La conception classique du phénomène de coagulation

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Physiologie de la coagulation

La coagulation plasmatique est caractérisée par une succession de réactions enzymatiques aboutissant à la formation d’un réseau de fibrine qui consolide l’amas de plaquettes fixés sur la brèche vasculaire. On distingue classiquement deux voies de la coagulation : une voie endogène et une voie exogène. La coagulation représente un phénomène localisé dans le temps et dans l’espace, rapide grâce à une auto-amplification locale et régulée négativement de façon à ne pas obstruer tout le vaisseau.

Les acteurs de la coagulation

La coagulation plasmatique fait intervenir différentes protéines: les facteurs de la coagulation, le facteur tissulaire et les inhibiteurs physiologiques de la coagulation.
 Les facteurs de la coagulation : ils sont au nombre de 12 et sont pour la plupart désignés par un chiffre romain. Tous les facteurs de la coagulation circulent sous forme inactive sauf le facteur VII. Une fois activés, les facteurs de la coagulation portent leur nom suivi du suffixe « a ». La majorité d’entre eux est synthétisée par le foie. Ils sont regroupés en différentes catégories selon leurs structures et leurs fonctions (Tableau I).
o Les pro-enzymes
 Vitamine K dépendants : II, VII, IX et X sont des zymogènes de sérine protéase, enzymes protéolytiques
 Les facteurs contact : prékallicréine, XI et XII sont également des zymogènes de sérine protéase
 Le facteur XIII : zymogène d’une transglutaminase, enzyme établissant des liaisons covalentes entre deux protéines
o Les cofacteurs : V, VIII et kininogène de haut poids moléculaire n’ont pas d’activité enzymatique mais jouent un rôle de cofacteur. Pour acquérir cette fonction, les facteurs V et VIII doivent être activés par protéolyse
o Le fibrinogène : substrat final des réactions de coagulation. C’est une protéine soluble transformée en protéine insoluble par la thrombine.

Le déroulement du processus de la coagulation

La coagulation est une cascade de réactions enzymatiques aboutissant à la formation de fibrine. L’enzyme central permettant de transformer le fibrinogène en fibrine est la thrombine. Le processus de formation de la thrombine est complexe avec une série d’activations enzymatiques qui surviennent à la surface des phospholipides membranaires des plaquettes, cellules endothéliales ou monocytes

La conception classique du phénomène de coagulation

Elle fait intervenir deux voies d’activation de la coagulation qui se rejoignent en une voie commune (Figure 2).
 La voie exogène ou voie extrinsèque ou voie du facteur tissulaire : c’est la voie la plus rapide et la plus importante. L’exposition du facteur tissulaire au contact du sang permet l’activation du facteur VII. Le complexe FT/VIIa active le facteur X en Xa. L’ensemble de ses réactions se déroule à la surface des plaquettes, en présence de phospholipides et de calcium.
 La voie endogène ou intrinsèque : elle est accessoire et fait intervenir les facteurs de la phase contact. La prékallicréine et le kininogène de haut poids moléculaire activent le facteur XII en XIIa. L’activation du facteur XII entraine celle du facteur XI qui à son tour active le facteur IX. Le facteur IXa va former avec le facteur VIIIa en présence de phospholipides et de calcium le complexe ténase qui va activer le facteur X en Xa.
 La voie commune : le facteur Xa va former avec le facteur Va, le calcium et les phospholipides le complexe prothrombinase qui transforme la prothrombine (II) en thrombine (IIa). La thrombine transforme le fibrinogène en fibrine et active le facteur XIII qui stabilise le caillot.
Cependant, le déroulement de la coagulation in vivo ne respecte pas cette distinction voie intrinsèque – voie extrinsèque. Cette conception duelle de la coagulation correspond en fait aux processus de coagulation in vitro et sera très utile pour l’exploration de la coagulation car ces deux voies sont explorées par deux tests différents.

