les biotechnologies (production d’antibiotiques et autres principes actifs….). Non seulement les bactéries sont indispensables à la vie (rappelons que les bactéries fertilisent les sols et permettent le développement des végétaux, indispensables à notre vie) mais elles sont de plus à l’origine de la vie. Il y a quelques centaines de milliers d’années se formaient des êtres unicellulaires : les bactéries (en fait les archéobactéries), qui allaient, au cours de l’évolution donner un être pluricellulaire : l’homme. Nos cellules contiennent encore des vestiges de bactéries : des organites appelés mitochondries, véritables centrales énergétiques. Pour les aliments, les microbes ont des effets de deux types bien distincts :
• Altération des aliments : les microbes dégradent les aliments, ils altèrent le goût, l’odeur, l’aspect, en somme la qualité marchande du produit.
• Maladies alimentaires : des microbes dangereux se développent dans les aliments entraînant deux types de maladies alimentaires (dietetique.bts.free, 29- 10-07): TIA ou Toxi-Infection Alimentaire ou « Intoxication » : les microbes produisent, dans certaines conditions un poison appelé toxine responsable de divers troubles : diarrhées, vomissement, fièvres, douleurs abdominales parfois même la mort. Ces toxines sont en effet parfois mortelles : la neurotoxine botulique, par exemple, qui est 20 000 fois plus active que l’arsenic. Les principales bactéries qui produisent des toxines sont :
– Salmonelles et Staphylocoques dorés (responsables de 1/3 des T.I.A) ;
– Clostridium perfringens germe anaérobie, sulfitoréducteur sporulant, les Clostridum botulinum Bacille, anaérobie strictes, sporulant dans des conditions défavorables, ses spores sont thermorésistantes mais les toxines thermosensibles.
Les MIA ou Maladies Infectieuses d’origine Alimentaires : moins fréquentes que les TIA. Elles sont dues au développement des bactéries dans l’organisme, après ingestion d’un aliment contaminé. Gastro-entérites dues à Escherichia coli; les listérioses dues à Listeria monocytogenes, les fièvres typhoïdes, brucellose sont quelques exemples de M.I.A.
Les critères de développement des bactéries
Il est important de bien connaître les critères de développement des bactéries pour lutter contre leur propagation et les éliminer. Les bactéries se développent par scissiparité : une cellule-mère donnant naissance à deux cellules-filles identiques, de génération en génération, constituant un clone. Deux cellules identiques sont produites à partir d’une cellule mère. Elles ont une vitesse de développement considérable. La durée de multiplication des bactéries est variable suivant le type de bactéries, mais on peut dire que si les conditions sont favorables elle est de l’ordre de 20 à 30 minutes. Une bactérie donne ainsi naissance à 1 milliard de bactéries en 10 H. Ce qui signifie que si vous abandonnez un plat cuisiné avec 25 000 germes/g (conforme à la norme) à température ambiante, il contiendra de ce fait au bout de 2 heures 640 000 germes. D’où l’importance du respect de la chaîne du froid (< 4°C) ou du chaud (> + 65°C). Bien sûr le développement bactérien n’est pas indéfini sinon les bactéries recouvreraient rapidement toute la planète. Au bout de 30 H, le milieu nutritif commence à manquer, les bactéries sont limitées dans leur déplacement et sont intoxiquées par leurs propres déchets. Chaque division donne naissance à deux bactéries La croissance cellulaire se manifeste par un accroissement du volume cellulaire, suivi de la synthèse d’un septum transversal au milieu de la cellule, aboutissant à la séparation des deux cellules-filles. La division bactérienne est précédée par la duplication du chromosome bactérien grâce à la réplication de l’ADN (Acide Désoxyribonucléique). Mais il est à noter qu’elles sont capables d’échanger du matériel génétique par phénomène de transformation, de conjugaison ou de transduction. Au cours de la transformation, c’est un plasmide qui est transféré dans la cellule bactérienne, alors qu’au cours de la transduction, le transfert d’ADN a lieu par l’intermédiaire d’un bactériophage. Au cours de la conjugaison, deux bactéries peuvent se rapprocher, grâce à des structures spéciales, les pili et il y a alors un transfert d’ADN d’une bactérie à une autre. L’ADN étranger peut être intégré dans le génome et être transmis aux générations suivantes. Cette acquisition de gènes, provenant d’une bactérie ou de l’environnement, est appelée transfert horizontal de gène (HGT pour horizontal gene transfer). Le transfert de gènes est particulièrement important dans les mécanismes de résistance aux antibiotiques.
Les types de contamination
Ils existent différentes manières de contamination :
°la contamination directe : elle se produit quand on est en contact direct avec la bactérie,
°la contamination indirecte : elle se fait par le biais des produits ou objets souillés ou contaminés,
°la contamination croisée : résultante d’une contamination directe et d’une contamination indirecte.
