La compétence ovocytaire au développement

La compétence ovocytaire au développement

Le cumulus oophorus

Dans le follicule antral, les cellules du cumulus se distinguent des cellules de la granulosa non seulement d’un point de vue anatomique, mais aussi du point de vue de leurs fonctions auprès de l’ovocyte. En effet, les CG assument un rôle préférentiellement endocrine – FSH, LH, stéroïdogenèse – alors que les CC assurent plutôt les fonctions « nourricières » – métabolites, énergie, réserves (Diaz et al. 2007).
Le cumulus oophorus ou complexe ovocyte-cumulus (COC) qui apparaît avec la formation de l’antrum au sein du follicule tertiaire, est une structure tridimensionnelle très spécialisée, dynamique et où la communication réciproque – ou bidirectionnelle – est essentielle.
L’ablation des CC, la rupture de leurs communications avec l’ovocyte, la perturbation de leur métabolisme ou bien de leurs activités transcriptionnelle ou traductionnelle ont démontré le rôle crucial des CC auprès de l’ovocyte. Ainsi les CC interviennent tant dans la maturation finale de l’ovocyte que dans sa capacité à assurer les premières divisions embryonnaires – ou compétence ovocytaire au développement, et ce dans plusieurs espèces (Sirard and First 1988; Isobe and Terada 2001; Modina et al. 2001; Matzuk et al. 2002; Sutton et al. 2003b).
Quant à l’ovocyte, il permet le maintien de l’organisation et de l’intégrité du follicule antral et régule les fonctions somatiques. Ainsi, l’ovocyte assure par exemple la survie des CC en empêchant leur apoptose (Hussein et al. 2005).

Différenciation des cellules du cumulus, rôle de l’ovocyte

Cellules murales de la granulosa et cellules du cumulus sont toutes deux issues des cellules de la granulosa pré-antrale, de se fait elles partagent certaines potentialités d’expression génique. Cependant, lors du développement du follicule antral, l’ovocyte induit leur différenciation spécifique en CC et CGM. Ainsi, les CC et les CGM accompagnant un ovocyte mature pourraient différentiellement exprimer jusqu’à un peu plus de 3150 gènes (Burnik Papler et al. 2015).La différenciation CC/CGM nécessite que l’ovocyte sécrète des facteurs spécifiques appelés OSF (oocyte-secreted factors) ou ODPF (oocyte-derived paracrine factors) dont la majeure partie appartient à la superfamille des protéines TGF-β (transforming growth factor–β) (Erickson and Shimasaki 2000). La gonadotropine FSH reste toutefois nécessaire à la différenciation CC/CGM et au développement du follicule antral comme le démontrent les expériences avec des souris knockout pour la FSH (Kumar et al. 1997), ou bien son récepteur (Dierich et al. 1998), dont les follicules ne parviennent pas à se développer au-delà du stade antral précoce.
Parmi les OSF, GDF9 (growth and differentiation factor 9) intervient très tôt dans la folliculogenèse puisqu’en son absence – souris knockout pour GDF9 – la transition de follicule primaire à secondaire n’a pas lieu (Dong et al. 1996). Il en va de même avec BMP15 (bone morphogenetic protein 15) chez les brebis ayant une mutation homozygote pour ce gène (Galloway et al. 2000). Chez le bovin, l’immunisation active contre GDF9 et/ou BMP15 entraîne également un développement folliculaire anormal, compromettant alors la fertilité (Juengel et al. 2009). Plus spécifiquement vis-à-vis du cumulus, chez la souris, l’absence de BMP15 entrave sa différenciation (Su et al. 2004; Yoshino et al. 2006). Outre son rôle de différenciateur, l’ovocyte assure aussi la survie des CC notamment via les OSF que sont BMP15 et BMP6, la promotion de Bcl-2 (protéine anti-apoptotique) et la suppression Bax (proapoptotique), ce qui permet de prévenir l’apoptose des CC chez le bovin (Hussein et al. 2005).Au sein du follicule antral, le gradient d’efficacité des OSF s’oppose à celui des gonadotropines : les OSF étant plus efficaces à proximité de l’ovocyte, ils ont donc plus d’impact sur les CC que sur les CGM ; tandis que les gonadotropines exercent plus fortement leur influence sur la thèque et les CGM que sur les CC (revue par (Gilchrist et al. 2008). Si bien que, par exemple, un gradient d’expression du transcrit du R-LH est observé chez la souris, où plus les cellules sont éloignées de l’ovocyte, plus le transcrit du R-LH est exprimé et, à l’inverse, dans les cellules les plus proches de l’ovocyte, cette expression est totalement supprimée (Eppig et al. 2002). L’absence caractéristique de R-LH au sein du cumulus est effectivement due à la suppression de son expression par l’ovocyte au stade de GV (Eppig et al. 1997). Ainsi, alors que cumulus et granulosa murale expriment tous deux le récepteur à la FSH (Richards and Midgley 1976), seule la granulosa murale exprime significativement le R-LH. Ceci sert d’ailleurs de marqueur de la différenciation des CGM (Lei et al. 2001).
Également, les CC affichent une stéroïdogenèse nettement moins active que les CGM, particulièrement concernant la production de progestérone (Li et al. 2000). En effet, l’ovocyte empêche la lutéinisation des CC en inhibant notamment l’expression de l’enzyme stéroïdogène P450 side chain cleavage codée par CYP11A1 (Diaz et al. 2007), ainsi que l’expression du récepteur à la LH (Eppig et al. 1997). Aussi, l’ovocyte, incapable d’utiliser directement le glucose comme source d’énergie (Rieger and Loskutoff 1994), stimule l’activité glycolytique du cumulus (Sutton-McDowall et al. 2010) ou encore le transport d’acides aminés (Eppig et al. 2005).