La conception réelle de la coagulation in vivo

 Initiation de la coagulation
Le stimulus initial de la coagulation est le contact du sang avec le facteur tissulaire. Ce dernier fixe à la fois le facteur VII et les traces de facteur VIIa du sang circulant, formant un complexe FT/VIIa. Selon la quantité de facteur tissulaire présente, ce complexe va activer directement le facteur X (FT en quantité importante) ou le facteur IX (FT en faible quantité) qui va secondairement activer le facteur X via le complexe ténase (IXa-VIIIa-PL et Ca++) (Figure 3)
Parallèlement à l’initiation de la coagulation par le facteur tissulaire, l’exposition de collagène sous endothélial est capable d’activer le système contact, où interviennent la prékallicréine, le KHPM, le facteur XII et le facteur XII. Cependant cette voie est mineure et les déficits même sévères en facteur XII, PK et KHPM n’augmentent pas le risque hémorragique.
 Formation de thrombine et amplification du processus
Les facteurs Xa et IXa activent leurs substrats respectifs à la surface des plaquettes activées entrainant alors la formation des premières molécules de thrombine. Celle-ci amplifie immédiatement sa propre formation :
o Recrutement et activation de nouvelles plaquettes avec une exposition plus grande de phospholipides membranaires et donc de surfaces catalytiques
o Activation des cofacteurs V et VIII
o Activation du facteur XI (Figure 3)

La régulation de la coagulation

La coagulation est régulée par trois principaux systèmes :
 L’Antithrombine (AT) : se fixe aux héparanes sulfates de la paroi vasculaire et inhibe les facteurs IIa, Xa, IXa, XIa et XIIa lorsqu’ils diffusent à distance du caillot. Elle forme avec ces enzymes des complexes irréversibles.
 La protéine C activée (PCa) à l’aide de son cofacteur la protéine S (PS) inactive par protéolyse les cofacteurs Va et VIIIa en présence de Ca++ et de phospholipides. L’activation de la protéine C est régulée par la thrombomoduline (TM): c’est un récepteur qui fixe la thrombine et la transforme en activateur de la PC. Un deuxième récepteur l’EPCR fixe la PC et accélère son activation par le complexe IIa-TM.
 Le TFPI qui régule la voie du FT. Fixé sur les glycosaminoglycanes de la paroi vasculaire, le TFPI forme un premier complexe avec le facteur Xa. Il se forme ensuite un complexe quaternaire Xa-TFPI-VIIa-FT qui inhibe le facteur VIIa et bloque l’activité de FT.

Exploration de la coagulation

Elle peut être indiquée dans différentes situations :
 Pour évaluer un risque hémorragique avant une intervention chirurgicale
 Pour rechercher l’origine d’une symptomatologie hémorragique ou thrombotique
 Pour apprécier le retentissement d’une pathologie (Syndrome inflammatoire, Maladie hépatique, Maladies auto-immunes, hémopathies, insuffisance rénale…)
 Pour la surveillance biologique d’un traitement anticoagulant
L’exploration de la coagulation est généralement réalisée en deux temps. D’abord sont effectués des tests de dépistage dits de première intention ; puis secondairement, en fonction des résultats et du contexte clinique, des tests complémentaires dits de seconde intention sont réalisés.
Dans ce chapitre, nous traiterons essentiellement les trois principaux tests de première intention : le TQ, le TCA et la Fibrinémie.

Etape pré-analytique

Il s’agit d’une étape primordiale dont dépendent la qualité et la fiabilité des résultats

Prélèvement

Le prélèvement pour les tests de la coagulation doit respecter un certain nombre de conditions
 Il doit être réalisé de préférence après un jeune d’au moins 8h. Le patient doit rester assis au moins 10 à 15 minutes avant le prélèvement. Il est important de préciser une notion de prise médicamenteuse (anticoagulant).
 Le prélèvement doit être fait de préférence sur un tube contenant du citrate trisodique comme anticoagulant, à la concentration de 3,2% [10,18,19]. En effet, des études ont montré un allongement des temps de coagulation avec l’utilisation des concentrations de citrate à 3,8% [20].
 Les aiguilles de taille intermédiaire (19-21 gauges) sont recommandées.
 Il faut éviter de laisser le garrot attaché pendant une durée supérieure à une minute.
 Historiquement, le tube pour la coagulation était prélevé en deuxième position après un tube sec sans activateur de la coagulation ou après un ballon d’hémoculture pour éliminer les premières gouttes de sang supposés être riches en facteur tissulaire. Cependant, de nombreuses études ont prouvé que prélever le tube en première position n’avait pas d’impact sur les résultats [16,21–24].
 Il faut respecter le rapport volume anticoagulant / volume sang qui doit être de 1/9. Le CLSI recommande de rejeter tout échantillon dont le volume est inférieur à 90% du niveau de remplissage normal [10].
 Après le prélèvement, le tube doit être agité doucement par 4 à 5 retournements.