Ensemencement et incubation
A l’aide d’une pipette stérile, transférer dans la boite 1 ml de la suspension mère ;
Prendre une autre boite de Pétri stérile. A l’aide d’une nouvelle pipette stérile, transférer dans la boîte 1ml de la première dilution décimale de l’échantillon ou de sa suspension mère ;
Recommencer ces opérations avec les dilutions décimales suivantes ;
Couler dans chaque boite de Pétri environ 15ml du milieu VRBL refroidi à environ 47°C au bain d’eau ;
Mélanger soigneusement l’inoculum au milieu de culture et laisser le mélange se solidifier en posant les boîtes de Pétri sur une surface fraîche et horizontale ;
Après solidification du mélange, ajouter une couche d’environ 5ml de milieu VRBL, afin d’empêcher l’étalement des colonies, laisser se refroidir sur une surface fraîche et horizontale ;
Retourner les boîtes ainsi préparées et incuber dans l’étuve réglée à 44 + 1°C, pendant 24 + 2h.
Note : Il est important de mettre rapidement en incubation les boîtes après solidification.
La congélation (Jean Paul Larpent et Monique Larpent Gourgaud, éd 1997)
La congélation dont nous parlons consiste en un refroidissement à plus ou moins basse température de crevettes décortiquées contenant une suspension de microorganismes (spores ou cellules). Ce sont surtout les cristaux internes qui se montrent les plus dangereux en endommageant les structures de la cellule. Lors de la congélation, la cellule est soumise à deux phénomènes simultanés :
– une sortie d’eau rapide due à la cristallisation extracellulaire,
– une perte de chaleur due au gradient thermique.
La mort cellulaire intervient quand ces deux phénomènes ont des constantes de temps voisines, et il se produit une perméabilisation de la membrane plasmique. En effet, d’après les études menées par le Centre Technique de la Salaison, de la Charcuterie et des Conserves de Viandes (Maisons-Alfort, France), du fait de la variation de la sensibilité des microbes aux basses températures, la contamination microbienne est sous estimée lorsque les produits alimentaires sont congelés avant analyse microbiologique. Par conséquent, si l’analyse ne peut pas être effectuée dans les 24 heures suivant la réception de l’échantillon, il est préférable, d’après ce laboratoire, de conserver le produit à basse température plutôt que de le congeler ; ceci dans un souci de sécurité alimentaire (In bulletin de liaison du CTSCCV 2002 et 2004) Mais, dans le cadre d’une conservation des souches bactériennes, des cryoprotecteurs sont utilisés pour éviter cette cristallisation. Or lors de l’expérience, aucun agent protecteur n’a été utilisé. Et s’il y a eu utilisation d’agent protecteur, il n’aurait été efficace que si la vitesse de congélation est progressive de l’ordre de 1°C par minute jusqu’à – 30°C –40°C.
Remarque : les agents protecteurs sont les suivants : polyalcools (glycérol, diéthylèneglycol, i-érythritol) ; sucres (glucose, saccharose, dextrane) ; sulfoxide (diméthylsulfoxide ou DMSO) ; amides (diméthylacétamide, diéthylformamide, acétamide) ; pôlymères solubles (polyéthylène glycol, polyvinylpyrrolidone) ; protéines solubles (albumine humaine, ovalbumine).
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Table des matières
Introduction
Première partie : RAPPELS
I – La microbiologie
I-1 Définition
I-2 Description
I-3 Les différents types de bactéries
I-4 Le développement et la reproduction des bactéries
a) Le milieu
b) Les éléments nutritifs
c) Le besoin hydrique
d) Le pH
e) Le besoin en Oxygène
f) Les radiations
g) Les composés chimique
II – La congélation
II-1 Définition
II-2 Les conditions
II-3 Les avantages et les inconvénients
II-3-1 Les avantages
II-3-2 Les inconvénients
II-4 Les facteurs de congélation
III- La contamination
III-1 Définition
III-2 Les types de contaminations
IV- Le laboratoire d’autocontrôle
V- Les crevettes de type Peneaus indicus
V-1 Définition
V-2 Biologie
Deuxième partie : MATERIEL ET METHODE
I- Préparation des échantillons, de la substance mère et des dilutions décimales en vue de l’analyse microbiologique
I-1 Définition
I-1-1 Suspension mère ( Première dilution)
I-1-2 Dilutions décimales suivantes
I-2 Principe
I-3 Le matériel
a) Appareil de laboratoire et verrerie
b) b) les milieux de culture et réactifs
I-4 Le mode opératoire
I-4-1 Décorticage et pesage
I-4-2 Préparation de l’échantillon pour essai et suspension mère
I-4-3 Dilution décimale
I-4-4 Durée des opérations
I-4-5 Remarques importantes
II- La contamination
III- Analyses microbiologique
III-1 Flores Totales Mésophiles
III-1-1 Principe
III-1-2 Appareil de laboratoire et verrerie
a) Matériel et verrerie
b) Milieux et réactifs
III-1-3 Ensemencement et incubation