Communications bidirectionnelles

Outre les communications de nature paracrine abordées précédemment, l’ovocyte et les cellules du cumulus entretiennent une communication plus directe par le transfert de molécules.En effet, la communication entre l’ovocyte et les CC via les jonctions communicantes (JC) – ou gap junctions – permet le transfert de molécules hydrophiles de poids moléculaire inférieur à 1 kDa, telles que des ions, des nucléotides, des acides aminés ou encore des glucides simples (Winterhager and Kidder 2015). La communication par le biais de ces jonctions au sein du COC a d’ailleurs été largement démontrée pour des molécules de petit poids moléculaire (Moor et al. 1980; Racowsky and Satterlie 1985; Schultz 1985; Webb et al. 2002; Thomas et al. 2004; Li et al. 2012). Les JC sont présentes entre les CC d’une part, mais aussi entre les CC de la corona radiata et l’ovocyte d’autre part. En raison de la présence de la zone pellucide entourant l’ovocyte, les jonctions entre les CC et l’ovocyte se font à l’extrémité des projections transzonales (PTZ) émises par la corona radiata (Anderson and Albertini 1976). Une JC est formée de deux connexons, un pour chaque cellule en interaction, eux-mêmes constitués de six connexines. Les principales connexines retrouvées dans le COC sont les Cx37 et Cx43 (Nuttinck et al. 2000).
Par ailleurs, les Cx43 semblent autoriser le passage de siRNA (small interfering RNA, 24 oligonucléotides maximum) (Valiunas et al. 2005). Le liquide folliculaire, lui, contient des microARN (miRNA, 20-24 oligonucléotides) qui sont fréquemment retrouvés dans les exosomes, et ces derniers peuvent être récupérés par les CG (Sohel et al. 2013) et les CC (Hung et al. 2015). De plus, chez l’humain, les miRNA exprimés par la corona radiata sont associés au métabolisme des acides aminés et à la glycolyse, et diffèrent de ceux exprimés par les CC plus éloignées de l’ovocyte (Tong et al. 2014). En outre, chez le bovin, ovocyte et CC semblent avoir une influence réciproque sur leurs populations de miRNA (Abd El Naby et al. 2013). Des transferts de miRNA entre les cellules du follicule via les JC sont ainsi imaginables.Un autre type d’ARN, les longs ARN non-codants (lncRNA), a été relié au potentiel développemental dans les COC humains (Yerushalmi et al. 2014; Li et al. 2015). Des lncRNA, dont trois associés à la qualité embryonnaire, ont également été retrouvés dans les PTZ de cumulus bovins (Caballero et al. 2014). Le transfert de mRNA et de lncRNA depuis les CC vers l’ovocyte a d’ailleurs été montré chez le bovin, ainsi qu’une structure de type synapse, avec la présence de vésicules à l’extrémité des projections transzonales (Figure 1-3 (Macaulay et al. 2014). Le déplacement de transcrits a également été suivi dans les PTZ jusqu’à l’ovocyte avec une accumulation progressive d’ARN dans ces PTZ suggérant un transfert possible, et ce avant la reprise de méiose puisque les PTZ se rétractent au cours de la maturation ovocytaire (Macaulay et al. 2016). Ce transfert pourrait ainsi participer à l’accumulation d’ARNm par l’ovocyte en vue des premiers clivages et de l’activation du génome embryonnaire.