Transport

Dans l’idéal, le prélèvement est acheminé dans les plus brefs délais (˂1h), tube en position verticale, sans agitation et à température ambiante (18-22°C) ; les températures trop basses pouvant entraîner une activation du facteur VII, une activation des plaquettes et un risque de formation de cryoprécipités FVIII/WF. Les températures > 25°C peuvent dégrader le facteur VIII et la protéine S.

Centrifugation

Elle se fait à la vitesse de 1500g pendant 15mn selon le CLSI [10]. L’objectif de cette centrifugation est d’obtenir un plasma pauvre en plaquette (PPP) caractérisé par un taux de plaquettes ˂ 10G/L. Pour chaque laboratoire, il est recommandé de vérifier au moins une fois par année que les conditions de centrifugation répondent à cet objectif. Des auteurs ont validé des techniques de centrifugation rapide (4000-7000g pendant 1minute) produisant un PPP sans affecter les résultats du TQ, du TCA et de la fibrinémie [24,25]. Une double centrifugation est requise pour certains paramètres tels que le Lupus anticoagulant ou lorsque l’échantillon doit être congelé pour une analyse différée.

Conservation

La stabilité des échantillons pour les tests de la coagulation dépend de plusieurs variables : sang total ou centrifugé ; température de conservation entre autre (Tableau II). Salvagno et al ont suggéré une conservation maximale en sang total de 6h [26]. D’autres études ont retrouvé des délais de stabilité pouvant aller jusqu’à 24-48h en fonction des paramètres (Tableau III). Les tubes doivent être conservés bouchés pour minimiser la perte du CO2 et l’augmentation du pH du plasma. Lorsque l’analyse est différée, les échantillons doivent être congelés après une double centrifugation. Ils peuvent alors être conservés 1mois à -20°C et 6mois à -70°C. La décongélation doit être rapide (5 à 10mn) à 37°C (bain marie) et les tests effectués dans les 2heures qui suivent la décongélation après agitation au vortex.

Méthodes de coagulation

Les tests de coagulation consistent pour la plupart en des tests chronométriques ; c’est-à-dire basés sur la mesure du temps de formation d’un caillot de fibrine dans différentes conditions. Ils sont réalisables par des techniques manuelles, semi-automatiques ou automatisées avec une meilleure standardisation. Il existe différentes méthodes utilisées par les appareils pour détecter la formation du caillot in vitro :
 Les systèmes de détection mécaniques et électromécaniques : le temps mesuré correspond au temps au bout duquel l’automate perçoit une modification de la viscosité plasmatique en rapport avec la formation de fibrine.
 Les systèmes de détection optiques : le temps mesuré correspond au temps au bout duquel l’automate perçoit une opacification du milieu réactionnel avec diminution de la transmission de la lumière. Leur inconvénient principal est l’interférer avec les plasmas hémolysés, ictériques ou lipémiques.
Selon certaines études, il existe une bonne corrélation entre ces deux systèmes de détection pour le TQ, le TCA et la Fibrinémie [31,32].