III-1-4 Comptage des colonies
a) Cas général : comptage des colonies en totalité
b) Cas à petit nombre : Nombre estimé (NE)
Nombre de colonie dans boîte = 0
Une seule dilution < 300
III-2 Les Coliformes Thermotolérants
III-2-1 Principe
III-2-2 Appareil de laboratoire et verrerie
a) Matériel et verrerie
b) Milieux et réactifs
III-2-3 Ensemencement et incubation
III-2-4 Méthode de dénombrement des Coliformes Thermotolérants
COMPTAGE DES COLONIE
a) Cas général : comptage des colonies en totalité
b) Estimation de petit nombre
III-3 Les Anaérobies Sulfito-Réducteurs (ASR)
III-3-1 Appareil de laboratoire et verrerie
a) Matériel et verrerie
b) Milieux de culture et réactif
III-3-2 Ensemencement et incubation
III-3-3 Méthode de dénombrement des Anaérobies SulfitoRéducteurs
III-4 Les Staphylococcus aureus
III-4-1 Appareil de laboratoire et verrerie
a) Matériel et verrerie
b) Milieux et réactifs
III-4-2 Ensemencement et incubation
III-4-3Méthode de dénombrement des Staphylococcus aureus
a) Calcul du nombre N de staphylocoques à coagulase positive identifiés présents dans la prise d’essai
b) Estimation des petits nombres
IV-Le devenir de produits contaminés et des matériels souillés après le dénombrement
Troisième partie : LES RESULTATS DE L’ETUDE
I- Résultat des Flores totales Mésophiles
I-1Courbe de l’évolution du nombre des Flores Totales Mésophiles chez les crevettes
I-2 Calcul de la moyenne et des pourcentages
a) nombre de colonies qui disparaîtrait chaque semaine
b) la moyenne
c) le pourcentage en bactérie final restant dans le produit
d) le pourcentage de bactérie qui diminue par semaine en moyenne
II- Résultat de la congélation des Coliformes Thermotolérants
II-1Courbe de l’évolution du nombre des Coliformes Thermotolérants chez les crevettes
II-2 Calcul de la moyenne et des pourcentages
a) nombre de colonies qui disparaîtrait chaque semaine
b) la moyenne
c) le pourcentage en bactérie final restant dans le produit
d) le pourcentage de bactérie qui diminue par semaine en moyenne
III- Résultat de la congélation des Anaérobies Sulfito-Réducteurs
III-1Courbe de l’évolution du nombre des Anaérobies SulfitoRéducteurs chez les crevettes
III-2 Calcul de la moyenne et des pourcentages
a) nombre de colonies qui disparaîtrait chaque semaine
b) la moyenne
c) le pourcentage en bactérie final restant dans le produit
d) le pourcentage de bactérie qui diminue par semaine en moyenne
IV- Résultat de la congélation des Staphylococcus aureus
IV-1Courbe de l’évolution du nombre des staphylocoques chez les crevettes
IV-2 Calcul de la moyenne et des pourcentages
a) nombre de colonies qui disparaîtrait chaque semaine
b) la moyenne
c) le pourcentage en bactérie final restant dans le produit
d) le pourcentage de bactérie qui diminue par semaine en moyenne
V- Résumé des résultats
Quatrième partie :INTERPRETATIONS ET LES MESURES A PRENDRE POUR GARANTIR UNE BONNE QUALITE D’UN PRODUIT
A- INTERPRETATIONS
I- Les constituants de la paroi de la bactérie
I-1 principe de coloration Gram
I-2 L’enveloppe des bactéries Gram +
I-3 L’enveloppe des bactérie Gram-
II- La congélation
III- Les limites de l’expérience et la suivie de l’expérience au sein de l’entreprise
III-1 Les éventuelles limites de notre expérience
III-1-1La balance de précision
III-1-2 Le courant électrique
III-2 La suivie de l’expérience dans l’entreprise
Pour A.S.R/g 46°C
a) Tableau des résultats
b) Interprétation
c) Résultats
B- LES MESURES A PRENDRE POUR GARANTIR UNE BONNE QUALITE D’UN PRODUIT
I- La qualité microbiologique
Définitions
a) La sécurité
b) La valeur d’usage
c) L’assurance de la qualité
d) L’analyse des risques et maîtrise des points critiques
II- Les exigences applicables aux établissements, y compris les navires, manipulant les produits de la pêche
II-1 Exigences applicables aux produits frais de la pêche
II-2 Exigences applicables aux produits congelés
II-3 Exigences concernant les parasites
III- Exigences applicables aux produits de la pêche transformés
IV- Normes sanitaires applicables aux produits de la pêche
IV-1 Propriétés organoleptiques des produits de la pêche
IV-2 Histamine
IV-3 Azote basique volatil total (ABVT)
IV-4 Parasites
IV- 5 Toxines dangereuses pour la santé humaine
IV-6 Critères microbiologiques des produits de la pêche et de l’aquaculture destinés à l’alimentation humaine en vue de l’exportation
V- Conditionnement et emballage des produits de la pêche
VI- Entreposage des produits de la pêche
VII- Transport des produit de la pêche
VIII- Hygiène du personnel
IX- Traitement thermique
X- Les limites et les atouts de ces arrêtés émanant du ministère de l’agriculture
CONCLUSION
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