Table des matières

RESUME
ABSTRACT
LISTE DES TABLES
LISTE DES FIGURES
LISTE DES ABREVIATIONS ET DES SIGLES
REMERCIEMENTS
AVANT-PROPOS
1. INTRODUCTION
1.1. Le follicule ovarien
1.1.1. Ovogenèse
1.1.2. Folliculogenèse
1.1.3. Ovulation
1.2. Le cumulus oophorus
1.2.1. Différenciation des cellules du cumulus, rôle de l’ovocyte
1.2.2. Communications bidirectionnelles
1.2.3. Métabolisme : missions du cumulus
1.2.4. Réponse du COC au pic préovulatoire de LH
1.2.5. Cumulus post-ovulatoire .
1.3. La compétence ovocytaire au développement
1.3.1. Définition
1.3.2. Évaluation de la compétence ovocytaire
1.3.3. Mesure de la compétence ovocytaire
1.3.4. Optimisation de la stimulation ovarienne
1.4. Hypothèse et objectifs
2. CUMULUS CELL GENE EXPRESSION ASSOCIATED WITH PRE-OVULATORY ACQUISITION OF DEVELOPMENTAL COMPETENCE IN BOVINE OOCYTES
2.1. Résumé
2.2. Abstract
2.3. Introduction
2.4. Results
2.4.1. COC morphology
2.4.2. Genes inventory
2.4.3. Hierarchical cluster analysis
2.4.4. Variation of gene expression across time
2.4.5. Ingenuity Pathway Analysis (IPA)
2.4.6. qRT-PCR results
2.5. Discussion
2.6. Conclusion
2.7. Materials and methods
2.7.1. Ovarian stimulation treatment, in vitro production and cumulus–oocyte complex (COC) recovery from super-stimulated animals
2.7.2. Cumulus cell retrieval
2.7.3. RNA extraction
2.7.4. RNA processing for microarray analysis
2.7.5. Microarray data normalization and statistical analysis
2.7.6. RNA processing for qRT-PCR and statistical analysis
2.7.7. Statistical analysis of COC morphology
2.8. References
2.9. Tables
2.10. Figures
3. THE EFFECTS OF BASAL LH INHIBITION WITH CETRORELIX ON CUMULUS CELL GENE EXPRESSION DURING THE LUTEAL PHASE UNDER OVARIAN COASTING STIMULATION IN CATTLE.
3.1. Résumé
3.2. Abstract
3.3. Introduction
3.4. Results
3.4.1. COC Morphology
3.4.2. Genes Inventory and Clustering
3.4.3. IPA analysis
3.4.4. qRT-PCR results
3.5. Discussion
3.6. Conclusion
3.7. Materials and methods
3.7.1. Ovarian stimulation treatment, in vitro production, and recovery of cumulus-oocyte complexes (COC) from super-ovulated animals
3.7.2. Cumulus cell retrieval
3.7.3. RNA extraction
3.7.4. RNA processing for microarray analysis
3.7.5. Microarray data normalization and statistical analysis
3.7.6. RNA processing for qRT-PCR and statistical analysis
3.7.7. Statistical Analysis of COC Morphology
3.8. References
3.9. Tables
3.10. Figures
4. ANALYSIS OF LHCGR AND SELECTED STEROID ENZYME MRNA EXPRESSION IN BOVINE CUMULUS CELLS DURING IN VITRO MATURATION
4.1. Résumé
4.2. Abstract
4.3. Introduction
4.4. Results
4.4.1. LHCGR and MVK mRNA expression during in vitro maturation
4.4.2. Steroidogenic enzyme and progesterone receptor mRNA expression during in vitro maturation
4.5. Discussion
4.6. Conclusion
4.7. Materials and methods
4.7.1. Cumulus-Oocyte Complex in vitro maturation and retrieval
4.7.2. RNA processing and quantification
4.8. References
4.9. Tables
4.10. Figures
5. INDIVIDUAL BOVINE
I N V I T R O EMBRYO PRODUCTION AND CUMULUS CELL TRANSCRIPTOMIC ANALYSIS TO DISTINGUISH CUMULUS-OOCYTE COMPLEXES WITH HIGH OR LOW DEVELOPMENTAL POTENTIAL .
5.1. Résumé
5.2. Abstract
5.3. Introduction
5.4. Results
5.4.1. In vitro embryo production and quality assessment
5.4.2. Gene inventory
5.4.3. Ingenuity Pathway Analysis
5.4.4. Quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction results
5.5. Discussion
5.6. Conclusion
5.7. Materials and methods
5.7.1. In vitro culture and CC recovery
5.7.2. Analysis of RNA
5.8. Acknowledgments
5.9. References
5.10. Tables
5.11. Figures
6. CONCLUSION ET DISCUSSION GENERALES
BIBLIOGRAPHIE .

Télécharger le rapport complet