Les tests d’exploration de la coagulation

Le temps Quick ou Taux de Prothrombine

 Principe : c’est le temps de coagulation d’un plasma citraté et pauvre en plaquette, recalcifié à 37°C, en présence d’un excès de facteur tissulaire et de phospholipides procoagulants. Le TQ explore la voie exogène de la coagulation et la voie commune donc les facteurs VII, V, X, II et le fibrinogène. Dans les conditions de concentration en facteur tissulaire utilisée, le complexe FT-VIIa active exclusivement le facteur X ; les facteurs IX et VIII ne sont donc pas explorés par le TQ.
 Réactifs : il s’agit d’une suspension de thromboplastine calcique constituée d’un mélange de facteur tissulaire et de phospholipides. Il existe différentes thromboplastines de sensibilité différente aux déficits en facteurs en fonction :
o De l’origine et de la concentration en facteur tissulaire
 Thromboplastine d’origine animale (bovine ou lapine) : Thrombotest® et Néoplastine® CI plus (Stago)
 Thromboplastine d’origine humaine (placenta) : Thromborel® (Siemens)
 Thromboplastine humaine recombinante : Innovin® (Siemens) et Recombiplastin® (IL)
o De la nature et de la concentration en phospholipides :
 phosphatidylsérine
 phosphatidylcholine
 phosphatidyléthanolamine.
 Technique : en pratique, on introduit dans un tube en verre placé au bain marie à 37°C 1volume de PPP et 2volumes de réactif en déclenchant le chronomètre. Puis on détecte l’apparition du caillot à l’aide d’un crochet ou par inclinaison et le chronomètre est arrêté dès qu’il y a coagulation. Cette technique manuelle est de nos jours remplacée par les techniques semi automatiques et automatisées mais qui restent basées sur le même principe
 Résultats
o Le TQ est exprimé en secondes. Les valeurs normales sont comprises entre 10 et 15 secondes selon les réactifs. Le temps de coagulation du plasma du patient est toujours est toujours comparé à celui d’un plasma témoin.
o Les résultats peuvent être exprimés en pourcentage d’activité prothrombinique, improprement appelé « Taux de prothrombine » (TP). Le pourcentage est calculé par références à différentes dilutions d’un plasma témoin qui, par définition, correspond à 100% de la normale. La correspondance TQ – TP se fait grâce à une droite appelée droite de Thivolle. Les valeurs normales du TP sont comprises entre 70 et 100%.
o L’INR (International Normalized Ratio) est un mode d’expression du TQ exclusivement réservé à la surveillance biologique du traitement anticoagulant par les antagonistes de la vitamine K. L’INR correspond au rapport du TQ du patient sur le TQ témoin, élevé à la puissance ISI (International Sensitivity Index). Chaque fournisseur étalonne sa thromboplastine par rapport à une thromboplastine de référence fournit par l’OMS et indique l’ISI sur la notice du réactif. L’OMS recommande d’utiliser une thromboplastine avec un ISI compris entre 0,9 et 1,7. Chez le sujet normal, l’INR doit être inférieur à 1,2. Chez les patients sous AVK, la zone thérapeutique est variable selon l’indication : 2-3 (Flutter atrial, infarctus du myocarde…) et 3-4 (valvulopathies mitrales, prothèses valvulaires…).

Le temps de Céphaline + activateur

 Principe : le TCA mesure le temps de coagulation à 37°C d’un plasma citraté et pauvre en plaquettes en présence de phospholipides, d’un activateur de la phase contact et de calcium. Il explore la voie endogène de la coagulation et la voie commune et donc la PK, le KHPM, les facteurs XII, XI, IX, VIII et X, V, II et le fibrinogène.
 Réactifs :
o Céphaline (phospholipides)
o Activateur de la phase contact : célite, silice, acide ellagique, kaolin
o Solution de CaCl2 à 0,025(mol/l)
La sensibilité du test est variable en fonction de la nature de l’agent activateur et de la concentration et nature en phospholipides. Le choix de la céphaline doit ainsi dépendre de l’objectif du TCA : surveillance d’un traitement par héparine, dépistage d’un déficit en facteur ou dépistage d’un anticoagulant circulant.
 Technique : la technique manuelle consiste à introduire dans un tube en verre placé au bain marie à 37°C 1volume de PPP et 1volume de réactif que l’on incube pendant 3minutes puis on ajoute 1volume de CaCl2 en déclenchant le chronomètre. L’apparition du caillot est détectée à l’aide d’un crochet ou par inclinaison. Le chronomètre est arrêté dès qu’il y a coagulation.
 Résultats : ils sont exprimés en secondes. La valeur normale varie entre 20 et 40 secondes en fonction du réactif. Le temps de coagulation mesuré est toujours exprimé par rapport au temps d’un plasma témoin. Le TCA est allongé lorsque le temps mesuré dépasse de 6 à 8 secondes le temps du témoin. Cependant, la frontière n’est pas stricte et le résultat peut être exprimé en ratio : Temps du patient/Temps du témoin. Le ratio doit être inférieur à 1,2 chez le sujet normal.

Le dosage du fibrinogène par méthode chronométrique.

 Principe : le temps de coagulation d’un PPP, dilué dans des proportions adéquates, mis en présence d’un excès de thrombine, à 37° et en optimum calcique, est directement fonction du taux de fibrinogène fonctionnel plasmatique. Ce test est une variante du temps de thrombine qui explore la fibrinoformation.
 Réactifs
o Solution de thrombine calcique contenant un inhibiteur de l’héparine
o Tampon pH 7, 35 permettant la dilution du plasma
 Technique :
o Il faut d’abord réaliser une dilution du plasma au 1/10
o Puis, dans un tube en verre, placé dans un bain marie à 37° introduire 1volume de PPP que l’on incube pendant 2 min avant de rajouter 1volume de thrombine calcique en déclenchant le chronomètre.
o Détecter le caillot à l’aide d’un crochet ou par inclinaison modérée et arrêter le chronomètre dès qu’il y a coagulation.
 Résultats
o Ils sont exprimés en secondes puis convertis en g/l à l’aide d’une droite d’étalonnage obtenue en mesurant le temps de coagulation d’une série de dilution d’un plasma témoin dont le taux de fibrinogène en g/l est connu.
o Dans le cas d’une fibrinogénémie normale (2 à 4g/L) le temps de coagulation est compris entre 8 et 25 secondes.

Echantillonnage

 Population d’étude : elle était constituée par des volontaires apparemment sains et les patients externes reçus au laboratoire
 Critère d’inclusion :
o Volontaires sains (internes, personnel de l’hôpital) après un consentement libre et éclairé
o Patients externes reçus pour une surveillance biologique d’un traitement anticoagulant oral ou pour un bilan préopératoire pour une étiologie n’entraînant pas à priori de perturbations de l’hémostase ayant consenti à participer à l’étude.
Nous avons inclus de façon systématique tous les patients reçus pendant la période d’étude et remplissant les critères d’inclusion.
 Critères de non inclusion
o Sujets âgés de moins de 15 ans
o Sujets ayant des veines difficiles ou un mauvais état général

Recueil des échantillons

Pour chaque sujet inclus dans l’étude, nous avons prélevé un échantillon sanguin dans cinq tubes citrate remplis à différents niveaux : 100%, 90%, 80%, 70% et 60% de remplissage.
Nous avons utilisé les tubes Citrate en plastique 3,2% Golden Vac™ de 4ml (Lot N° 160403). Les volumes correspondant aux différents niveaux de remplissage ont été déterminés par calcul puis un tube est rempli avec un volume correspondant afin de marquer le niveau du prélèvement par un trait.
Par exemple 100% de remplissage correspond à 4ml, 90% correspond à (4×90)/100 = 3.6ml. De même 80%, 70% et 60% correspondent respectivement à 3.2ml, 2.8ml et 2.4ml.
Après prélèvement, les échantillons sont immédiatement centrifugés à 3000 tours/mn pendant 15mn puis testés pour le TQ, le TCA et la Fibrinémie avec les deux automates STA COMPACT® des laboratoires Stago (France) et CA-600® des laboratoires Sysmex (Japon)

Matériel et réactifs

 STA COMPACT®-Stago : il s’agit d’un analyseur de la coagulation utilisant une méthode de détection chronométrique du caillot pour la détermination du TQ, du TCA et de la Fibrinémie. Nous avons utilisé comme réactifs la Néoplastine®CI plus pour le TQ avec un ISI égal à 1,3 ; le STA-PTTA® pour le TCA et le STA Liquid Fib® pour la Fibrinémie.
 Sysmex® CA-600 Systems : utilise une méthode de détection photo-optique pour la détermination du TQ, du TCA et de la Fibrinémie. Les réactifs utilisés sont l’Innovin® (ISI=0,97), le Dade Actin®FS et le Dade Thrombin® respectivement pour le TQ, le TCA et la Fibrinémie.

Paramètres étudiés

Tous les résultats des TQ, TCA et Fibrinémie ont été validés par un contrôle qualité interne.
Pour chaque sujet inclus dans l’étude, nous avons recueilli l’âge, le sexe et la notion de prise de traitement. Sur chaque échantillon prélevé, nous avons déterminé le TQ avec TP et INR ; le TCA et son ratio ; et la Fibrinémie en seconde et en g/l.

Analyses statistiques

La saisie et l’analyse des données ont été effectuées grâce aux logiciels Excel 2013 et SPSS2.0. Le test de Student ou le test de Wilcoxon Man Withney ont été utilisés pour comparer nos différentes moyennes selon que les données avaient ou non une distribution normale. Une valeur de p < 0,05 a été considérée comme statistiquement significative.

Résultats obtenus avec les deux machines

Les tableaux V, VI et VII résument les résultats obtenus avec les deux automates et dans les deux groupes. Chez les sujets sains comme chez les patients sous AVK, un allongement des temps de coagulation était observé avec le sous remplissage des tubes. Ainsi, plus le volume de l’échantillon diminue, plus nous observons un allongement du TQ avec parallèlement une diminution du TP et augmentation de l’INR ; un allongement du TCA avec augmentation du ratio ; et une augmentation du temps de coagulation pour la fibrinémie avec comme conséquence une diminution du taux de fibrinémie en g/l (Figure 5).

Comparaison STA COMPAT® et ® CA-600®

La comparaison entre les deux machines intéressait les trois paramètres INR, Ratio du TCA et Fibrinémie en g/l, uniquement pour les tubes remplis à 100%.
 Pour l’INR
o Chez les sujets sains le STA COMPACT® a donné des valeurs plus élevées comparées au CA-600®, avec une différence statistiquement significative (p˂0,001) (Tableau X). Mais 59 sujets sur 65 ont donné une valeur normale (˂1,20) dans les deux machines et 6 sujets des résultats discordants (normal avec CA-600® et pathologique avec le STA-COMPACT®).
o Chez les patients sous AVK, les valeurs des INR sont presque confondues avec une différence non significative (p=0,62) (Tableau X)
 Pour le Ratio du TCA
o Chez les sujets sains, les variations observées avec les deux machines allaient dans les deux sens avec un écart statistiquement significatif (p=0,007) (Tableau X). Mais également tous les échantillons testés ont donné des valeurs de ratio normales dans les deux machines sauf 3 échantillons.
o Chez les patients sous AVK, la valeur des ratios était souvent plus élevée avec le CA-600® avec une différence peu significative (p=0,051)
o Pour la Fibrinémie, aussi bien chez les sujets sains que chez les patients sous AVK, le STA COMPACT® donne des valeurs plus élevées avec une différence statistiquement significative (p˂0,0001) (Tableau X).

Table des matières

INTRODUCTION
PREMIERE PARTIE : RAPPEL SUR LA PHYSIOLOGIE ET L’EXPLORATION DE LA COAGULATION
1. Physiologie de la coagulation
1.1. Les acteurs de la coagulation
1.2. Le déroulement du processus de la coagulation
1.2.1. La conception classique du phénomène de coagulation
1.2.2. La conception réelle de la coagulation in vivo
1.3. La régulation de la coagulation
2. Exploration de la coagulation
2.1. Etape pré-analytique
2.1.1. Prélèvement
2.1.2. Transport
2.1.3. Centrifugation
2.1.4. Conservation
2.1.5. Interférences
2.2. Méthodes de coagulation
2.3. Les tests d’exploration de la coagulation
2.3.1. Le temps Quick ou Taux de Prothrombine
2.3.2. Le temps de Céphaline + activateur
2.3.3. Le dosage du fibrinogène par méthode chronométrique.
DEUXIEME PARTIE
1. Méthodologie
1.1. Type et cadre de l’étude
1.2. Echantillonnage
1.3. Recueil des échantillons
1.4. Matériel et réactifs
1.5. Paramètres étudiés
1.6. Analyses statistiques
2. Résultats
2.1. Caractéristiques de la population d’étude
2.2. Résultats obtenus avec les deux machines
2.3. Comparaison STA COMPAT® et ® CA-600®
3. Discussion
CONCLUSION
REFERENCES

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